CN115305232B - 一种脂肪间充质干细胞复苏培养液及复苏方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脂肪间充质干细胞复苏培养液，包括基础培养基，与添加在基础培养基中的各组分：胰岛素、黄芪多糖、乙内酰脲、普利醇、荆芥内酯、L‑谷氨酰胺、维生素C。本发明提供的复苏培养液提高了脂肪间充质干细胞的复苏率和增殖活性。其中的乙内酰脲、普利醇对提高脂肪间充质干细胞的复苏率效果明显。荆芥内酯可以提高复苏后脂肪间充质干细胞的增殖活性。复苏液中的各组分协同作用，为脂肪间充质干细胞冻存后活细胞数量和活性提供保障。本发明还提供了一种脂肪间充质干细胞的复苏方法，采用本发明提供的复苏液，操作简便，经过短时间的复苏培养后，脂肪间充质干细胞具有良好的活性，可正常用于常规扩增或其他临床用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种培养液，尤其涉及一种脂肪间充质干细胞复苏培养液及复苏方法。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一群具有多能性的细胞，可从包括脂肪、骨髓、脐带在内的各种组织中分离得到。因为它们具有可塑性，这些细胞具有巨大的临床和基础研究的吸引力。脂肪间充质干细胞是间充质干细胞的一种，是从脂肪组织提取的一种成体干细胞，具有向软骨、骨、脂肪等多种组织分化的潜能。脂肪组织通过脂肪抽吸术或外科手术容易获取，对供者创伤较小且不涉及伦理问题。而且，脂肪间充质干细胞在人和动物体内相对分布广泛、易于分离，且可以在体外条件下大量扩增和培养，现已是医学和组织工程领域最受欢迎的干细胞之一。
脂肪间充质干细胞在体外经过连续传代培养和冻存复苏后仍具有多向分化潜能，因此在液氮环境下超低温冻存已成为长期保存脂肪间充质干细胞的手段。脂肪间充质干细胞的冻存需要将处于对数生长期的细胞收集起来，加入含有特定成分的细胞冻存保护液制成单细胞悬液，分装于冻存管中置于液氮中进行长期冻存。冻存后的脂肪间充质干细胞需要经过复苏后才能恢复活性，正常使用。复苏率的高低会影响细胞的数量，并且部分细胞经复苏后增殖活性下降，不能满足要求。有必要研究一种用于脂肪间充质干细胞复苏的培养液，提高细胞的复苏率和活性。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种脂肪间充质干细胞复苏培养液，解决了冻存后的脂肪间充质干细胞复苏率低，活性差的问题。
本发明的目的之二在于提供一种脂肪间充质干细胞的复苏方法。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种脂肪间充质干细胞复苏培养液，包括基础培养基，与添加在基础培养基中的各组分：胰岛素、黄芪多糖、乙内酰脲、普利醇、荆芥内酯、L-谷氨酰胺、维生素C。
优先地，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。
优先地，各组分在基础培养基中的终浓度为：胰岛素20-30μg/mL、黄芪多糖25-35μg/mL、乙内酰脲6.5-9.5ng/mL、普利醇10-15ng/mL、荆芥内酯3.5-5.5ng/mL、L-谷氨酰胺15-20ug/mL、维生素C10-20 ng/mL。
优先地，各组分在基础培养基中的终浓度为：胰岛素25μg/mL、黄芪多糖30μg/mL、乙内酰脲8.5ng/mL、普利醇12ng/mL、荆芥内酯4.5ng/mL、L-谷氨酰胺18ug/mL、维生素C15ng/mL。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
一种脂肪间充质干细胞的复苏方法，采用上述复苏培养液进行复苏。
优先地，所述脂肪间充质干细胞的复苏方法，包括以下步骤：
(1)向基础培养基中加入胰岛素、黄芪多糖、乙内酰脲、普利醇、荆芥内酯、L-谷氨酰胺、维生素C，混合均匀后过滤除菌得到复苏液，备用；
(2)取冻存的脂肪间充质干细胞在37-40℃条件下快速复苏，加入复苏液稀释后离心收集脂肪间充质干细胞；
(3)向步骤(2)的细胞中加入复苏液重悬，在37℃，5％CO2条件下复苏培养10-12h，即完成。
优先地，步骤(3)复苏液中脂肪间充质干细胞的浓度为5-8×104个/mL。
优先地，采用0.22μm的滤菌膜过滤除菌。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供一种脂肪间充质干细胞的复苏培养液，复苏液中添加了胰岛素、黄芪多糖、乙内酰脲、普利醇、荆芥内酯、L-谷氨酰胺、维生素C，提高了脂肪间充质干细胞的复苏率和增殖活性。其中的乙内酰脲、普利醇对提高脂肪间充质干细胞的复苏率效果明显。荆芥内酯可以提高复苏后脂肪间充质干细胞的增殖活性。复苏液中的各组分协同作用，为脂肪间充质干细胞冻存后活细胞数量和活性提供保障。
