CN102533641B

CN102533641B - 体外无血清成体干细胞放大培养的方法及其培养液

Info

Publication number: CN102533641B
Application number: CN201210038439.4A
Authority: CN
Inventors: 陈怡如; 林挺宇; 何宗晏; 叶健全; 徐靖惠; 曾焕清
Original assignee: GUANGLI BIOMEDICINE CO Ltd
Current assignee: Xiyue Biotech Co.,Ltd.
Priority date: 2012-02-20
Filing date: 2012-02-20
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2032-02-20
Also published as: CN102533641A

Abstract

本发明公开了一种体外无血清成体干细胞放大培养的方法及其培养液，其方法利用添加自体生长因子(PRGF)于无血清干细胞培养液中进行人类成体干细胞的初代培养及继代培养，以此方法所培养的人类成体干细胞经过多次的继代培养后，人类成体干细胞仍保持在实质未分化的状态。本发明通过人类脂肪间叶干细胞的培养，通过不同血清取代物与细胞激素的添加，及调控其最适的浓度配方，并建立间叶干细胞功能性的检测系统，可以建立大量且正确的体外无血清增殖培养系统。

Description

体外无血清成体干细胞放大培养的方法及其培养液

技术领域

本发明涉及一种体外无血清成体干细胞放大培养的方法及其培养液。

背景技术

干细胞是原始且未特化的细胞，它是未充分分化、具有再生各种组织器官的潜在功能，存在所有多细胞组织里，能经由有丝分裂与分化来分裂成多种的特化细胞，而且可以利用自我更新来提供更多干细胞。对哺乳动物来说，干细胞分为两大类：胚胎干细胞与成体干细胞，胚胎干细胞取自囊胚里的内细胞团；而成体干细胞则来自各式各样的组织。在成体组织里，干细胞与先驱细胞担任身体的修复系统，补充成体组织。在胚胎发展阶段，干细胞能分化为任何特化细胞，但仍会维持新生组织(像是血液、皮肤或肠组织)的正常转移。

1960年代Ernest A.McCulloch与James E.Till在多伦多大学的发现，开启了研究干细胞的大门。如今，我们可以用体外培养技术使干细胞生长或转变成数种特化细胞，或形成各种特定组织(像是肌肉或神经)的组成细胞。可塑性高的成体干细胞已常态地运用在医疗上。干细胞的来源有很多，包括胚胎、脐带血、骨髓、脂肪与羊水等等。利用胚胎干细胞成长为具治疗性的组织甚至器官，是一个非常新颖且具挑战性的课题，在良好的CMC产程规范下发展，或许未来会跻身成为新的医疗方式，解决现今器官移植上来源短缺的问题。医学研究者认为干细胞研究(也称为再生医学)有潜力通过用于修复特定的组织或生长器官，改变人类疾病的应对方法。但是美国政府的国家卫生研究院报告指出，“重要的技术障碍仍然存在，还需要几年的集中研究才能克服。”

干细胞的来源可分为以下五种类：

1.脐带血干细胞：

婴儿出生后残留在胎盘和脐带中的血是富含造血干细胞。自1988年起，脐血干细胞就用于治疗根达综合症，亨达综合症，和拉综合症，急性淋巴细胞性白血病等许多儿童疾病。脐血由脐带采集；脐带经过清理消毒后，从脐静脉取出脐血后，须针对传染病源和人类白血球表面抗原进行检验，再放入液氮冻存备用。在使用的时候首先解冻，再注入病人静脉。若是使用其它捐赠人干细胞的治疗方法，称为异体移植；如果干细胞来自患者本人即为自体移植。

2.周边血干细胞：

骨髓中存有人体内最主要造血干细胞的来源，而周边血干细胞则是指通过施打白血球生长激素(G-CSF)，将骨髓中的干细胞驱动至周边血液中，再经由血液分离机收集取得的干细胞。此类干细胞属于CD34+的造血干细胞，临床上常可听闻用于改善中枢神经系统与心血管方面的疾病，也主要用于治疗造血系统退化或是免疫系统不正常的疾病等；而因骨髓移植病人受到的疼痛较大需要全身麻醉，且骨髓移植系移植骨髓中的造血、间质干细胞和基质前驱细胞等，属适应症较广泛或是全身性的遗传性严重并症治疗，如果仅针对部分系统性疾病作治疗，周边血干细胞可用于取代骨髓移植。

3.胚胎干细胞：

胚胎干细胞是从囊胚(由50-100个细胞组成的早期胚胎)未分化的内部细胞团中取得，属于近全能干细胞，有三胚层的分化能力，表现高端粒酶活性，可以在体外培养两年以上的时间仍可维持自我更新的能力。胚胎干细胞现在的研究现在仍处于刚起步的阶段。许多研究仍建立在人类以外的动物模式，例如老鼠、牛或是羊等，截至2011年，在美国临床试验官方注册有一项人体试验正在进行中。胚胎干细胞由于效价高，所以临床使用上的方法与适应症需要更严谨的实验证实，另外，由于人类的胚胎干细胞取得来源涉及道德伦理上的约束，在干细胞株的建立上有所争议。(因为干细胞株必须取得人类胚胎，在经过培养纯化等。因此许多人认为干细胞株视同为人的一部份)。

