JP2011211956A

JP2011211956A - 幹細胞の未分化維持剤及び増殖促進剤

Info

Publication number: JP2011211956A
Application number: JP2010083189A
Authority: JP
Inventors: Tomohisa Yoshimura; 知久吉村; Chiai Tahara; 千愛田原; Yasushi Hasegawa; 靖司長谷川; Kosuke Fukada; 紘介深田; Tsutomu Sakaida; 勉坂井田
Original assignee: Nippon Menard Cosmetic Co Ltd
Current assignee: Nippon Menard Cosmetic Co Ltd
Priority date: 2010-03-31
Filing date: 2010-03-31
Publication date: 2011-10-27

Abstract

【課題】哺乳動物の幹細胞に対して未分化状態を維持させたまま、幹細胞特異的な増殖促進効果を示す幹細胞の未分化維持及び増殖促進剤を開発し、かつ、移植時に組織への生着率の高い幹細胞とその調製技術を提供すること。
【解決手段】哺乳動物の胚性幹細胞、または、骨髄、血液、脂肪、皮膚組織をはじめとする生体組織における体性幹細胞及び人工的に調製した幹細胞に対して、温度が２０〜１５０℃及び圧力が５〜１００ＭＰａの状態にある二酸化炭素で抽出することにより得られるマンネンタケの抽出物を用いることにより、幹細胞の未分化状態を維持したまま、幹細胞に対して特異的に増殖を促進し、さらに、該抽出物を含有させた培養液にて調製した幹細胞は、移植時における生体組織への生着率が向上させる効果がある。以上より、本発明は、組織の再生の分野において大きく貢献できるものであり、医学、医薬品、医薬部外品、美容、健康分野への応用が期待される。
【選択図】なし

Description

本発明は、温度が２０〜１５０℃及び圧力が５〜１００ＭＰａの状態にある二酸化炭素で抽出することにより得られるマンネンタケの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする、幹細胞に対して特異的な未分化維持及び／又は増殖促進剤に関する。また、本発明は、温度が２０〜１５０℃及び圧力が５〜１００ＭＰａの状態にある二酸化炭素で抽出することにより得られるマンネンタケの抽出物を含有する培養液を用いることで、移植時に生着率が極めて高い幹細胞を調製する方法及び／又は調製された幹細胞に関する。

脊椎動物、特に哺乳動物の組織は、傷害もしくは疾患、又は加齢などに伴い細胞・臓器の損傷が起こった場合、再生系が働き、細胞・臓器の損傷を回復しようとする。この作用に、当該組織に備わる幹細胞が大きな役割を果たしている。幹細胞は、あらゆる細胞に分化する多能性を有しており、この性質により損傷部の細胞・組織を再生することで回復に導くと考えられている。このような幹細胞を応用した、次世代の医療である再生医療に期待が集まっている。

哺乳動物における幹細胞研究で最も進んでいる組織は骨髄である。骨髄には生体の造血幹細胞が存在しており、すべての血液細胞の再生の源であることが明らかにされた。さらに骨髄には、造血幹細胞とは別に、その他の臓器（例えば、骨、軟骨、筋肉、脂肪など）へ分化可能な幹細胞が存在していることが報告されている（非特許文献１参照）。
さらに、近年、骨髄以外にも、肝臓、膵臓、脂肪など、あらゆる臓器・組織に幹細胞が存在することが明らかにされ、各臓器・組織の再生および恒常性維持を司っていることがわかってきた（非特許文献２〜５参照）。このような各組織に存在する幹細胞は可塑性に優れており、今まで自己複製が不可能であった臓器や組織の根本的な再生にも利用できる可能性がある。また、近年では、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や遺伝子導入により人工的に調製された幹細胞（人工多能性幹細胞：ｉＰＳ細胞）などの技術も進歩しており、様々な幹細胞が再生医療に活用できると期待されている（特許文献１〜２参照）。

ＰｉｔｔｅｎｇｅｒＭ．Ｆ．，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２８４，１４３−１４７ＧｏｏｄｅｌｌＭ．Ｆ．，ｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１９９７，３，１３３７−１３４５ＺｕｌｅｗｓｋｉＨ．，ｅｔａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２００１，５０，５２１−５３３ＳｕｚｕｋｉＡ．，ｅｔａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２０００，３２，１２３０−１２３９ＺｕｋＰ．Ａ．，ｅｔａｌ．，ＴｉｓｓｕｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００１，７，２１１−２２８特許第４１８３７４２号公報特許第４４１１３６３号公報

