CN115305232B - 一种脂肪间充质干细胞复苏培养液及复苏方法 - Google Patents
一种脂肪间充质干细胞复苏培养液及复苏方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115305232B CN115305232B CN202210162040.0A CN202210162040A CN115305232B CN 115305232 B CN115305232 B CN 115305232B CN 202210162040 A CN202210162040 A CN 202210162040A CN 115305232 B CN115305232 B CN 115305232B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- adipose
- mesenchymal stem
- derived mesenchymal
- stem cells
- resuscitating
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 66
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 38
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 30
- WJRBRSLFGCUECM-UHFFFAOYSA-N hydantoin Chemical compound O=C1CNC(=O)N1 WJRBRSLFGCUECM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 29
- 229940091173 hydantoin Drugs 0.000 claims abstract description 29
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims abstract description 28
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims abstract description 27
- ZDKZHVNKFOXMND-UHFFFAOYSA-N cis-Nepetalactone Natural products O=C1OC=C(C)C2C1C(C)CC2 ZDKZHVNKFOXMND-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 26
- ZDKZHVNKFOXMND-NBEYISGCSA-N cis-trans-nepetalactone Chemical compound O=C1OC=C(C)[C@@H]2[C@H]1[C@@H](C)CC2 ZDKZHVNKFOXMND-NBEYISGCSA-N 0.000 claims abstract description 26
- 241001061264 Astragalus Species 0.000 claims abstract description 19
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims abstract description 19
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims abstract description 19
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 claims abstract description 19
- 235000006533 astragalus Nutrition 0.000 claims abstract description 19
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims abstract description 19
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims abstract description 19
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 19
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims abstract description 19
- 210000004233 talus Anatomy 0.000 claims abstract description 19
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 18
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 15
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 claims abstract description 14
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 claims abstract description 14
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 13
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 9