本发明还提供了一种脂肪间充质干细胞的复苏方法，采用本发明提供的复苏液，操作简便，经过短时间的复苏培养后，脂肪间充质干细胞具有良好的活性，可正常用于常规扩增或其他临床用途。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例1
一种脂肪间充质干细胞复苏培养液，由DMEM/F12培养基，和添加在培养基中的以下各组分组成：胰岛素、黄芪多糖、乙内酰脲、普利醇、荆芥内酯、L-谷氨酰胺、维生素C；各组分在培养基中的终浓度为：胰岛素25μg/mL、黄芪多糖30μg/mL、乙内酰脲8.5ng/mL、普利醇12ng/mL、荆芥内酯4.5ng/mL、L-谷氨酰胺18ug/mL、维生素C15 ng/mL。
一种脂肪间充质干细胞的复苏方法，包括以下步骤：
(1)向DMEM/F12培养基中加入胰岛素、黄芪多糖、乙内酰脲、普利醇、荆芥内酯、L-谷氨酰胺、维生素C，混合均匀后用0.22μm的滤菌膜过滤除菌，得到复苏液，备用；
(2)将在液氮中冻存2个月传代培养得到处于对数生长期的P2代脂肪间充质干细胞的冻存管在37℃的水浴锅中快速复苏，加入复苏液稀释后离心收集脂肪间充质干细胞；
(3)向步骤(2)的细胞中加入复苏液重悬接种在T25培养瓶中，细胞的浓度为6×104个/mL，在37℃，5％CO2条件下复苏培养10h，即完成。
实施例2
一种脂肪间充质干细胞复苏培养液，由DMEM/F12培养基，和添加在培养基中的以下各组分组成：胰岛素、黄芪多糖、乙内酰脲、普利醇、荆芥内酯、L-谷氨酰胺、维生素C；各组分在培养基中的终浓度为：胰岛素20μg/mL、黄芪多糖25μg/mL、乙内酰脲6.5ng/mL、普利醇10ng/mL、荆芥内酯3.5ng/mL、L-谷氨酰胺15ug/mL、维生素C10 ng/mL。
一种脂肪间充质干细胞的复苏方法，包括以下步骤：
(1)向DMEM/F12培养基中加入胰岛素、黄芪多糖、乙内酰脲、普利醇、荆芥内酯、L-谷氨酰胺、维生素C，混合均匀后用0.22μm的滤菌膜过滤除菌，得到复苏液，备用；
(2)将在液氮中冻存3个月传代培养得到处于对数生长期的P3代脂肪间充质干细胞的冻存管在38℃条件下快速复苏，加入复苏液稀释后离心收集脂肪间充质干细胞；
(3)向步骤(2)的细胞中加入复苏液重悬接种在T25培养瓶中，细胞的浓度为5×104个/mL，在37℃，5％CO2条件下复苏培养11h，即完成。
实施例3
一种脂肪间充质干细胞复苏培养液，由DMEM/F12培养基，和添加在培养基中的以下各组分组成：胰岛素、黄芪多糖、乙内酰脲、普利醇、荆芥内酯、L-谷氨酰胺、维生素C；各组分在培养基中的终浓度为：胰岛素30μg/mL、黄芪多糖35μg/mL、乙内酰脲9.5ng/mL、普利醇15ng/mL、荆芥内酯5.5ng/mL、L-谷氨酰胺20ug/mL、维生素C 20ng/mL。
一种脂肪间充质干细胞的复苏方法，包括以下步骤：
(1)向DMEM/F12培养基中加入胰岛素、黄芪多糖、乙内酰脲、普利醇、荆芥内酯、L-谷氨酰胺、维生素C，混合均匀后用0.22μm的滤菌膜过滤除菌，得到复苏液，备用；
(2)将在液氮中冻存6个月处于对数生长期传代培养得到的P5代脂肪间充质干细胞的冻存管在40℃条件下快速复苏，加入复苏液稀释后离心收集脂肪间充质干细胞；
(3)向步骤(2)的细胞中加入复苏液重悬接种在T25培养瓶中，细胞的浓度为8×104个/mL，在37℃，5％CO2条件下复苏培养12h，即完成。
对比例1
对比例1提供一种脂肪间充质干细胞复苏培养液，和实施例1的区别为：省去乙内酰脲、普利醇、荆芥内酯，其余均和实施例1相同。
对比例2
对比例2提供一种脂肪间充质干细胞复苏培养液，和实施例1的区别为：省去乙内酰脲，其余均和实施例1相同。
对比例3
对比例3提供一种脂肪间充质干细胞复苏培养液，和实施例1的区别为：省去普利醇，其余均和实施例1相同。
对比例4
对比例4提供一种脂肪间充质干细胞复苏培养液，和实施例1的区别为：省去乙内酰脲，将普利醇的用量调整为20.5ng/mL，其余均和实施例1相同。
对比例5
对比例5提供一种脂肪间充质干细胞复苏培养液，和实施例1的区别为：省去普利醇，将乙内酰脲的用量调整为20.5ng/mL，其余均和实施例1相同。
对比例6
对比例6提供一种脂肪间充质干细胞复苏培养液，和实施例1的区别为：省去荆芥内酯，其余均和实施例1相同。
统计实施例1至3，对比例1至6中脂肪间充质干细胞的复苏率，复苏率＝复苏后活细胞的总数/冻存前活细胞总数×100％。细胞数量总计方法如下：取50μL细胞培养液和等体积的0.4％台盼蓝混合均匀后统计活细胞的数量。结果如表1所示。
表1
| 组别 | 复苏率(％) |