このような中、これら幹細胞の能力（多能性）を細胞移植治療や組織工学（再生医療や再生美容）の分野において上手く活用するために、治療に用いる幹細胞を調製するための増殖技術や培養技術などの開発が進められている（非特許文献６〜７参照）。

馬渕洋等，日本再生医療学会誌，２００７，６，２６３−２６８北川全等，日本再生医療学会誌，２００８，７，１４−１８

特に、幹細胞を生体外で増殖させる場合、幹細胞の能力である多能性を維持した状態、すなわち、未分化な状態を維持させたまま増殖させることが極めて重要である。また、この未分化な状態を保ちつつ、治療に必要な数になるまで幹細胞を増殖させる必要がある。もし、この増殖時に幹細胞の未分化状態が維持できず分化が進んでしまった場合、最終的に調製された幹細胞の能力（多能性）は失われていることになり、目的の治療効果（臓器、組織の再生など）を発揮されにくい。

また、幹細胞は様々な細胞へ分化する能力を備えていることから、幹細胞の増殖時に分化が進行した場合、幹細胞以外の細胞も混入し増殖してしまう可能性がある。この場合、最終的に調製された幹細胞には、幹細胞以外の細胞が含まれることになり、目的の治療効果（臓器、組織の再生など）を発揮されにくい。

以上より、今後、再生医療に幹細胞を用いることを考えた場合、幹細胞の未分化状態を維持させたまま移植に必要な数まで増殖させ、また、移植時には組織への生着率が高い幹細胞を調製する技術が必要である。これには、幹細胞の未分化状態を維持するとともに、幹細胞のみを特異的に増殖させ、かつ移植時に組織への生着が高い幹細胞を調製する技術が必要である。

現在までに、幹細胞の未分化状態を維持させたまま増殖させる技術について、幾つか報告があるが、未だ発展途上である。例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や造血幹細胞は、支持細胞（ストローマ細胞、もしくはフィーダー細胞）と共培養することで未分化を維持することができる（非特許文献８〜１０、特許文献３参照）。しかし、最近になってフィーダー細胞由来の内在性ウイルスによる異種動物間の感染例が報告されており（非特許文献１１参照）、医療用途を目的とした幹細胞の培養には適していない。

ＴｈｏｍｓｏｎＪ．Ａ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９５，９２，７８４４−７８４８ＴｈｏｍｓｏｎＪ．Ａ．ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８２，１１４５−１１４７ＲｅｕｂｉｎｏｆｆＢ．Ｅ．ｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ，２０００，１８，３９９−４０４特開２００４−２４０８９号公報ＶａｎｄｅｒＬａａｎＬｕｃＪ．Ｗ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０７，９０−９４

その他の方法に、サイトカインを複雑に組合せることによって幹細胞の未分化状態を維持させる方法がある。例えば、マウスＥＳ細胞は、ＬＩＦ（白血病抑制因子（ＬｅｕｋｅｍｉａＩｎｈｉｂｉｔｏｒｙＦａｃｔｏｒ））を培地に添加することによって、未分化性が維持される（非特許文献１２、特許文献４参照）。その他、初期作用性サイトカイントロンボポイエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、ＦＬＴ−３リガンド、および幹細胞因子（ＳＣＦ）の存在下で、未分化性を維持させることが胚性幹細胞、体性幹細胞などで報告されている（特許文献５、非特許文献１３参照）。

ＳｍｉｔｈＡ．Ｇ．ｅｔａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ，１９８７，１２１，１−９特表２００２−５２５０４２号公報特許第３５７３３５４号公報ＭａｄｌａｍｂａｙａｎＧ．Ｊ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｓ．，２００１，１０，４８１−４９２