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 claims description 9
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 7
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 5
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 5
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 5
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 5
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 claims description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 14
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 40
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 11
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 11
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 238000007443 liposuction Methods 0.000 description 1
- -1 polycosanol Chemical compound 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/38—Vitamins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/33—Insulin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/90—Polysaccharides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种脂肪间充质干细胞复苏培养液，包括基础培养基，与添加在基础培养基中的各组分：胰岛素、黄芪多糖、乙内酰脲、普利醇、荆芥内酯、L‑谷氨酰胺、维生素C。本发明提供的复苏培养液提高了脂肪间充质干细胞的复苏率和增殖活性。其中的乙内酰脲、普利醇对提高脂肪间充质干细胞的复苏率效果明显。荆芥内酯可以提高复苏后脂肪间充质干细胞的增殖活性。复苏液中的各组分协同作用，为脂肪间充质干细胞冻存后活细胞数量和活性提供保障。本发明还提供了一种脂肪间充质干细胞的复苏方法，采用本发明提供的复苏液，操作简便，经过短时间的复苏培养后，脂肪间充质干细胞具有良好的活性，可正常用于常规扩增或其他临床用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种培养液，尤其涉及一种脂肪间充质干细胞复苏培养液及复苏方法。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一群具有多能性的细胞，可从包括脂肪、骨髓、脐带在内的各种组织中分离得到。因为它们具有可塑性，这些细胞具有巨大的临床和基础研究的吸引力。脂肪间充质干细胞是间充质干细胞的一种，是从脂肪组织提取的一种成体干细胞，具有向软骨、骨、脂肪等多种组织分化的潜能。脂肪组织通过脂肪抽吸术或外科手术容易获取，对供者创伤较小且不涉及伦理问题。而且，脂肪间充质干细胞在人和动物体内相对分布广泛、易于分离，且可以在体外条件下大量扩增和培养，现已是医学和组织工程领域最受欢迎的干细胞之一。
脂肪间充质干细胞在体外经过连续传代培养和冻存复苏后仍具有多向分化潜能，因此在液氮环境下超低温冻存已成为长期保存脂肪间充质干细胞的手段。脂肪间充质干细胞的冻存需要将处于对数生长期的细胞收集起来，加入含有特定成分的细胞冻存保护液制成单细胞悬液，分装于冻存管中置于液氮中进行长期冻存。冻存后的脂肪间充质干细胞需要经过复苏后才能恢复活性，正常使用。复苏率的高低会影响细胞的数量，并且部分细胞经复苏后增殖活性下降，不能满足要求。有必要研究一种用于脂肪间充质干细胞复苏的培养液，提高细胞的复苏率和活性。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种脂肪间充质干细胞复苏培养液，解决了冻存后的脂肪间充质干细胞复苏率低，活性差的问题。
本发明的目的之二在于提供一种脂肪间充质干细胞的复苏方法。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种脂肪间充质干细胞复苏培养液，包括基础培养基，与添加在基础培养基中的各组分：胰岛素、黄芪多糖、乙内酰脲、普利醇、荆芥内酯、L-谷氨酰胺、维生素C。
优先地，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。
优先地，各组分在基础培养基中的终浓度为：胰岛素20-30μg/mL、黄芪多糖25-35μg/mL、乙内酰脲6.5-9.5ng/mL、普利醇10-15ng/mL、荆芥内酯3.5-5.5ng/mL、L-谷氨酰胺15-20ug/mL、维生素C10-20 ng/mL。
优先地，各组分在基础培养基中的终浓度为：胰岛素25μg/mL、黄芪多糖30μg/mL、乙内酰脲8.5ng/mL、普利醇12ng/mL、荆芥内酯4.5ng/mL、L-谷氨酰胺18ug/mL、维生素C15ng/mL。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