4.脂肪干细胞：

以往人们因塑身而抽出的脂肪，通常是作为医疗废弃物处置，现经由医学专家研究证实，脂肪中含有大量的间质干细胞，间质干细胞具有体外增生及多重分化的潜力，可运用于组织与器官的再生与修复。

其主要特性为：

(1)、取得方式侵入性低，对人体无害。

(2)、容易大量的取得。

(3)、可进行体外增生培养。

(4)、可运用于身体的组织类型广泛，输入体内后能自动移至创伤部位，进行修补。

5.皮肤细胞：

在2007年末，美国和日本两组科学家同时成功把皮肤细胞转化成一种可诱导万能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS)，并成功使这些干细胞转化成为身体器官的一部份。通过向皮肤细胞植入特定的基因，可诱导皮肤细胞改造，变成类似胚胎干细胞的一种细胞。

脂肪组织中富含许多具有再生能力的基质细胞、前趋细胞与间质干细胞。吾人可经由抽脂或是切脂取得自体的脂肪组织，经体外分离与培养可得纯化的脂肪干细胞，故相较于其它的成体干细胞，脂肪干细胞具有取得容易的优点。脂肪组织经体外分离可得基质血管细胞群(stromal vascular fraction，SVF)，为基质细胞、血液细胞、血管内皮细胞与脂肪干细胞等共同组合而成。其中含有CD34+的造血干细胞、CD31+的内皮细胞、CD45+的免疫细胞、还有CD105+的间质干细胞等，这些不同的细胞群，在人体中均各司其职，扮演着重要的角色。脂肪干细胞在其中为具有间质干细胞特性，但细胞趋性略有不同的干细胞群，科学家早期可通过检验CD34、CD105、CD73、CD44和CD90等细胞表面抗原来判定其是否为干细胞。在细胞的应用及治疗方面，各种细胞与脂肪干细胞之间的合作，对于疾病的治疗是重要的关键。

基质血管细胞群经体外培养纯化后，其细胞经特性鉴定分析称为脂肪干细胞(或脂肪基质细胞)。脂肪基质细胞在体外培养时属于贴附型细胞，且因脂肪基质细胞为具有多潜能(multipotency)的干细胞，具有跨胚层的分化能力，故在体外放大培养时，维持其细胞不分化的状态(undifferentiated state)十分重要，换句话说，就是维持干细胞自我更新(sel frenew)的能力。利用细胞型态的观察、细胞抗原标记染色、干细胞基因表现等，可以判断干细胞的生长状态。脂肪干细胞生长有属于自己适合生长的微环境(microenvironment)，科学上也常称作Niche，譬如说脂肪干细胞属于贴附型细胞，在培养环境的胞外基质中就需要含有属于脂肪干细胞特有integrin的ligands，这些ligands属于一些胞外基质(extracellular matrix)，具有帮助细胞附着、爬行的功能。在体外培养时除了胞外基质，培养基、培养基添加物与共同培养的材料、结构、空间等都是影响细胞自我更新的重要因素，在放大培养时，维持细胞最原始与最贴近初代细胞(primary cell)的相同性(identity)就是维持干细胞自我更新的能力。

干细胞的用途

干细胞(Stem cell)即起源细胞；在细胞的分化过程中，细胞往往由于高度分化而完全失去了再分裂的能力，最终衰老死亡。生物体在发展适应过程中为了弥补此不足，保留了一部分未分化的原始细胞。干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，学者相信有应用于治疗遗传性疾病、恶性肿瘤和其它种慢性病等；以干细胞为种子培育成组织和器官，可用于移植及抗衰老医学及延长人类的寿命和生活质量。

干细胞移植治疗技术，被誉为人类有史以来的最飞跃式医疗手段，实现人体各个器官修复和更新，能消除目前80％以上的各类疾病。

利用成体干细胞进行治疗的困难，在于并非所有的组织器官皆能分离出干细胞，且数量很少；若以其它器官分离出来的干细胞发育成特定的组织细胞，其移植和功能性皆低于原器官分离出的干细胞。经由体外培养的干细胞，其特性可能会在培养过程中改变，因而有体外研究结果与临床应用于人体的实际状况有所差异的情形发生。若是要由患者本身分离干细胞来进行治疗，其干细胞也可能有发病的潜在因子，若进行移植配对来寻找捐赠者又很耗时。研究上，成体干细胞分化的功能尚未完全厘清，应用于治疗上仍可能有风险存在。