さらに近年では、人工的に幹細胞を調製する技術やそれを増殖させるための技術として塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）などを添加する方法などが発明されている（特許文献６参照）。また、幹細胞を純化する技術として、特殊な培養液（ｂＦＧＦ含有）を用いることで幹細胞の未分化状態を維持させつつ増殖させる方法が発明されている（特許文献７参照）。いずれもｂＦＧＦなどの増殖因子やサイトカインを添加することで、幹細胞の未分化状態を維持させつつ増殖を促進する技術が開発されている。しかし、このような技術で使用されている増殖因子やサイトカインなどは、極めて高価であり、製造メーカーやロット間での品質や効能の違いなどの問題があり使用は難しい。加えて、これまで汎用されているＬＩＦなどの未分化維持に効果を示す成分は、極めて特定の細胞系統に限定的であり、特に霊長類のＥＳ細胞や体性幹細胞においては、ＬＩＦの添加のみでは未分化状態を維持することができないことが明らかにされている（非特許文献９参照）。

特許第４４１１３６２号公報特表２０１０−５０００４７号公報

このように、これまでの技術では、特に幹細胞の未分状態を維持する効果が不十分であり、幹細胞の増殖は可能ではあるが、同時に幹細胞から分化した細胞や初期段階に混入した幹細胞以外の細胞も増殖してしまい、最終的に調製された幹細胞には幹細胞以外の細胞が混在する状態になってしまう。

すなわち、現在までに報告されている幹細胞の未分化状態の維持及び増殖技術は、いずれも移植用の幹細胞を調製し、実際に移植した場合に満足いく効果を望めるものは少なく、開発途上の技術であると考えられている。また、これまでの技術は、煩雑な操作を必要としたり、幹細胞の未分化状態の維持効果が低いことから、最終的には幹細胞以外の細胞の増殖を招き、これを移植する際には、幹細胞以外の細胞を移植することになるため、幹細胞の組織への生着率が極めて低下する。故に、今後の再生医療において、治療に用いる幹細胞を調製する場合、幹細胞の未分化状態を維持させる技術と、かつこの未分化状態を維持させたまま、幹細胞のみを必要な数まで増殖させる技術の開発が望まれている。これには、幹細胞に対して選択的に未分化維持と増殖促進効果を示す成分や培養技術の開発が必要である。また、これらの技術により調製された幹細胞を、生体組織に効率よく生着させる必要がある。つまり、安全かつ簡便で効率的に、幹細胞特異的に未分化状態を維持させたまま増殖させ、その他の細胞に対しては増殖効果を示さず、かつ移植時の生体組織への生着率の高い幹細胞の調製技術が求められていた。

かかる状況に鑑み、本発明は、上記のような従来技術における問題点を解決し、哺乳動物の幹細胞に対して未分化状態を維持させたまま、幹細胞特異的な増殖促進効果を示す幹細胞の未分化維持及び／又は増殖促進剤を開発し、かつ、移植時に生体組織への生着率の高い幹細胞とその調製技術を提供することにある。

本発明者らは、上記課題の解決に向けて鋭意検討を行った結果、温度が２０〜１５０℃及び圧力が５〜１００ＭＰａの状態にある二酸化炭素で抽出することにより得られるマンネンタケの抽出物に、幹細胞に対して特異的な未分化維持効果と増殖促進効果を見出し、さらに、該抽出物を含有した培養液を用いて調製した移植用の幹細胞を、実際に移植した際に組織への生着率が極めて向上することを明らかにし、本発明を完成するに至った。

即ち本発明は、以下のとおりである。
（１）温度が２０〜１５０℃及び圧力が５〜１００ＭＰａの状態にある二酸化炭素で抽出することにより得られるマンネンタケの抽出物を含有することを特徴とする、幹細胞の未分化維持剤。
（２）温度が２０〜１５０℃及び圧力が５〜１００ＭＰａの状態にある二酸化炭素で抽出することにより得られるマンネンタケの抽出物を含有することを特徴とする、幹細胞の増殖促進剤。
（３）温度が２０〜１５０℃及び圧力が５〜１００ＭＰａの状態にある二酸化炭素で抽出することにより得られるマンネンタケの抽出物を含有する培地を用いて培養することを特徴とする、幹細胞の調製方法。
（４）（３）に記載の幹細胞の調製方法を用いて調製した幹細胞。
（５）温度が２０〜１５０℃及び圧力が５〜１００ＭＰａの状態にある二酸化炭素で抽出することにより得られるマンネンタケの抽出物を含有することを特徴とする、幹細胞培養用途の培地。