一种脂肪间充质干细胞的复苏方法，采用上述复苏培养液进行复苏。
优先地，所述脂肪间充质干细胞的复苏方法，包括以下步骤：
(1)向基础培养基中加入胰岛素、黄芪多糖、乙内酰脲、普利醇、荆芥内酯、L-谷氨酰胺、维生素C，混合均匀后过滤除菌得到复苏液，备用；
(2)取冻存的脂肪间充质干细胞在37-40℃条件下快速复苏，加入复苏液稀释后离心收集脂肪间充质干细胞；
(3)向步骤(2)的细胞中加入复苏液重悬，在37℃，5％CO2条件下复苏培养10-12h，即完成。
优先地，步骤(3)复苏液中脂肪间充质干细胞的浓度为5-8×104个/mL。
优先地，采用0.22μm的滤菌膜过滤除菌。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供一种脂肪间充质干细胞的复苏培养液，复苏液中添加了胰岛素、黄芪多糖、乙内酰脲、普利醇、荆芥内酯、L-谷氨酰胺、维生素C，提高了脂肪间充质干细胞的复苏率和增殖活性。其中的乙内酰脲、普利醇对提高脂肪间充质干细胞的复苏率效果明显。荆芥内酯可以提高复苏后脂肪间充质干细胞的增殖活性。复苏液中的各组分协同作用，为脂肪间充质干细胞冻存后活细胞数量和活性提供保障。
本发明还提供了一种脂肪间充质干细胞的复苏方法，采用本发明提供的复苏液，操作简便，经过短时间的复苏培养后，脂肪间充质干细胞具有良好的活性，可正常用于常规扩增或其他临床用途。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例1
一种脂肪间充质干细胞复苏培养液，由DMEM/F12培养基，和添加在培养基中的以下各组分组成：胰岛素、黄芪多糖、乙内酰脲、普利醇、荆芥内酯、L-谷氨酰胺、维生素C；各组分在培养基中的终浓度为：胰岛素25μg/mL、黄芪多糖30μg/mL、乙内酰脲8.5ng/mL、普利醇12ng/mL、荆芥内酯4.5ng/mL、L-谷氨酰胺18ug/mL、维生素C15 ng/mL。
一种脂肪间充质干细胞的复苏方法，包括以下步骤：
(1)向DMEM/F12培养基中加入胰岛素、黄芪多糖、乙内酰脲、普利醇、荆芥内酯、L-谷氨酰胺、维生素C，混合均匀后用0.22μm的滤菌膜过滤除菌，得到复苏液，备用；
(2)将在液氮中冻存2个月传代培养得到处于对数生长期的P2代脂肪间充质干细胞的冻存管在37℃的水浴锅中快速复苏，加入复苏液稀释后离心收集脂肪间充质干细胞；
(3)向步骤(2)的细胞中加入复苏液重悬接种在T25培养瓶中，细胞的浓度为6×104个/mL，在37℃，5％CO2条件下复苏培养10h，即完成。
实施例2
一种脂肪间充质干细胞复苏培养液，由DMEM/F12培养基，和添加在培养基中的以下各组分组成：胰岛素、黄芪多糖、乙内酰脲、普利醇、荆芥内酯、L-谷氨酰胺、维生素C；各组分在培养基中的终浓度为：胰岛素20μg/mL、黄芪多糖25μg/mL、乙内酰脲6.5ng/mL、普利醇10ng/mL、荆芥内酯3.5ng/mL、L-谷氨酰胺15ug/mL、维生素C10 ng/mL。
一种脂肪间充质干细胞的复苏方法，包括以下步骤：
(1)向DMEM/F12培养基中加入胰岛素、黄芪多糖、乙内酰脲、普利醇、荆芥内酯、L-谷氨酰胺、维生素C，混合均匀后用0.22μm的滤菌膜过滤除菌，得到复苏液，备用；
(2)将在液氮中冻存3个月传代培养得到处于对数生长期的P3代脂肪间充质干细胞的冻存管在38℃条件下快速复苏，加入复苏液稀释后离心收集脂肪间充质干细胞；
(3)向步骤(2)的细胞中加入复苏液重悬接种在T25培养瓶中，细胞的浓度为5×104个/mL，在37℃，5％CO2条件下复苏培养11h，即完成。
实施例3
一种脂肪间充质干细胞复苏培养液，由DMEM/F12培养基，和添加在培养基中的以下各组分组成：胰岛素、黄芪多糖、乙内酰脲、普利醇、荆芥内酯、L-谷氨酰胺、维生素C；各组分在培养基中的终浓度为：胰岛素30μg/mL、黄芪多糖35μg/mL、乙内酰脲9.5ng/mL、普利醇15ng/mL、荆芥内酯5.5ng/mL、L-谷氨酰胺20ug/mL、维生素C 20ng/mL。
一种脂肪间充质干细胞的复苏方法，包括以下步骤：
(1)向DMEM/F12培养基中加入胰岛素、黄芪多糖、乙内酰脲、普利醇、荆芥内酯、L-谷氨酰胺、维生素C，混合均匀后用0.22μm的滤菌膜过滤除菌，得到复苏液，备用；
(2)将在液氮中冻存6个月处于对数生长期传代培养得到的P5代脂肪间充质干细胞的冻存管在40℃条件下快速复苏，加入复苏液稀释后离心收集脂肪间充质干细胞；
(3)向步骤(2)的细胞中加入复苏液重悬接种在T25培养瓶中，细胞的浓度为8×104个/mL，在37℃，5％CO2条件下复苏培养12h，即完成。
对比例1
对比例1提供一种脂肪间充质干细胞复苏培养液，和实施例1的区别为：省去乙内酰脲、普利醇、荆芥内酯，其余均和实施例1相同。
对比例2
对比例2提供一种脂肪间充质干细胞复苏培养液，和实施例1的区别为：省去乙内酰脲，其余均和实施例1相同。
对比例3
对比例3提供一种脂肪间充质干细胞复苏培养液，和实施例1的区别为：省去普利醇，其余均和实施例1相同。
对比例4
对比例4提供一种脂肪间充质干细胞复苏培养液，和实施例1的区别为：省去乙内酰脲，将普利醇的用量调整为20.5ng/mL，其余均和实施例1相同。
对比例5
对比例5提供一种脂肪间充质干细胞复苏培养液，和实施例1的区别为：省去普利醇，将乙内酰脲的用量调整为20.5ng/mL，其余均和实施例1相同。
对比例6
对比例6提供一种脂肪间充质干细胞复苏培养液，和实施例1的区别为：省去荆芥内酯，其余均和实施例1相同。
统计实施例1至3，对比例1至6中脂肪间充质干细胞的复苏率，复苏率＝复苏后活细胞的总数/冻存前活细胞总数×100％。细胞数量总计方法如下：取50μL细胞培养液和等体积的0.4％台盼蓝混合均匀后统计活细胞的数量。结果如表1所示。
