CN102732477A

CN102732477A - 人脂肪干细胞无血清基础培养基

Info

Publication number: CN102732477A
Application number: CN2012101973606A
Authority: CN
Inventors: 焦阳
Original assignee: JIANGSU RE-STEM BIOTECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: JIANGSU RE-STEM BIOTECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2012-06-15
Filing date: 2012-06-15
Publication date: 2012-10-17
Anticipated expiration: 2032-06-15
Also published as: CN102732477B

Abstract

本申请公开了一种人脂肪干细胞无血清基础培养基。本培养基使用血清替代剂，由高糖型DMEM基础培养基、人血清白蛋白、转铁蛋白、牛磺酸、还原型谷胱甘肽、铜蓝蛋白、L-抗坏血酸-2-硫酸酯、α-生育酚琥珀酸单酯、亚油酸、α-酮戊二酸和硒组成。无血清基础培养基因能免除常规含血清培养基中动物血清给人体健康带来的潜在威胁，其培养的脂肪干细胞更适于临床应用。

Description

人脂肪干细胞无血清基础培养基

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种干细胞无血清基础培养基。

背景技术

人脂肪干细胞即人体脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）是目前广泛应用于组织工程及再生医学领域的一种成体干细胞，与骨髓间充质干细胞一样具有多向分化潜能。ADSCs呈成纤维细胞样生长，胞浆和核仁丰富，呈平行或漩涡样排列。细胞周期分析显示G0/G1期的细胞占69%，S期占24%，G2/M期占8%。在胎牛血清的存在条件下传代培养2-3天细胞增殖1倍。多次传代(10-20代)后,细胞增殖速度无明显减慢，在传代6次后细胞群体中出现衰老细胞，第15代细胞群体中衰老细胞约占15%。ADSCs具有与骨髓间充质干细胞基本相同的细胞免疫表型，经流式细胞仪分析CD9,CD10,CD13,CD29,CD44,CD49d,CD49e,CD54,CD55,CD59,CD90,CD105,CD117,CD146,CD166,STRO-1均为阳性,而CD31,CD34,CD45均为阴性。最大的区别是ADSCs表达CD49d,不表达CD106,而正好相反,BMSCs表达CD106,不表达CD49d。

目前常用的ADSCs培养是利用饲养层细胞与采用含10%胎牛血清的培养基进行培养。这种培养干细胞方法的缺点是方法复杂，提取的干细胞数量少，纯度不高，继代增殖缓慢，更要紧的是使用饲养层细胞和动物血清容易导致干细胞污染，特别是动物血清内潜在动物源性内毒素或病毒将对人体健康构成极大地风险，这样培养出的干细胞不适于直接应用于临床。

发明内容

本发明的目的是提供一种人脂肪干细胞无血清基础培养基，克服使用血清制备细胞培养基的缺点和风险。

在细胞培养中使用血清的缺点有很多例如血清成分复杂，虽含许多对细胞有利成分，也含有对细胞有害的成分，使血清有如下几个明显的缺点：

对大多数细胞，在体内状态，血清不是它们接触的生理学液体，只是在损伤愈合以及血液凝固过程中才接触血清，因此使用血清有可能改变某种细胞在体内的正常状态；

血清含一些对细胞产生毒性的物质，如多胺氧化酶，能与来自高度繁殖细胞的多胺反应（如精胺、亚精胺）形成有细胞毒性作用的聚精胺。补体、抗体、细菌毒素等都会影响细胞生长，甚至造成细胞死亡；

动物个体不同，血清产地、批号不同，每批质量差异甚大，其成分不能保持一致；

取材中可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响，可能导致实验失败或实验结果不可靠性；

血清的使用使得实验和生产的标准化困难，其中的蛋白质使得某些转基因蛋白生物药品生产中分离纯化工作很难完成；

大规模生产中，血清来源越来越困难，价格昂贵，是构成动物细胞培养生产成本的主要部分之一。

一种人脂肪干细胞无血清基础培养基使用血清替代剂，由高糖型DMEM基础培养基、人血清白蛋白、转铁蛋白、牛磺酸、还原型谷胱甘肽、铜蓝蛋白、L-抗坏血酸-2-硫酸酯、α-生育酚琥珀酸单酯、亚油酸、α-酮戊二酸和硒组成。人血清白蛋白优选浓度为0.25~2.0mg/mL、转铁蛋白优选浓度为1.25~10.0μg/mL、牛磺酸优选浓度为0.25~3.0μg/mL、还原型谷胱甘肽优选浓度为2~15μg/mL、铜蓝蛋白优选浓度为0.1~0.35U/mL、L-抗坏血酸-2-硫酸酯优选浓度为10~150μg/mL、α-生育酚琥珀酸单酯优选浓度为10^-715×10^-7mol/L、亚油酸优选浓度为1.25~10.5μg/mL、α-酮戊二酸优选浓度为1×10^-5~2×10^-4mol/L和硒优选浓度为1.25~10.0ng/mL。人血清白蛋白最优浓度为1.25mg/mL，转铁蛋白最优浓度为6.25μg/mL，牛磺酸最优浓度为1.25μg/mL，还原型谷胱甘肽最优浓度为10μg/mL，铜蓝蛋白最优浓度为0.25U/mL，L-抗坏血酸-2-硫酸酯最优浓度为50μg/mL，α-生育酚琥珀酸单酯最优浓度为9×10^-7mol/L，亚油酸最优浓度为5.35μg/mL，α-酮戊二酸最优浓度为1×10^-4mol/L，硒最优浓度为6.25ng/mL。