以下、本発明をさらに詳細に説明する。

本発明は、温度が２０〜１５０℃及び圧力が５〜１００ＭＰａの状態にある二酸化炭素で抽出することにより得られるマンネンタケの抽出物を用いることで、幹細胞の未分化状態を維持させたまま幹細胞のみを特異的に増殖させ、さらに、移植時における幹細胞の組織への生着率の向上をもたらすことが可能な幹細胞特異的な未分化維持及び／又は増殖促進剤と該抽出物を含有する培養液を用いることで組織への生着率が極めて高い幹細胞とその調製方法を提供する。

本発明に用いるマンネンタケは、生薬「霊芝」に用いられる担子菌であり、マンネンタケ科（Ｇａｎｏｄｅｒｍａｔａｃｅａｅ）、マンネンタケ属（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ）に属する。また、マンネンタケ属のキノコについては、中国の薬学古書である「本草綱目」や「神農本草経」に赤霊芝（霊芝）、黒霊芝（黒芝）、紫霊芝（紫芝）、青霊芝（青芝）、黄霊芝（黄芝）及び白霊芝（白芝）が存在すると記載されている。赤霊芝の一種として、鹿角霊芝もあげられる。赤霊芝、鹿角霊芝の学名は（Ｇａｎｏｄｅｒｍａｌｕｃｉｄｕｍ）であり、黒霊芝の学名は（Ｇ．ａｔｒｕｍ、Ｇ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｇ．ｓｉｎｅｎｓｅ）である。また、まごじゃくし（Ｇ．ｎｅｏ−ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）も含まれる。一般的には赤霊芝、鹿角霊芝、黒霊芝などが多く流通している。これらは広く中国や日本市場などで流通しているものを用いることができるし、自生品や栽培品を用いても良い。また、菌糸体の培養物も用いることができる。これらは乾燥や粉砕したものを用いることができる。

本発明におけるマンネンタケの抽出法は、二酸化炭素による抽出、または、それ自体既知の抽出方法に従って実施することができる。

一般に本発明の二酸化炭素による抽出条件は、温度が２０〜１５０℃及び圧力が５〜１００ＭＰａである。好ましくは、温度が３０〜１００℃及び圧力が７〜６０ＭＰａの範囲である。さらに好ましくは、温度が３０〜１００℃及び圧力が７〜６０ＭＰａの範囲であり、かつ、超臨界の状態が良い。これらの範囲内で、目的に応じた温度及び圧力を採用することができる。抽出時間や二酸化炭素の供給量は、目的に応じて適宜選択できる。以下、本発明の二酸化炭素による抽出物をマンネンタケの抽出物と呼ぶ。

さらに、本発明における共溶媒（エントレーナー）として有機溶媒が用いることもできる。共溶媒としては、エタノール、アセトンなどがあげられる。中でも、安全性の面からエタノールが好ましい。

抽出は、例えば、上記抽出条件の二酸化炭素を連続的に吹き込むことによって行うことができる。次いで、マンネンタケの抽出物を含有する二酸化炭素流体を分離槽に導き、常用されている方法、例えば、圧力を下げる方法、温度を変化させる方法などで分離する。この際、分離槽には抽出された溶質を吸着できる吸着剤や、溶解や分散させることができる媒体（溶剤、基剤）などを充填しておくこともでき、抽出条件に応じた適当な分離手段を採用できる。分離された二酸化炭素は液化槽に輸送して再利用することができる。

上記抽出物は、抽出物のまま用いても良く、必要に応じて、濃縮、希釈、濾過、脱臭、乾燥などの処理をして用いても良い。更には、カラム精製などを行って有効成分を濃縮や単離をしても良い。

本発明の抽出法によれば、霊芝、鹿角霊芝などに含有するガノデリン酸などのトリテルペン類も効果的に抽出できる。特に、エントレーナーを用いればこの効果は顕著である。

また、本発明の幹細胞に対して特異的な未分化維持効果や増殖促進効果を示す抽出物や、これにより調製された幹細胞、またその調製方法などは、細胞培養用添加剤、研究用試薬、医療用試薬、細胞移植剤をはじめとし、医薬品、医薬部外品、化粧品、食品等への配合や応用が可能である。

