CN114807028B - 一种无血清间充质干细胞培养基及干细胞培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种无血清间充质干细胞培养基。所述的无血清培养基是在DMEM/F12培养基的基础上添加了重组人胰岛素、重组人转铁蛋白、NEAA、维生素溶液、异甜菊醇钠、rh‑bFGF、rhEGF、L‑谷氨酰胺、亚硒酸钠和多聚赖氨酸。通过添加少量的异甜菊醇钠、L‑谷氨酰胺、多聚赖氨酸，可显著提高脐带间充质干细胞的贴壁性能和增殖速率，解决了现有技术存在细胞贴壁性差、细胞增殖速率不够理想的问题。并且使用本发明的无血清培养基能有效保证脐带间充质干细胞生物学特性保持不变。本发明的无血清培养基成分明确，溶解性能好，可以提高实验的重复性、准确性和稳定性，原料易获取，有效降低无血清培养基的制备成本。

Description

一种无血清间充质干细胞培养基及干细胞培养方法
技术领域
本发明涉及干细胞培养技术领域，具体涉及一种无血清间充质干细胞培养基及干细胞培养方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是骨髓中除造血干细胞以外的另一种成体干细胞，广泛分布于动物体内的骨髓、肝脏和脂肪等多种组织中。MSCs是一种具有强大的自我更新能力和多向分化潜能的细胞，同时MSCs还是一种重要的免疫调节细胞。MSCs在炎症细胞因子刺激后对免疫系统表现出很强的抑制作用，可以减少体内的免疫排斥，延长移植物的存活时间。因此，间充质干细胞在组织工程中的化骨、软骨，心肌构建的种子细胞和在造血干细胞、器官移植中具有广泛的应用前景。
在生物医学工程领域的研究中，大量种子细胞的获取往往需要通过干细胞的体外培养和收获来实现。传统的含动物血清的干细胞培养基给干细胞的生产与科研带来多种不利因素，存在以下缺点：批间差异较大，来源不稳定，需要大量验证工作，价格昂贵，成分不明确，不利于疫苗和单克隆抗体等目的产品的分离纯化，容易被病毒和支原体感染等。
与传统的含动物血清的培养基相比较,无血清培养基是不含有动物血清或其他生物提取液，但仍可以维持细胞在体外较长时间生长、繁殖的一种培养基。无血清培养基由于其组成成份相对清楚，制备过程简单，在现代生物技术学领域得到广泛应用。但是无血清培养基没有广泛的适应性，同类型的细胞、甚至不同的细胞系或细胞株都可能有各自的无血清培养基，对无血清培养基的适应往往是不同的。因此很多研究都集中在各种无血清培养基的配方改进上，以更好促进细胞生长、增殖或提高目的产物的表达。如公开号为CN105112362A、CN 106635978 A、CN 111621476 A等中国专利申请通过添加厚朴酚、二氢杨梅素、儿茶素、二苯乙烯苷、白藜芦醇等物质，以期望改善干细胞的贴壁效果，提高干细胞的增殖率，然而以上这些物质在基础培养基中的溶解性较差，其效果有待考证。虽然目前已有一些市售干细胞无血清培养基，但是现有市售无血清培养基存在细胞贴壁性差、细胞增殖速率不够理想、价格昂贵等缺陷。因此，提供一种成分较简单、组分确定、细胞贴壁性良好，细胞增殖速率高的无血清培养基以提高间充质干细胞的体外培养的效率具有重要意义。
发明内容
为解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种无血清间充质干细胞培养基及干细胞培养方法，能够实现体外脐带间充质干细胞的高效培养，细胞贴壁性和形态良好，细胞增殖速率高，培养成本低，易于工艺化生产。
本发明的第一个目的是提供一种无血清间充质干细胞培养基，包括DMEM混合培养基，还包括以下组分及其浓度：10～20mg/L重组人胰岛素、4～6mg/L重组人转铁蛋白、0.5～1.5％v/v NEAA、0.5～1.5％v/v维生素溶液、4～6mg/L异甜菊醇钠、10～30μg/L rh-bFGF、10～30μg/L rhEGF、20～30mM L-谷氨酰胺、0.5～1μg/L亚硒酸钠和10～30μg/L多聚赖氨酸。
