JP2012044914A - 幹細胞の未分化維持剤及び増殖促進剤 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
【解決手段】 哺乳動物の胚性幹細胞、又は、骨髄、血液、脂肪組織、皮膚組織をはじめとする生体組織における体性幹細胞及び人工的に調製した幹細胞に対して、ブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる1種又は2種以上を含む化合物を用いることにより、幹細胞の未分化状態を維持したまま、幹細胞に対して特異的に増殖を促進し、さらに、該抽出物を含有させた培養液にて調製した幹細胞は、移植時における生体組織への生着率を向上させる効果がある。以上より、本発明は、再生医療や再生美容の分野において大きく貢献できるものである。
【選択図】 なし
Description
さらに、近年、骨髄以外にも、肝臓、膵臓、脂肪組織など、あらゆる臓器・組織に幹細胞が存在することが明らかにされ、各臓器・組織の再生および恒常性維持を司っていることがわかってきた(非特許文献2〜5参照)。このような各組織に存在する幹細胞は可塑性に優れており、今まで自己複製が不可能であった臓器や組織の根本的な再生にも利用できる可能性がある。また、近年では、胚性幹細胞(ES細胞)や遺伝子導入により人工的に作製された幹細胞(人工多能性幹細胞:iPS細胞)などの技術も進歩しており、様々な幹細胞が再生医療に活用できると期待されている(特許文献1〜2参照)。
(1)下記一般式(A)で示されるブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる1種又は2種以上を含む化合物を含有することを特徴とする、幹細胞の未分化維持剤。
(化1)一般式(A)
(式中、R1はH又はジカルボン酸エステル残基(その塩を含む)であり、R2は、カルボキシル基又はその塩である)
(2)一般式(A)で示されるブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる1種又は2種以上を含む化合物を含有することを特徴とする、幹細胞の増殖促進剤。
(3)一般式(A)で示されるブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる1種又は2種以上を含む化合物を含有する培地を用いて培養することを特徴とする、幹細胞の調製方法。
(4)(3)に記載の幹細胞の調製方法を用いて調製した幹細胞。
(5)一般式(A)で示されるブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる1種又は2種以上を含む化合物を含有することを特徴とする、幹細胞用途の培地。
ヘチマの子葉を4.5×10−6Mの2,4−ジクロロフェノキシ酢酸(2,4−D)及び2.3×10−6M のカイネチンを含むムラシゲとスクーグの寒天培地に置床し、常法によりカルスを誘導した。一ヶ月後、このカルスを同液体培地に入れて90rpmで回転振とう培養し、その懸濁培養細胞を調製した。この培養細胞を10−7Mの2,4−Dを含むムラシゲとスクーグの液体培地に接種し、暗所で2週間、回転振とう培養した。得られた培養細胞を凍結乾燥した後、エタノールにて抽出し、抽出液を濃縮乾固した。得られた抽出物をエタノールに再溶解させ、続いて再結晶させブリオノール酸の針状結晶を得た。ブリオノール酸含量は、細胞の乾燥重量に対して1.2%であった。
ブリオノール酸10g、無水コハク酸64gをピリジン550mLに溶解し、100℃にて8時間反応させた。放冷後、1N塩酸6.5L中に反応液を加え、3℃にて放置し、析出した結晶をろ別し、精製水にて洗浄した。
ろ別した固形分をジエチルエーテル3Lに溶解し、精製水にて洗浄後、ジエチルエーテルを留去し、乾燥して固形分13gを得た。 固形分13gをエタノール100mLに加熱溶解し再結晶することにより、白色固形分としてサクシニルブリオノール酸12gを得た。サクシニルブリオノール酸を一般式(C)に示す。
サクシニルブリオノール酸12gを脱水テトラヒドロフラン(THF)300mlに溶解し、1N水酸化カリウム水溶液45mLを添加した。追加でTHFを徐々に加えて沈殿が生成し始めたら約1時間熟成し、総液量1200mLまでTHFを加え、3℃、1日後、ろ別し、黄色固形分15gを得た。
黄色固形分15gを100mLエタノールに加熱溶解し、THFを徐々に加え白濁し始めたらろ過をし、ろ液を3℃で1日放置した。固形分をろ別し、エタノール100mLに加熱溶解し、3℃、1日後、ろ過乾燥し、白色〜微黄色固形分のサクシニルブリオノール酸二カリウム11gを得た。サクシニルブリオノール酸二カリウムを一般式(D)に示す。
Dulbecco’s Modified Eagle Medium培養液(Gibco社製)に、ウシ胎児血清(FBS、15%、Sigma社製)、ヌクレオシド液(100倍希釈、大日本製薬社製)、非必須アミノ酸液(100倍希釈、大日本製薬社製)、β2−メルカプトエタノール液(100倍希釈、大日本製薬社製)、L−グルタミン液(100倍希釈、大日本製薬社製)、ペニシリン(100unit/mL、Sigma社製)とストレプトマイシン(100μg/mL、Sigma社製)を加えて調製した培地を用いて、マウス胚性幹細胞(マウスES細胞:コスモバイオ社製)を、6cmディッシュに1×105個播種し、各試料(製造例1〜3)を最終濃度が0.001%になるように添加し、3日間培養を続けた。次に細胞をPBS(−)にて3回洗浄した後、ラバーポリスマンにて集め、血球計数板にて細胞数をカウントした後、CelLytic(Sigma社製)にてタンパク質を抽出し、未分化状態の測定を豊岡らの報告に従って行った(文献:豊岡やよい,Molecular Medicine臨時増刊号 再生医学,2003,106−115)。すなわち、幹細胞の未分化状態を示しているオクタマーバインディングプロテイン3/4タンパク質(Oct3/4タンパク質)の発現量を指標に、培養開始時に播種した幹細胞(1×105個)が発現していたOct3/4タンパク質の量を100%未分化状態とし、各試料(製造例1〜3)を添加して3日間培養した後のOct3/4タンパク質の量をウエスタンブロッティング法にて定量解析し、培養開始時と3日間培養後のOct3/4タンパク質の量を比較することで、未分化状態の維持効果について評価した。なお、これまでに幹細胞の未分化維持効果を示す物質として報告されている塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)(特表2010−500047号公報)を陽性対照として用いて同様な評価を行った。
生体組織は、大きく外胚葉、中胚葉、内胚葉の組織に分類され、これら組織を構成する細胞は、約200種類程度存在すると考えられていることから、その中でも代表として、外胚葉組織の細胞である角化細胞(DSファーマバイオメディカル社製)、中胚葉組織の細胞である線維芽細胞(DSファーマバイオメディカル社製)、内胚葉組織の細胞である肝臓細胞(HEPG2)とヒト体性幹細胞を用いて、これら細胞に対するブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる1種又は2種以上を含む化合物(製造例1〜3)の細胞特異的な増殖促進効果について評価を行った。すなわち、これら細胞の中で、ブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる1種又は2種以上を含む化合物(製造例1〜3)が特異的に幹細胞のみに対して増殖促進効果を示すかについて評価した。具体的には、これら細胞を、それぞれを6cmディッシュに1×106個播種し、ブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる1種又は2種以上を含む化合物(製造例1〜3)を最終濃度が0.001%になるように添加し、3日間培養を続けた。次に細胞をPBS(−)にて3回洗浄した後、それぞれの細胞をラバーポリスマンにて集め、細胞数をカウントした。
それぞれの細胞に対して化合物未添加時の総細胞数をコントロール(100%)とした場合の、ブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる1種又は2種以上を含む化合物(製造例1〜3)添加時のそれぞれの細胞数の増減(%)を算出し、各細胞に対する細胞増殖促進効果の評価を行った。なお、これまでに幹細胞の増殖促進効果を示す物質として報告されている塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)(特許文献7参照)を陽性対照として用いて同様な評価を行った。
ヒト体性幹細胞(DSファーマバイオメディカル社製)を6cmディッシュに1×106個播種し、ブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる1種又は2種以上を含む化合物(製造例1〜3)を最終濃度が0.01%になるように添加し、3日間培養を続けた。次に、それぞれの細胞をPBS(−)にて3回洗浄した後、無菌的にラバーポリスマンにて回収し、遠沈後、5%FBS添加ハンクス液(Hank’s balanced salt solution)に分散し、移植用の幹細胞として用いた。その後、以下の方法にて、皮膚移植を行い、生着率(%)について測定した。
実験例3で調製した幹細胞を、改めて1×106個サンプリングし、細胞の数を揃えた後、注射筒にてヌードマウスの皮下に移植し、移植後の生着率(%)を測定した。具体的な生着率(%)の測定法としては、移植用にサンプリングした1×106個の幹細胞を、予めCell Tracker(モレキュラープローブ社製)にて蛍光標識し、その時点の蛍光強度を測定し、移植細胞の総蛍光強度(100%)とした。この細胞を、注射筒を用いて、ヌードマウス(雄性、4週齢)の皮下に移植した。移植部位をマジックにてマーキングし、移植3日後、7日後に移植部位を摘出し、酵素処理により細胞を分散させ、得られた細胞の総蛍光強度を測定し、移植時の総蛍光強度(100%)と比較することで、生着率(%)を算出した。すなわち、生着した幹細胞が多いほど、最初に移植した蛍光強度と同等の蛍光が検出され、逆に、生着しなかった場合は、移植部位から蛍光が検出されないこととなる。
すなわち、本発明は、再生医療、再生美容における、幹細胞に対して特異的な未分化維持剤及び/又は増殖促進剤としての応用性と、かつ当該化合物を用いることで組織への生着率の高い幹細胞を調製することを可能にする技術である。
Claims (5)
- 一般式(A)で示されるブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる1種又は2種以上を含む化合物を含有することを特徴とする、幹細胞の増殖促進剤。
- 一般式(A)で示されるブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる1種又は2種以上を含む化合物を含有する培地を用いて培養することを特徴とする、幹細胞の調製方法。
- 請求項3記載の幹細胞の調製方法を用いて調製した幹細胞。
- 一般式(A)で示されるブリオノール酸又はその塩、ブリオノール酸ジカルボン酸エステル又はその塩から選ばれる1種又は2種以上を含む化合物を含有することを特徴とする、幹細胞用途の培地。
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