本発明の幹細胞としては、本発明の目的に沿うものであれば、胚性の幹細胞（ＥＳ細胞）、もしくは、骨髄、血液、皮膚、脂肪、脳、肝臓、膵臓、腎臓、筋肉やその他の組織に存在する、体性の幹細胞、さらには遺伝子導入などにより人工的に調製された幹細胞、また、当該細胞の初代培養細胞、継代培養細胞、凍結細胞いずれであってもよい。好ましくは、骨髄、血液、皮膚、脂肪組織由来の幹細胞に対してより効果を発揮する。また、哺乳動物における、幹細胞の分化の方向性、および、分化の過程等について同等の特性を持っていれば、全ての哺乳動物に応用が可能である。例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の哺乳動物の幹細胞に対して効果を発揮することができる。

本発明の幹細胞を培養する培地、または同時に用いる添加剤としては、例えば以下のものを使用できるが、限定されるものではない。

具体的には、細胞の生存に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン、脂肪酸）を含む基本培地、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ（Ｄ−ＭＥＭ）、ＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０、ＢａｓａｌＭｅｄｉｕｍＥａｇｌｅ（ＢＭＥ）、Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ：ＮｕｔｒｉｅｎｔＭｉｘｔｕｒｅＦ−１２（Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２）、ＧｌａｓｇｏｗＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ（ＧｌａｓｇｏｗＭＥＭ）、ハンクス液（Ｈａｎｋ’ｓｂａｌａｎｃｅｄｓａｌｔｓｏｌｕｔｉｏｎ）に、増殖因子として塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）の少なくともいずれか１種を添加した培地が用いられ、好ましくは、これら増殖因子の全てが含有されたものである。また、必要に応じて、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ビタミン類、インターロイキン類、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コラーゲン、フィブロネクチン、プロゲステロン、セレナイト、Ｂ２７−サプリメント、Ｎ２−サプリメント、ＩＴＳ−サプリメント、抗生物質などが含有されてもよい。

また、上記以外には、１〜２０％の含有率で血清が含まれることが好ましい。しかし、血清はロットの違いにより成分が異なり、その効果にバラツキがあるため、ロットチェックを行った後に使用することが好ましい。

市販品としては、インビトロジェン製の間葉系幹細胞基礎培地や、三光純薬製の間葉系幹細胞基礎培地、ＴＯＹＯＢＯ社製のＭＦ培地、Ｓｉｇｍａ社製のハンクス液（Ｈａｎｋ’ｓｂａｌａｎｃｅｄｓａｌｔｓｏｌｕｔｉｏｎ）などを用いることができる。

幹細胞の培養に用いられる培養器は、幹細胞の培養が可能なものであれば特に限定されないが、例えば、フラスコ、シャーレ、ディッシュ、プレート、チャンバースライド、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルなどが挙げられる。

培養器は、細胞非接着性であっても接着性であってもよく、目的に応じて適宜選択される。細胞接着性の培養器は、細胞との接着性を向上させる目的で、細胞外マトリックス等による細胞支持用基質などで処理したものを用いてもよい。細胞外基質としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、フィブロネクチンなどが挙げられる。

培養条件としては、適宜設定できる。例えば、培養温度は、特に限定されるものではないが約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃が良い。ＣＯ_２ガス濃度は、例えば約１〜１０％、好ましくは約２〜５％が良い。

本発明のマンネンタケの抽出物は、幹細胞に対して極めて高い未分化状態の維持効果を示した。さらに、増殖促進効果に関しては、幹細胞以外の細胞に対しては増殖促進効果を示さず、幹細胞のみに対する極めて特異的な増殖促進効果を見出した。また、このマンネンタケの抽出物を用いて調製した幹細胞を生体組織へ移植した場合、従来の方法に比べて組織への生着率が著しく向上した。以上より、本発明は、組織の再生治療、再生美容に役立つものであり、組織の再生の分野において大きく貢献できるものである。

以下、次に本発明を詳細に説明するため、具体的かつ詳細な実施例を挙げるが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。