其中各组分作用如表1：

表1：本发明使用的试剂及其作用

本发明提供人脂肪干细胞无血清基础培养基。该培养基由于含有高糖型DMEM细胞培养液，葡萄糖的浓度高达4500mg/L，使液体粘稠度增加可以具有保护幼稚干细胞在悬浮状态时免受震荡搅拌带来的机械性损伤，同时有利于细胞停泊于一个位置生长，使生长速度加快的效果。

该培养基提供结合蛋白、多肽类物质、维生素和微量元素参与细胞代谢，可以起到供应营养、中和、解毒的效果。

该培养基不含动物血清，不含动物血清内潜在动物源性内毒素或病毒，方便应用于临床。

附图说明

图1是本发明中选用无血清人脂肪干细胞基础培养基与常规含血清基础培养基培养人脂肪干细胞生长曲线图；

图2是本发明中选用最优选剂量无血清基础培养基培养的人脂肪干细胞形态；

图3是本发明中选用低剂量无血清基础培养基培养的人脂肪干细胞形态。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。实验所用器具仪器试剂皆可通过商业途径获得。

在制备无血清基础培养基时使用的试剂如下表2所示：

表2：本发明使用的成分、来源及浓度范围

实施例1：常规含血清基础培养基配制

1）制备预定量1000mL，取900mL高糖型DMEM细胞培养液（厂家：Sigma，货号：D-5030），加青霉素90000U，链霉素90000U。

2)调pH值：用5％NaHCO₃调节pH到7.2。

3)过滤除菌：采用0.45um和0.22um滤膜各一张，上层为0.45um，下层为0.22um，以保证过滤效果。

4)加小牛血清：临用前将加入小牛血清（生产厂家为TAKARA BIOINC.）至预定量1000mL。

实施例2：一种人脂肪干细胞无血清基础培养基A制备

2)调pH值：用质量分数5％NaHCO₃调节pH到7.2。

3）加入血清替代剂：将表2所列的所有10种试剂按照如下终浓度要求称量：

并依次加入到上述配制好的高糖型DMEM细胞培养液中，振荡或超声助溶，不加热助溶。

4）然后补加上述配制好的高糖型DMEM细胞培养液至预定的总溶液量1000mL。

实施例3：一种人脂肪干细胞无血清基础培养基B的制备

将表2所列的所有10种试剂改为按照如下终浓度要求称量：

预定量与具体的制备方法步骤如实施例2。

实施例4：一种人脂肪干细胞无血清基础培养基C的制备

将表2所列的所有10种试剂改为按照如下终浓度要求称量：

预定量与具体的制备方法步骤如实施例2。

实施例5：无血清培养基与常规有血清培养基培养与效果的比较

将1×10⁶个的脂肪干细胞分别接种到四组盛有不同的培养基的直径100mm培养皿中，每组10个培养皿，混匀；

加入培养基：

第一组10个培养皿，加入常规有血清培养基5mL；

第二组10个培养皿，加入无血清基础培养基A5mL；

第三组10个培养皿，加入无血清基础培养基B5mL；

第四组10个培养皿，加入无血清基础培养基C5mL。

将细胞放在在37℃，5％CO₂的培养箱中进行培养；置于倒置式显微镜观察，每隔3天用移液管吸去上层培养基，加入新的培养基，继续培养。

细胞计数：每天在各组中取一个培养皿放入洁净工作台，然后用移液管吸弃培养基。PBS洗涤2次，加入1ml 0.25%Trypsin-EDTA，倒置显微镜下发现贴壁细胞分离后，加入4ml含有10%FBS的基础培养基终止胰酶作用。

台盼蓝（Typan Blue）染色血细胞计数板计数活细胞数。

实验结果如图1所示，最优剂量的无血清基础培养基与常规有血清培养基同样有效地培养人脂肪干细胞。使用适宜剂量（C）和高剂量（B）无血清基础培养基和常规有血清培养基的细胞生长曲线完全相同，近似倒“S”形，在接种的前3d细胞处于滞留期，而后进入对数生长期，约在第6天达最高峰。之后细胞增长减速进入平台区，到第9天凋亡的细胞增多，细胞满盘率达到90%以上。使用低剂量无血清培养基（A）的人脂肪干细胞则较晚进入对数增长期，增长速率较慢，但仍然可以维持了一段时间细胞生长和增殖。