优选的，所述的无血清间充质干细胞培养基，包括DMEM混合培养基，还包括以下组分及其浓度：15mg/L重组人胰岛素、5mg/L重组人转铁蛋白、1％v/v NEAA、1％v/v维生素溶液、5mg/L异甜菊醇钠、20μg/L rh-bFGF、20μg/L rhEGF、25mM L-谷氨酰胺、0.8μg/L亚硒酸钠和20μg/L多聚赖氨酸。
优选的，所述的DMEM混合培养基为DMEM/F12培养基。
优选的，所述的DMEM/F12培养基为DMEM培养基和F12培养基按1:1体积比混合。
本发明的第二个目的是提供一种制备上述的无血清间充质干细胞培养基的方法，包括以下步骤：将重组人胰岛素、重组人转铁蛋白、NEAA、维生素溶液、异甜菊醇钠、rh-bFGF、rhEGF、L-谷氨酰胺、亚硒酸钠和多聚赖氨酸溶于DMEM混合培养基，搅拌混匀，过滤除菌，得到无血清间充质干细胞培养基。
本发明的第三个目的是提供所述的无血清间充质干细胞培养基在脐带间充质干细胞培养中的用途。
本发明的第四个目的是提供一种脐带间充质干细胞的培养方法，该方法是利用上述的无血清间充质干细胞培养基对脐带间充质干细胞进行培养。
优选的，所述的脐带间充质干细胞的接种密度是(0.1～10)×104个/mL。
优选的，所述的脐带间充质干细胞是在5％CO2、37℃的条件下培养。
异甜菊醇是由甜菊糖苷水解得到的一种具有贝壳烷骨架的四环二萜化合物，异甜菊醇钠是它的钠盐，具有水溶性。现有研究表明异甜菊醇具有广泛的药理活性，在降低血压、抗肿瘤、抗心肌缺血复灌损伤等方面具有重要功效，未见将异甜菊醇钠用于干细胞培养的报道。L-谷氨酰胺是细胞的能量来源，参与蛋白质的合成和核酸代谢，可促进细胞增殖。本发明人研究发现，培养基中单独添加L-谷氨酰胺，促进细胞增殖的效果不显著，但是与异甜菊醇钠合用后，可以显著提高细胞的增殖效果，两者产生了协同的作用。多聚赖氨酸可帮助细胞黏附，促进细胞贴壁，但是单独使用多聚赖氨酸促进细胞黏附能力有限，有相关报道表明单独使用多聚赖氨酸是不能支持细胞的长期附着(Rüegg UT et al.,1984)，本发明人研究发现，异甜菊醇钠的加入可以显著改善多聚赖氨酸的促进细胞黏附能力，异甜菊醇钠和多聚赖氨酸的共同添加起到了协同促进细胞贴壁的效果。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
(1)本发明提供了一种无血清间充质干细胞培养基，通过添加少量的异甜菊醇钠、L-谷氨酰胺、多聚赖氨酸，可显著提高脐带间充质干细胞的贴壁性能和增殖速率，解决了现有技术存在细胞贴壁性差、细胞增殖速率不够理想的问题。并且使用本发明的无血清培养基能有效保证脐带间充质干细胞生物学特性保持不变。
(2)本发明的无血清培养基成分明确，溶解性能好，可以提高实验的重复性、准确性和稳定性，原料易获取，有效降低无血清培养基的制备成本。
附图说明
图1是人脐带间充质干细胞在不同培养基中的增殖曲线。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
本发明中所用的重组人胰岛素、重组人转铁蛋白、L-谷氨酰胺、亚硒酸钠、多聚赖氨酸购自Sigma公司；NEAA(非必需氨基酸溶液)、维生素溶液购自Gibco公司；异甜菊醇钠购自东莞凯法生物医药有限公司；rh-bFGF、rhEGF购自PeproTech公司。甜菊醇-19-葡萄糖苷购自上海源叶生物科技有限公司。
实施例1、无血清培养基的配制
无血清培养基的配方组成见表1所示：
表1.无血清培养基的配方组成
Figure BDA0003677612860000051
组1-组6无血清培养基的配制方法，包括以下步骤：将重组人胰岛素、重组人转铁蛋白、NEAA、维生素溶液、异甜菊醇钠、rh-bFGF、rhEGF、L-谷氨酰胺、亚硒酸钠和多聚赖氨酸溶于DMEM/F12混合培养基，搅拌混匀，过滤除菌，得到无血清间充质干细胞培养基。