まず、実施例として本発明に用いるマンネンタケの抽出物の製造例および幹細胞の未分化状態の維持効果を示す実験例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。

以下に、マンネンタケの抽出物の製造例を示す。

製造例１霊芝の超臨界抽出物
内容積５リットルの抽出槽に霊芝（赤霊芝）の粉砕物１ｋｇを仕込み、これに超臨界二酸化炭素（圧力２５ＭＰａ、温度６０℃、二酸化炭素供給量１５ｍ^３）を約４．５時間供給し、抽出槽に接続した分離槽（温度４０℃、圧力４ＭＰａ）に導いて炭酸ガスと抽出物を分離し、抽出物を１０．１ｇ得た。
製造例２黒霊芝の超臨界抽出物
製造例１において霊芝を黒霊芝に変え、製造例１と同様に処理して抽出物を１２．０ｇ得た。
製造例３鹿角霊芝の超臨界抽出物
製造例１において霊芝を鹿角霊芝に変え、製造例１と同様に処理して抽出物を７．３ｇ得た。

以下に、実施例１で示した製造例１の霊芝の超臨界抽出物を用いた、幹細胞の未分化状態維持効果及び細胞増殖促進効果の実験例とその結果を示す。

実験例１幹細胞に対する未分化状態維持効果の評価
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ培養液（Ｇｉｂｃｏ社製）に、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、１５％、Ｓｉｇｍａ社製）、ヌクレオシド液（１００倍希釈、大日本製薬社製）、非必須アミノ酸液（１００倍希釈、大日本製薬社製）、β２−メルカプトエタノール液（１００倍希釈、大日本製薬社製）、Ｌ−グルタミン液（１００倍希釈、大日本製薬社製）、ペニシリン（１００ｕｎｉｔ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ社製）とストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ社製）を加えて調製した培地を用いて、マウス胚性幹細胞（マウスＥＳ細胞：コスモバイオ社製）を、６ｃｍディッシュに１×１０^５個播種し、霊芝の超臨界抽出物（製造例１）を最終濃度が０．００１％になるように添加し、３日間培養を続けた。次に細胞をＰＢＳ（−）にて３回洗浄した後、ラバーポリスマンにて集め、血球計数板にて細胞数をカウントした後、ＣｅｌＬｙｔｉｃ（Ｓｉｇｍａ社製）にてタンパク質を抽出し、未分化状態の測定を豊岡らの報告に従って行った（文献：豊岡やよい，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｄｉｃｉｎｅ臨時増刊号再生医学，２００３，１０６−１１５）。すなわち、幹細胞の未分化状態を示しているオクタマーバインディングプロテイン３／４タンパク質（Ｏｃｔ３／４タンパク質）の発現量を指標に、培養開始時に播種した幹細胞（１×１０^５個）が発現していたＯｃｔ３／４タンパク質の量を１００％未分化状態とし、霊芝の超臨界抽出物（製造例１）を添加して３日間培養した後のＯｃｔ３／４タンパク質の量をウエスタンブロッティング法にて定量解析し、培養開始時と３日間培養後のＯｃｔ３／４タンパク質の量を比較することで、未分化状態の維持効果について評価した。なお、これまでに幹細胞の未分化維持効果を示す物質として報告されている塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（特表２０１０−５０００４７号公報）を陽性対照として用いて同様な評価を行った。

具体的な評価方法としては、ウエスタンブロッティング法にて培養開始時の幹細胞の単一細胞数（１×１０^５個）に発現しているＯｃｔ３／４タンパク質量（Ａとする）を測定し開始時の未分化状態（１００％）とする。さらに霊芝の超臨界抽出物（製造例１）を添加して３日間培養した後の単一細胞数（１×１０^５個）に発現しているＯｃｔ３／４タンパク質量（Ｂとする）を測定し、培養３日後の未分化状態（％）を次の式より算出した。培養３日後の未分化状態（％）の算出式＝Ｂ／Ａ×１００（％）。この３日後の未分化状態（％）を指標に、未分化状態の維持効果について評価した。