表1
| 组别 | 复苏率(％) |
| 实施例1 | 88.45 |
| 实施例2 | 87.22 |
| 实施例3 | 86.67 |
| 对比例1 | 70.06 |
| 对比例2 | 77.49 |
| 对比例3 | 74.81 |
| 对比例4 | 75.16 |
| 对比例5 | 73.02 |
| 对比例6 | 85.49 |
由表1可以看出实施例1至3中脂肪间充质干细胞的复苏率均在85％以上，高于对比例1至6。在对比例1至6中调整了复苏培养液的成分，细胞的复苏率均有不同程度的下降。其中对比例1中省去乙内酰脲、普利醇、荆芥内酯，细胞复苏率仅为70.06％。对比例2和对比例3中分别省去了乙内酰脲、普利醇，对比例4和对比例5中在省去乙内酰脲、普利醇中的一种后增加了剩余成分的用量，但是复苏率仍不及实施例1。说明复苏液中的乙内酰脲、普利醇有助于提高冻存后脂肪间充质干细胞的复苏率。对比例6中省去了荆芥内酯，细胞复苏率高于对比例1至5，和实施例1相差不大，说明荆芥内酯对细胞复苏率的影响较小。
分别取实施例1，对比例1至6中复苏后的细胞，离心去除复苏培养液，加入含10％FBS的DMEM/F12培养基中重悬，调整细胞密度为1×104个/mL，将未经保存的P2代脂肪间充质干细胞作为对比例7，分别接种在24孔板中，每组3孔，每孔加细胞悬液1mL，培养72h，取样用0.4％台盼蓝染色后进行细胞计数，统计得到的活细胞数量，每组均取3孔的平均值，结果如表2所示。
表2
| 组别 | 细胞数量(×104个) |
| 实施例1 | 7.02 |
| 对比例1 | 4.14 |
| 对比例2 | 4.89 |
| 对比例3 | 5.24 |
| 对比例4 | 4.73 |
| 对比例5 | 4.98 |
| 对比例6 | 4.22 |
| 对比例7 | 7.11 |
由表2可以看出实施例1和对比例7中的脂肪间充质干细胞增殖能力较好，优于对比例1至6中的细胞。对比例1至6中调整了复苏培养液的组成，由此可知调整复苏培养液的组成后，复苏得到的细胞增殖能力下降。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (6)
1.一种脂肪间充质干细胞复苏培养液，其特征在于，包括基础培养基，与添加在基础培养基中的各组分：胰岛素、黄芪多糖、乙内酰脲、普利醇、荆芥内酯、L-谷氨酰胺、维生素C；所述基础培养基为DMEM/F12培养基；各组分在基础培养基中的终浓度为：胰岛素20-30μg/mL、黄芪多糖25-35μg/mL、乙内酰脲6.5-9.5ng/mL、普利醇10-15ng/mL、荆芥内酯3.5-5.5ng/mL、L-谷氨酰胺15-20ug/mL、维生素C10-20 ng/mL。
2.根据权利要求1所述脂肪间充质干细胞复苏培养液，其特征在于，各组分在基础培养基中的终浓度为：胰岛素25μg/mL、黄芪多糖30μg/mL、乙内酰脲8.5ng/mL、普利醇12ng/mL、荆芥内酯4.5ng/mL、L-谷氨酰胺18ug/mL、维生素C15 ng/mL。
3.一种脂肪间充质干细胞的复苏方法，其特征在于，采用权利要求1至2任一项所述复苏培养液进行复苏。
4.根据权利要求3所述脂肪间充质干细胞的复苏方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)向基础培养基中加入胰岛素、黄芪多糖、乙内酰脲、普利醇、荆芥内酯、L-谷氨酰胺、维生素C，混合均匀后过滤除菌得到复苏液，备用；
(2)取冻存的脂肪间充质干细胞在37-40℃条件下快速复苏，加入复苏液稀释后离心收集脂肪间充质干细胞；
(3)向步骤(2)的细胞中加入复苏液重悬，在37℃，5％CO2条件下复苏培养10-12h，即完成。
5.根据权利要求4所述脂肪间充质干细胞的复苏方法，其特征在于，步骤(3)经复苏培养10-12h后获得的细胞培养液中脂肪间充质干细胞的浓度为5-8×104个/mL。
6.根据权利要求4所述脂肪间充质干细胞的复苏方法，其特征在于，采用0.22μm的滤菌膜过滤除菌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210162040.0A CN115305232B (zh) | 2022-02-22 | 2022-02-22 | 一种脂肪间充质干细胞复苏培养液及复苏方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210162040.0A CN115305232B (zh) | 2022-02-22 | 2022-02-22 | 一种脂肪间充质干细胞复苏培养液及复苏方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115305232A CN115305232A (zh) | 2022-11-08 |
| CN115305232B true CN115305232B (zh) | 2024-02-20 |
Family
ID=83855699
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210162040.0A Active CN115305232B (zh) | 2022-02-22 | 2022-02-22 | 一种脂肪间充质干细胞复苏培养液及复苏方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115305232B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118006545A (zh) * | 2023-04-26 | 2024-05-10 | 零下十八度(北京)生物科技有限公司 | 一种具有细胞激活因子的冰活体干细胞 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105219707A (zh) * | 2015-11-17 | 2016-01-06 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种复苏脂肪间充质干细胞的方法 |