组7无血清培养基的配制方法，包括以下步骤：将重组人胰岛素、重组人转铁蛋白、NEAA、维生素溶液、rh-bFGF、rhEGF、L-谷氨酰胺、亚硒酸钠和多聚赖氨酸溶于DMEM混合培养基，然后加入预先用DMSO溶解好的甜菊醇-19-葡萄糖苷，搅拌混匀，过滤除菌，得到无血清间充质干细胞培养基。
实施例2、培养效果检测
(1)细胞贴壁性能检测：取未经包被的24孔板，设置组1-7和阳性对照组，组1-7分别加入组1-7的无血清培养基，阳性对照组加入含10％FBS的DMEM低糖培养基，每组3个复孔，每孔接种1×105个/mL个第3代人脐带间充质干细胞，放置于37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育2h，弃去培养基，使用PBS冲洗去除未贴壁细胞，然后进行消化并收集计数，结果如表2所示。
表2.各组的细胞贴壁性能检测结果
组别 细胞贴壁数量
组1 318.2±19.7
组2 330.6±24.2
组3 327.5±21.6
组4 225.4±18.8<sup>***</sup>
组5 219.2±20.5<sup>***</sup>
组6 52.3±9.7<sup>***</sup>
组7 232.6±21.5<sup>***</sup>
阳性对照组 302.2±16.9
注：与组2比较，***P＜0.001。
结果显示，本发明提供的无血清培养基能够显著提高人脐带间充质干细胞的贴壁细胞数量，比阳性对照组的细胞贴壁数多。由组4和组6可知，培养基不添加异甜菊醇钠，细胞贴壁性能减弱，而同时不添加异甜菊醇钠+多聚赖氨酸，细胞贴壁性能最差，表明异甜菊醇钠的加入可以显著改善多聚赖氨酸的促进细胞黏附能力，异甜菊醇钠和多聚赖氨酸的共同添加起到了协同促进细胞贴壁的效果。由组4和组5可知，培养基不添加异甜菊醇钠，其细胞贴壁性能与同时不添加异甜菊醇钠+L-谷氨酰胺的培养基相当，表明L-谷氨酰胺的缺失并不影响细胞贴壁性能。甜菊醇-19-葡萄糖苷是已知的可促进骨髓间充质干细胞体外增殖的物质，由组7可知，培养基添加甜菊醇-19-葡萄糖苷来取代异甜菊醇钠，其细胞贴壁数量与不添加异甜菊醇钠的组4培养基效果相当，表明甜菊醇-19-葡萄糖苷并不具有细胞贴壁效果，甜菊醇-19-葡萄糖苷与多聚赖氨酸合用并不能产生协同的促进细胞贴壁作用。
(2)细胞增殖性能检测
取第3代人脐带间充质干细胞以1×104个/mL的密度接种到6孔板中，设置组1-7和阳性对照组，每组6孔，组1-7分别加入组1-7的无血清培养基，阳性对照组加入含10％FBS的DMEM低糖培养基，置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养，每3天进行换液，在连续9天的培养过程中在倒置相差显微镜下观察记录细胞形态，且每天分别将培养的细胞用0.25％胰蛋白酶溶液消化，使用细胞计数板计数，计算其细胞密度，绘制细胞密度随培养时间的增殖变化曲线，结果如图1所示。由图1可知，本发明组1-3的培养基促进细胞增殖的效果显著优于组4-7的培养基，以及阳性对照组，其中以组2的培养基效果最佳。由组4和组5可知，培养基不添加异甜菊醇钠，细胞增殖活性减弱，而同时不添加异甜菊醇钠+L-谷氨酰胺，细胞增殖活性最差，表明异甜菊醇钠的加入可以显著改善L-谷氨酰胺的促进细胞增殖能力，异甜菊醇钠和L-谷氨酰胺的共同添加起到了协同促进细胞增殖的效果。由组4和组6可知，培养基不添加异甜菊醇钠，其细胞增殖活性与同时不添加异甜菊醇钠+多聚赖氨酸的培养基相当，表明多聚赖氨酸的缺失并不影响细胞增殖活性。由组7可知，培养基添加甜菊醇-19-葡萄糖苷来取代异甜菊醇钠，其细胞增殖活性优于阳性对照组，但弱于添加异甜菊醇钠的培养基，表明甜菊醇-19-葡萄糖苷与L-谷氨酰胺合用促进细胞增殖活性的效果不及异甜菊醇钠与L-谷氨酰胺合用的效果。