これらの試験結果を表１に示した。その結果、陽性対照物質（ｂＦＧＦ）と比較して、霊芝の超臨界抽出物（製造例１）全てにおいて顕著な幹細胞の未分化状態維持効果が認められた。また、製造例２及び３の抽出物についても同様な効果を示した。以上より、マンネンタケの超臨界抽出物の極めて優れた幹細胞の未分化状態維持効果を明らかにした。なお、本実験例で用いた幹細胞以外にも、体性の幹細胞や遺伝子導入により人工的に調製した幹細胞についても同様な試験を行ったところ、顕著な幹細胞の未分化状態維持効果を認めた。

実験例２幹細胞に対する特異的な細胞増殖促進効果の評価
生体組織は、大きく外胚葉、中胚葉、内胚葉の組織に分類され、これら組織を構成する細胞は、約２００種類程度存在すると考えられていることから、その中でも代表として、外胚葉組織の細胞である角化細胞（ＤＳファーマバイオメディカル社製）、中胚葉組織の細胞である線維芽細胞（ＤＳファーマバイオメディカル社製）、内胚葉組織の細胞である肝臓細胞（ＨＥＰＧ２）とヒト体性幹細胞を用いて、これら細胞に対する霊芝の超臨界抽出物（製造例１）の細胞特異的な増殖促進効果について評価を行った。すなわち、これら細胞の中で、霊芝の超臨界抽出物（製造例１）が特異的に幹細胞のみに対して増殖促進効果を示すかについて評価した。具体的には、これら細胞を、それぞれを６ｃｍディッシュに１×１０^６個播種し、霊芝の超臨界抽出物（製造例１）を最終濃度が０．００１％になるように添加し、３日間培養を続けた。次に細胞をＰＢＳ（−）にて３回洗浄した後、それぞれの細胞をラバーポリスマンにて集め、細胞数をカウントした。
それぞれの細胞に対して抽出物未添加時の総細胞数をコントロール（１００％）とした場合の、霊芝の超臨界抽出物（製造例１）添加時のそれぞれの細胞数の増減（％）を算出し、各細胞に対する細胞増殖促進効果の評価を行った。なお、これまでに幹細胞の増殖促進効果を示す物質として報告されている塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（特表２０１０−５０００４７号公報）を陽性対照として用いて同様な評価を行った。

これらの試験結果を表２に示した。その結果、霊芝の超臨界抽出物（製造例１）は、幹細胞のみに対して顕著な細胞増殖促進効果を示した。この効果は、線維芽細胞、角化細胞や肝臓細胞に対しては見られず、幹細胞に対して特異的なものであった。また、これまで幹細胞増殖促進物質として使用されているｂＦＧＦは、幹細胞以外に角化細胞、線維芽細胞や肝臓細胞に対しても有意な増殖効果を示した。また、製造例２及び３の抽出物についても同様な効果を示した。以上より、マンネンタケの超臨界抽出物は、極めて優れた幹細胞に対する特異的な増殖促進効果を示した。なお、本実験例で用いた幹細胞以外にも、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や遺伝子導入により人工的に調製した幹細胞についても同様な試験を行ったところ、幹細胞に対して顕著かつ特異的な増殖促進効果を認めた。

組織への移植用として、従来の技術により調製した幹細胞と霊芝の超臨界抽出物を添加して調製した幹細胞を用いて、実際に移植を行い、移植後のそれぞれの生着率（％）を比較した。

実験例４移植用の幹細胞の調製
ヒト体性幹細胞（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を６ｃｍディッシュに１×１０^６個播種し、霊芝の超臨界抽出物（製造例１）を最終濃度が０．０１％になるように添加し、３日間培養を続けた。次に、それぞれの細胞をＰＢＳ（−）にて３回洗浄した後、無菌的にラバーポリスマンにて回収し、遠沈後、５％ＦＢＳ添加ハンクス液（Ｈａｎｋ’ｓｂａｌａｎｃｅｄｓａｌｔｓｏｌｕｔｉｏｎ）に分散し、移植用の幹細胞として用いた。その後、以下の方法にて、皮膚移植を行い、生着率（％）について測定した。