细胞形态学分析，初分离的细胞接种4h后开始贴壁，无论哪一组细胞在停滞期的细胞形态都呈小圆形，细胞核居中，可出现双核或多核。进入增长期后细胞出现伸展生长，细胞增长明显加快，呈纺锤形、多角形等改变，接着进入高峰期时可见贴壁细胞出现梭形及纤维细胞状形态。无血清基础培养基含高剂量血清替代剂组（B）和适宜剂量组（C）的细胞形态与常规有血清培养基培养的细胞形态完全相同（图2）。而含低剂量血清替代剂的无血清基础培养基（A）培养的细胞形态上呈现过早分化，凋亡细胞（图3）。虽然无血清培养基（A）培养的细胞在生长速率、数量上不如常规有血清培养基培养的细胞，但克服了使用血清带来的诸多问题。综合经济效益和有效性的角度，实际应用中选用适宜剂量（C）浓度的无血清基础培养基最为恰当。

表面抗原分析，取用无血清基础培养基培养的原代脂肪干细胞，去掉培养液，用1∶1的2.5%的胰蛋白酶溶液和0.02%EDTA溶液混合消化，用含1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS洗涤后制成每100ul含有1×10⁶个单细胞悬液，等分为7份，分别加入7个Eppendorf管中并编号，一号管加入共20μL的FITC Mouse IgG1、APC-CY7Mouse IgG2b和染色缓冲液用于检测由于抗体非特异性结合产生的背景作为对照，其他试管分别加入CD29、CD34、CD44、CD45、CD105、HLA.DR单克隆抗体各20μL，每管分别加入细胞悬液100μL(含1×10⁶个细胞)，室温孵育25min，用含1%BSA的PBS洗涤后，流式细胞仪检测。

分析结果：流式细胞仪分析原代人脂肪干细胞六种表面抗原CD29，CD34，CD44，CD45，CD105和HLA.DR，结果表明使用无血清培养基培养出的细胞具有人脂肪干细胞特性。HLA.DR阴性，排除该类细胞是成纤维细胞,流式细胞仪分析结果见表3。

表3

表面抗原

CD29

CD34

CD44

CD45

CD105

HLA.DR

流式表达

+

-

+

-

+

-

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明造构思的前提下，还可以做出若干改变和改进，这些都属于发明的保护范围。

Claims

1.一种人脂肪干细胞无血清基础培养基，其特征在于使用血清替代剂，由高糖型DMEM基础培养基、人血清白蛋白、转铁蛋白、牛磺酸、还原型谷胱甘肽、铜蓝蛋白、L-抗坏血酸-2-硫酸酯、α-生育酚琥珀酸单酯、亚油酸、α-酮戊二酸和硒组成。

2.根据权利要求1所述的人脂肪干细胞无血清基础培养基，其特征在于人血清白蛋白浓度为0.25~2.0mg/mL、转铁蛋白浓度为0.25~10.0μg/mL、牛磺酸浓度为0.25~3.0μg/mL、还原型谷胱甘肽浓度为2~15μg/mL、铜蓝蛋白浓度为0.1~0.35U/mL、L-抗坏血酸-2-硫酸酯浓度为10~150μg/mL、α-生育酚琥珀酸单酯浓度为10^-7~15×10^-7mol/L、亚油酸浓度为1.25~10.5μg/mL、α-酮戊二酸浓度为1×10^-5~2×10^-4mol/L硒浓度为1.25~10.0ng/m。

3.根据权利要求2所述的人脂肪干细胞无血清基础培养基，其特征在于：人血清白蛋白最优浓度为1.25mg/mL，转铁蛋白最优浓度为6.25μg/mL，牛磺酸最优浓度为1.25μg/mL，还原型谷胱甘肽最优浓度为10μg/mL，铜蓝蛋白最优浓度为0.25U/mL，L-抗坏血酸-2-硫酸酯最优浓度为50μg/mL，α-生育酚琥珀酸单酯最优浓度为9×10^-7mol/L，亚油酸最优浓度为5.35μg/mL，α-酮戊二酸最优浓度为1×10^-4mol/L，硒最优浓度为6.25ng/mL。

4.一种权利要求1所述人脂肪干细胞无血清基础培养基，其特征在于适用在人脂肪干细胞的培养。

5.根据权利要求3所述人脂肪干细胞无血清基础培养基，其特征在于使用所述人脂肪干细胞无血清基础培养的人脂肪干细胞适用于临床。