(3)细胞表面标志物检测
将第3代人脐带间充质干细胞以1×104个/cm2密度接种于10cm培养皿中，设置组1-7和阳性对照组，组1-7分别加入组1-7的无血清培养基，阳性对照组加入含10％FBS的DMEM低糖培养基，置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养3天，然后用0.25％胰蛋白酶溶液消化，收集各组的细胞，流式细胞仪检测其表面marker如CD105、CD73、CD90、CD34、CD45、HLA-DR等的表达情况。结果如表3所示。
表3.各组的细胞贴壁性能检测结果
Figure BDA0003677612860000081
检测结果表明，组1-3、组7，以及阳性对照组的人脐带间充质干细胞表面markerCD105、CD90、CD73阳性表达(表达率≥95％)，而CD34、CD45、HLA-DR阴性表达(表达率≤2％)，各组之间无显著性差异。组4-5的CD90、CD45表达率不符合标准，组6的CD90、CD73、CD45表达率不符合标准。结果表明采用本发明无血清培养基培养人脐带间充质干细胞不影响其标志物的表达。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种无血清间充质干细胞培养基，其特征在于，包括DMEM混合培养基，还包括以下组分及其浓度：10～20mg/L重组人胰岛素、4～6mg/L重组人转铁蛋白、0.5～1.5％v/v NEAA、0.5～1.5％v/v维生素溶液、4～6mg/L异甜菊醇钠、10～30μg/L rh-bFGF、10～30μg/LrhEGF、20～30mM L-谷氨酰胺、0.5～1μg/L亚硒酸钠和10～30μg/L多聚赖氨酸。
2.根据权利要求1所述的无血清间充质干细胞培养基，其特征在于，包括DMEM混合培养基，还包括以下组分及其浓度：15mg/L重组人胰岛素、5mg/L重组人转铁蛋白、1％v/v NEAA、1％v/v维生素溶液、5mg/L异甜菊醇钠、20μg/L rh-bFGF、20μg/L rhEGF、25mM L-谷氨酰胺、0.8μg/L亚硒酸钠和20μg/L多聚赖氨酸。
3.根据权利要求1或2所述的无血清间充质干细胞培养基，其特征在于，所述的DMEM混合培养基为DMEM/F12培养基。
4.根据权利要求3所述的无血清间充质干细胞培养基，其特征在于，所述的DMEM/F12培养基为DMEM培养基和F12培养基按1:1体积比混合。
5.一种权利要求1-4任一项所述的无血清间充质干细胞培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将重组人胰岛素、重组人转铁蛋白、NEAA、维生素溶液、异甜菊醇钠、rh-bFGF、rhEGF、L-谷氨酰胺、亚硒酸钠和多聚赖氨酸溶于DMEM混合培养基，搅拌混匀，过滤除菌，得到无血清间充质干细胞培养基。
6.权利要求1-4任一项所述的无血清间充质干细胞培养基在脐带间充质干细胞培养中的用途。
7.一种脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，是利用权利要求1-4任一项所述的无血清间充质干细胞培养基对脐带间充质干细胞进行培养。
8.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，所述的脐带间充质干细胞的接种密度是(0.1～10)×104个/mL。
9.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，所述的脐带间充质干细胞是在5％CO2、37℃的条件下培养。
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