実験例５幹細胞の移植および生着率（％）の測定
実験例４で調製した幹細胞を、改めて１×１０^６個サンプリングし、細胞の数を揃えた後、注射筒にてヌードマウスの皮下に移植し、移植後の生着率（％）を測定した。具体的な生着率（％）の測定法としては、移植用にサンプリングした１×１０^６個の幹細胞を、予めＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（モレキュラープローブ社製）にて蛍光標識し、その時点の蛍光強度を測定し、移植細胞の総蛍光強度（１００％）とした。この細胞を、注射筒を用いて、ヌードマウス（雄性、４週齢）の皮下に移植した。移植部位をマジックにてマーキングし、移植３日後、７日後に移植部位を摘出し、酵素処理により細胞を分散させ、得られた細胞の総蛍光強度を測定し、移植時の総蛍光強度（１００％）と比較することで、生着率（％）を算出した。すなわち、生着した幹細胞が多いほど、最初に移植した蛍光強度と同等の蛍光強度が検出され、逆に、生着しなかった場合は、移植部位から蛍光強度が検出されないこととなる。

これらの試験結果を表３に示した。その結果、移植３日後、７日後ともに、従来の方法により調製した幹細胞に比べて霊芝の超臨界抽出物（製造例１）を用いて調製した幹細胞を移植した場合において極めて高い生着率を示した。また、製造例２及び３についても同様な効果を示した。

以上の結果より、従来の方法で調製した幹細胞よりも温度が２０〜１５０℃及び圧力が５〜１００ＭＰａの状態にある二酸化炭素で抽出することにより得られるマンネンタケの抽出物を用いて移植用の幹細胞を調製することで、幹細胞の組織への生着率を顕著に向上させることを確認した。なお、本実験例で用いた幹細胞以外にも、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や遺伝子導入により人工的に調製した幹細胞についても同様な試験を行ったところ、幹細胞移植における有意な生着率の向上効果を認めた。

本発明の、温度が２０〜１５０℃及び圧力が５〜１００ＭＰａの状態にある二酸化炭素で抽出することにより得られるマンネンタケの抽出物を幹細胞に用いることで、幹細胞の未分化状態を維持させたまま幹細胞のみを増殖促進させることが可能になり、さらに、この技術を用いることで、移植時に極めて生着率の高い幹細胞を簡便に調製することが可能となった。

本発明の活用例として、再生医療、再生美容への応用が期待される。例えば、本発明を利用することで、再生医療、再生美容に用いる移植用の幹細胞を調製する場合に、幹細胞の未分化状態を維持しつつ移植に必要な数の幹細胞を選択的かつ効率的に増殖させることが可能である。さらに本発明技術により調製された幹細胞は、移植時に組織への高い生着率を示す性質を備えており、再生医療、再生美容において極めて有用な幹細胞の調製が可能になる。また、移植以外の用途として移植後または組織に存在する幹細胞に対して、本発明の温度が２０〜１５０℃及び圧力が５〜１００ＭＰａの状態にある二酸化炭素で抽出することにより得られるマンネンタケの抽出物を、組織に対して直接的に注入または経口投与、塗布、貼付などにより導入させることにより、幹細胞特異的な未分化状態の維持効果及び増殖促進効果を見出すことが可能である。
すなわち、本発明は、再生医療、再生美容における、幹細胞に対して特異的な未分化維持剤及び／又は増殖促進剤としての応用性と、かつ該抽出物を用いることで組織への生着率の高い幹細胞の調製方法を可能にする技術である。

Claims

温度が２０〜１５０℃及び圧力が５〜１００ＭＰａの状態にある二酸化炭素で抽出することにより得られるマンネンタケの抽出物を含有することを特徴とする、幹細胞の未分化維持剤。
温度が２０〜１５０℃及び圧力が５〜１００ＭＰａの状態にある二酸化炭素で抽出することにより得られるマンネンタケの抽出物を含有することを特徴とする、幹細胞の増殖促進剤。
温度が２０〜１５０℃及び圧力が５〜１００ＭＰａの状態にある二酸化炭素で抽出することにより得られるマンネンタケの抽出物を含有する培地を用いて培養することを特徴とする、幹細胞の調製方法。
請求項３に記載の幹細胞の調製方法を用いて調製した幹細胞。
温度が２０〜１５０℃及び圧力が５〜１００ＭＰａの状態にある二酸化炭素で抽出することにより得られるマンネンタケの抽出物を含有することを特徴とする、幹細胞培養用途の培地。