| CN112195151A (zh) * | 2020-10-28 | 2021-01-08 | 夏爽 | 一种牙髓间充质干细胞复苏培养液、制备方法及复苏培养方法 |
-
2022
- 2022-02-22 CN CN202210162040.0A patent/CN115305232B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105219707A (zh) * | 2015-11-17 | 2016-01-06 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种复苏脂肪间充质干细胞的方法 |
| CN112195151A (zh) * | 2020-10-28 | 2021-01-08 | 夏爽 | 一种牙髓间充质干细胞复苏培养液、制备方法及复苏培养方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 中药甘松化学成分与药理作用的研究进展;南笑珂;张鲁;罗琳;于冰莉;张莉;于继平;侯俊玲;王文全;;中国现代中药(第10期);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115305232A (zh) | 2022-11-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113151165B (zh) | 一种人脐带间充质干细胞扩增用培养基及培养方法 | |
| CN110938590B (zh) | 一种间充质干细胞无血清培养基及其用途 | |
| CN113564111A (zh) | 一种低氧培养脐带来源间充质干细胞的方法 | |
| CN115305232B (zh) | 一种脂肪间充质干细胞复苏培养液及复苏方法 | |
| CN113943701A (zh) | 一种可扩增间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法 | |
| CN113736729A (zh) | 组合物及含有其的干细胞无血清培养基及干细胞培养方法 | |
| CN106566803A (zh) | 一种培养液及其应用和培养脐带间充质干细胞的方法 | |
| CN113287603B (zh) | 一种生物样本保存液及其制备方法与应用 | |
| CN112195151B (zh) | 一种牙髓间充质干细胞复苏培养液、制备方法及复苏培养方法 | |
| CN107384864B (zh) | 将脐带间充质干细胞诱导成神经干细胞的细胞培养液及其使用方法 | |
| CN106978395B (zh) | 一种高效分离培养脐带间充质干细胞的方法 | |
| CN111748522A (zh) | 一种干细胞培养基及其应用 | |
| CN116640727A (zh) | 一种提高细胞活力的营养液及其制备方法、应用 | |
| CN115067318B (zh) | 一种牙髓间充质干细胞保存液及其应用 | |
| CN112877286B (zh) | 一种干细胞体外诱导方法 | |
| CN113201491B (zh) | 一种促进干细胞体外增殖和分化的培养方法 | |
| CN112075418B (zh) | 脂肪间充质干细胞冻存液以及脂肪间充质干细胞冻存方法 | |
| JP2011211956A (ja) | 幹細胞の未分化維持剤及び増殖促進剤 | |
| JP5710138B2 (ja) | 幹細胞の未分化維持剤及び増殖促進剤 | |
| CN113943702A (zh) | 一种羊膜间充质干细胞扩增用培养基及其制备方法 | |
| CN114045258A (zh) | 间充质干细胞培养用无血清培养基及用途 | |
| CN114807028B (zh) | 一种无血清间充质干细胞培养基及干细胞培养方法 | |
| CN116875542B (zh) | 一种间充质干细胞培养增强剂及其应用 | |
| CN110951687B (zh) | 一种扩增胎盘源造血干细胞的方法 | |
| CN114752560B (zh) | 一种脐带间充质干细胞培养基 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20240124 Address after: 250002 No. 602, unit 1, building 1, No. 7, Jida Road, Shizhong District, Jinan City, Shandong Province Applicant after: Wang Taihua Country or region after: China Address before: No. 33, Fangyi Road, Central District, Economic and Technological Development Zone, Binhai New Area, Tianjin 300457 Applicant before: Xu Yingkui Country or region before: China |
|
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |