JP5184930B2 - 特定の方法で培養された幹細胞及びその製造方法 - Google Patents
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さらに、近年、骨髄以外にも、肝臓、膵臓、脂肪など、あらゆる臓器・組織に幹細胞が存在することが明らかにされ、各臓器・組織の再生および恒常性維持を司っていることがわかってきた(非特許文献2〜5参照)。また、各組織に存在する幹細胞は可塑性に優れており、今まで自己複製が不可能であった臓器や組織の再生にも利用できる可能性がある。
近年、これらの幹細胞の能力(多能性)を、臓器や組織の再生へ応用するため、細胞移植治療や組織工学(再生医療や再生美容)の分野において幹細胞を生体組織から分離した後に培養し増殖させる技術の開発が進められている(非特許文献6〜7)。
Pittenger M. F., et al., Science,1999,284,143−147 Goodell M. F., et al., Nat. Med., 1997,3,1337−1345 Zulewski H., et al., Diabetes, 2001,50,521−533 Suzuki A., et al., Hepatology, 2000,32,1230−1239 Zuk P. A., et al., Tissue Engineering, 2001,7,211−228 馬渕 洋ほか,日本再生医療学会誌,2007,6,263−268 北川 全ほか,日本再生医療学会誌,2008,7,14−18
さらに、未分化状態を維持して培養できたとしても、調製された幹細胞を移植した時の生体への生着率が低くても、その効果(臓器、組織の再生など)を発揮できない。
以上より、幹細胞を細胞移植治療や組織工学(再生医療や再生美容)に利用し臓器、組織の再生を望む場合、未分化状態を維持させたまま培養し、その調製された幹細胞の生体への生着率が高くなくてはならなない。
Smith A.G. et al., Dev.Biol,1987,121,1−9
(1)バラ科モモ属に属するモモ(学名はPrunus persica BatschまたはPrunus persica Batsch var. davidiana Maxim)の種子抽出物を含有する培地を用いて培養することを特徴とする幹細胞。
(2)バラ科モモ属に属するモモの種子抽出物を含有する培地を用いて培養することで未分化状態を維持させることを特徴とする幹細胞。
(3)幹細胞が哺乳動物由来であることを特徴とする前記(1)〜(2)に記載の幹細胞。
(4)バラ科モモ属に属するモモの種子抽出物を含有する培地を用いて培養することを特徴とする幹細胞の製造方法。
(5)バラ科モモ属に属するモモの種子抽出物を含有することを特徴とする未分化状態を維持させた幹細胞の増殖促進剤。
(6)バラ科モモ属に属するモモの種子抽出物を含有することを特徴とする幹細胞の未分化状態の維持方法。
(7)バラ科モモ属に属するモモの種子抽出物を含有することを特徴とする幹細胞の増殖促進方法。
桃仁100gをミキサーを用いて粉砕した後、精製水1Lを加え、95〜100℃で2時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥して桃仁の熱水抽出物4.9g得た。
桃仁100gをミキサーを用いて粉砕した後、50%(v/v)エタノール1Lを加え、常温で5日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、桃仁の50%エタノール抽出物を5.4g得た。
桃仁100gをミキサーを用いて粉砕した後、エタノール1Lにて常温で7日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、桃仁のエタノール抽出物を4.5g得た。
Dulbecco‘s Modifide Eagle Medium培養液(Gibco社製)に、ウシ胎児血清(FBS、15%、Sigma社製)、ヌクレオシド液(100倍希釈、大日本製薬社製)、非必須アミノ酸液(100倍希釈、大日本製薬社製)、β2−メルカプトエタノール液(100倍希釈、大日本製薬社製)、L−グルタミン液(100倍希釈、大日本製薬社製)、ペニシリン(100unit/mL、Sigma社製)とストレプトマイシン(100μg/mL、Sigma社製)を加えて調製した培地を用いて、マウス胚性幹細胞(マウスES細胞:コスモバイオ社製)を、6cmディッシュに1x105個播種し、各抽出物(製造例1〜3)を最終濃度が0.001%になるように添加し、3日間培養を続けた。次に細胞をPBS(−)にて3回洗浄した後、ラバーポリスマンにて集め、血球計数板にて細胞数をカウントした後、CelLytic(Sigma社製)にてタンパク質を抽出し、未分化状態の測定を豊岡らの報告に従って行った(文献:豊岡 やよい,Molecular Medicine臨時増刊号 再生医学,2003,106−115)。すなわち、幹細胞の未分化状態を示しているオクタマーバインディングプロテイン3/4タンパク質(Oct3/4タンパク質)の発現量を指標に、培養開始時に播種した幹細胞(1x105個)が発現していたOct3/4タンパク質の量を100%未分化状態とし、各各抽出物(製造例1〜6)を添加して3日間培養した後のOct3/4タンパク質の量をウエスタンブロッティング法にて定量解析し、培養開始時と3日間培養後のOct3/4タンパク質の量を比較することで、未分化状態の維持効果について評価した。
この評価の時に、培養開始時の単一細胞数(1x105個)に発現しているOct3/4タンパク質量を100%未分化状態とし、各抽出物添加時の未分化状態の(%未分化状態)を算出し、未分化状態維持効果の評価を行った。
ヒト幹細胞培養液(TOYOBO社製)を用いて培養したヒト体性幹細胞(DSファーマバイオメディカル社製)を6cmディッシュに1x106個播種し、桃仁の種子抽出物(製造例1〜3)を最終濃度が0.001%になるように添加し、3日間培養を続けた。次に細胞をPBS(−)にて3回洗浄した後、ラバーポリスマンにて集め、それぞれの細胞数をカウントした。
抽出物未添加時の総細胞数をコントロールとし、コントロールを100(%)とした場合の、桃仁の種子抽出物(製造例1〜3)添加時の細胞数の増減(%)を算出し、幹細胞の細胞増殖促進効果の評価を行った。
ヒト体性幹細胞(DSファーマバイオメディカル社製)を6cmディッシュに1x106個播種し、各抽出物(製造例1〜3)を最終濃度が0.01%になるように添加し、3日間培養を続けた。次に、それぞれの細胞をPBS(−)にて3回洗浄した後、無菌的にラバーポリスマンにて回収し、遠沈後、5%FBS添加ハンクス液(Hank‘s balanced salt solution)に分散し、移植用の幹細胞として用いた。その後、以下の方法にて、皮膚移植を行い、生着率(%)について測定した。
実験例3で調製した幹細胞を、改めて1x106個サンプリングし、数を揃えた後、注射筒にてヌードマウスの皮下に移植し、移植後の生着率(%)を測定した。具体的な生着率(%)の測定法としては、移植用にサンプリングした1x106個の幹細胞を、予めCell Tracker(モレキュラープローブ社製)にて蛍光標識し、その時点の蛍光強度を測定し、移植細胞の総蛍光強度(100%)とした。この細胞を、注射筒を用いて、ヌードマウス(雄性、4週齢)の皮下に移植した。移植部位をマジックにてマーキングし、移植3日後、7日後に移植部位を摘出し、酵素処理により細胞を分散させ、得られた細胞の総蛍光強度を測定し、移植時の総蛍光強度(100%)と比較することで、生着率(%)を算出した。すなわち、生着した幹細胞が多いほど、最初に移植した蛍光強度と同等の蛍光強度が検出され、逆に、生着しなかった場合は、移植部位から蛍光強度が検出されないこととなる。
すなわち、本発明は、再生医療、再生美容における、幹細胞の調製方法及び/又は、幹細胞の未分化状態の維持、増殖促進剤として利用が可能である。
Claims (4)
- バラ科モモ属に属するモモ(学名はPrunus persica BatschまたはPrunus persica Batsch var. davidiana Maxim)の種子抽出物を含有することを特徴とする未分化状態を維持させた非ヒトES細胞または哺乳動物体性幹細胞の増殖促進剤。
- バラ科モモ属に属するモモの種子抽出物を含有することを特徴とする非ヒトES細胞または哺乳動物体性幹細胞の未分化状態維持剤。
- バラ科モモ属に属するモモの種子抽出物を含有することを特徴とする非ヒトES細胞または哺乳動物体性幹細胞の未分化状態の維持方法。
- バラ科モモ属に属するモモの種子抽出物を含有することを特徴とする非ヒトES細胞または哺乳動物体性幹細胞の増殖促進方法。
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