| 实施例1 | 88.45 |
| 实施例2 | 87.22 |
| 实施例3 | 86.67 |
| 对比例1 | 70.06 |
| 对比例2 | 77.49 |
| 对比例3 | 74.81 |
| 对比例4 | 75.16 |
| 对比例5 | 73.02 |
| 对比例6 | 85.49 |
由表1可以看出实施例1至3中脂肪间充质干细胞的复苏率均在85％以上，高于对比例1至6。在对比例1至6中调整了复苏培养液的成分，细胞的复苏率均有不同程度的下降。其中对比例1中省去乙内酰脲、普利醇、荆芥内酯，细胞复苏率仅为70.06％。对比例2和对比例3中分别省去了乙内酰脲、普利醇，对比例4和对比例5中在省去乙内酰脲、普利醇中的一种后增加了剩余成分的用量，但是复苏率仍不及实施例1。说明复苏液中的乙内酰脲、普利醇有助于提高冻存后脂肪间充质干细胞的复苏率。对比例6中省去了荆芥内酯，细胞复苏率高于对比例1至5，和实施例1相差不大，说明荆芥内酯对细胞复苏率的影响较小。
分别取实施例1，对比例1至6中复苏后的细胞，离心去除复苏培养液，加入含10％FBS的DMEM/F12培养基中重悬，调整细胞密度为1×104个/mL，将未经保存的P2代脂肪间充质干细胞作为对比例7，分别接种在24孔板中，每组3孔，每孔加细胞悬液1mL，培养72h，取样用0.4％台盼蓝染色后进行细胞计数，统计得到的活细胞数量，每组均取3孔的平均值，结果如表2所示。
表2
| 组别 | 细胞数量(×104个) |
| 实施例1 | 7.02 |
| 对比例1 | 4.14 |
| 对比例2 | 4.89 |
| 对比例3 | 5.24 |
| 对比例4 | 4.73 |
| 对比例5 | 4.98 |
| 对比例6 | 4.22 |
| 对比例7 | 7.11 |
由表2可以看出实施例1和对比例7中的脂肪间充质干细胞增殖能力较好，优于对比例1至6中的细胞。对比例1至6中调整了复苏培养液的组成，由此可知调整复苏培养液的组成后，复苏得到的细胞增殖能力下降。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (6)
1.一种脂肪间充质干细胞复苏培养液，其特征在于，包括基础培养基，与添加在基础培养基中的各组分：胰岛素、黄芪多糖、乙内酰脲、普利醇、荆芥内酯、L-谷氨酰胺、维生素C；所述基础培养基为DMEM/F12培养基；各组分在基础培养基中的终浓度为：胰岛素20-30μg/mL、黄芪多糖25-35μg/mL、乙内酰脲6.5-9.5ng/mL、普利醇10-15ng/mL、荆芥内酯3.5-5.5ng/mL、L-谷氨酰胺15-20ug/mL、维生素C10-20 ng/mL。
2.根据权利要求1所述脂肪间充质干细胞复苏培养液，其特征在于，各组分在基础培养基中的终浓度为：胰岛素25μg/mL、黄芪多糖30μg/mL、乙内酰脲8.5ng/mL、普利醇12ng/mL、荆芥内酯4.5ng/mL、L-谷氨酰胺18ug/mL、维生素C15 ng/mL。
3.一种脂肪间充质干细胞的复苏方法，其特征在于，采用权利要求1至2任一项所述复苏培养液进行复苏。
4.根据权利要求3所述脂肪间充质干细胞的复苏方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)向基础培养基中加入胰岛素、黄芪多糖、乙内酰脲、普利醇、荆芥内酯、L-谷氨酰胺、维生素C，混合均匀后过滤除菌得到复苏液，备用；
(2)取冻存的脂肪间充质干细胞在37-40℃条件下快速复苏，加入复苏液稀释后离心收集脂肪间充质干细胞；
(3)向步骤(2)的细胞中加入复苏液重悬，在37℃，5％CO2条件下复苏培养10-12h，即完成。
5.根据权利要求4所述脂肪间充质干细胞的复苏方法，其特征在于，步骤(3)经复苏培养10-12h后获得的细胞培养液中脂肪间充质干细胞的浓度为5-8×104个/mL。
6.根据权利要求4所述脂肪间充质干细胞的复苏方法，其特征在于，采用0.22μm的滤菌膜过滤除菌。
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| CN105219707A (zh) * | 2015-11-17 | 2016-01-06 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种复苏脂肪间充质干细胞的方法 |
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| 中药甘松化学成分与药理作用的研究进展;南笑珂;张鲁;罗琳;于冰莉;张莉;于继平;侯俊玲;王文全;;中国现代中药(第10期);全文 * |
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