传统用于体外大量培养干细胞的技术是使用血清来做为培养基的添加物，血清在细胞培养中提供细胞生长所需的各种成分，例如荷尔蒙、生长因子及结合蛋白等。然而使用血清也同时潜在着细菌、霉浆菌或病毒等病源污染的危险，加上血清的成本昂贵、批次变异性大且会干扰产物后续的回收纯化。因此，针对人类脂肪间叶干细胞的培养，通过不同血清取代物与细胞激素的添加，及调控其最适的浓度配方，并建立间叶干细胞功能性的检测系统，可以建立大量且正确的体外无血清增殖培养系统。

发明内容

本发明的主要目的在于提供不同血清取代物与细胞激素的添加，及调控其最适的浓度配方，并建立间叶干细胞功能性的检测系统，可以建立大量且正确的体外无血清增殖培养系统。

本发明的次要目的为提供一种体外无血清成体干细胞放大培养的方法，该方法包含下列步骤：

步骤一：提供人体组织；

步骤二：以酵素水解步骤一所得的组织，并以离心方式将未水解的组织与人类成体干细胞予以分离；

步骤三：将步骤二所得人类成体干细胞于含有自体生长因子(PRGF)的无血清干细胞培养液中进行初代培养；

步骤四：取出步骤三中初代培养液中的黏贴型细胞，于含有自体生长因子的无血清干细胞培养液进行继代培养，以完成人类成体干细胞放大培养。

所述人体组织选自于脐带、骨髓、胎盘、脂肪、血液及乳牙所组成的群组。

其中用以水解人体组织的酵素为胰蛋白分解酵素或胶原蛋白分解酵素。

所述初代培养的步骤进行3至15日。

所述含有自体生长因子的无血清干细胞培养液，添加分离自自体血液的自体生长因子(PRGF)于无血清干细胞培养液中；该自体生长因子添加于无血清干细胞培养液的比例为0.1～10％(体积比)。

所述步骤还包含：以流式细胞仪确认初代培养及继代培养的人类成体干细胞的表面抗原标记特征。

其中经过继代培养后的人类成体干细胞仍保持在实质未分化的状态。

本发明的目的为提供一种培养人类成体干细胞的无血清成体干细胞培养液，其包含自体生长因子及无血清干细胞培养液所制得者。

所述含有自体生长因子的无血清培养液，添加分离自自体血液的自体生长因子(PRGF)于成体干细胞培养液中；该自体生长因子添加于成体干细胞培养液的比例为0.1～10％(体积比)。

所述自体生长因子(PRGF)是由人类自体血液分离纯化后所获得的。

用以进行人类成体干细胞的初代培养及继代培养。

所述人类成体干细胞选自于脐带血干细胞、骨髓干细胞、胎盘干细胞、脂肪间叶干细胞、人类血液细胞及乳牙干细胞所组成的群组。

附图说明

图1为脂肪干细胞细胞于无血清培养下有无添加PRGF的生长情形。P0为初代培养，P1为继代第一代，依此类推。实施例于培养角瓶中以无血清培养四天后，继代算细胞，白色的组别为没有加PRGF的组别，灰色的组别为有加PRGF的组别。

*：-/+PRGF组别有显著差异(p＜0.05)，n＝4，t-test单尾统计。

图2为脂肪干细胞细胞于无血清培养下有无添加PRGF的生长放大倍率图。P1/P0为初代到第一代的放大倍数，P2/P0为初代到第二代的放大倍率。实施例于培养角瓶中以无血清培养四天后，继代算细胞，白色的组别为没有加PRGF的组别，灰色的组别为有加PRGF的组别。

*：-/+PRGF组别有显著差异(p＜0.05)，n＝4，t-test单尾统计。

图3为BN998619的P1细胞培养在无血清下第四天的相位差放大照片(200X)，(A)没有添加PRGF，(B)有添加PRGF。

图4为BN726415的P3细胞培养在无血清下第四天的相位差放大照片(200X)，(A)没有添加PRGF，(B)有添加PRGF。

图5为BN262813的P7细胞于无血清且没有添加PRGF的培养基下培养四天后，以流式细胞仪分析CD34、CD45、HLADR、CD44、CD73、CD90等表面抗原标记的表现，并利用CellQuest软件作分析。

图6为BN262813的P7细胞于无血清，添加PRGF的培养基下培养四天后，以流式细胞仪分析CD34、CD45、HLADR、CD44、CD73、CD90等表面抗原标记的表现，并利用CellQuest软件作分析。

图7为脂肪干细胞于无血清培养下有无添加PRGF的表面抗原的表现比率。在无血清培养下四天后以流式细胞仪分析CD34、CD45、HLADR、CD44、CD73、CD90等表面抗原标记的表现，白色的组别为没有加PRGF的组别，灰色的组别为有加PRGF的组别。

*：-/+PRGF组别有显著差异(p＜0.05)，n＝4，t-test单尾统计。

图8为BN456812、P2细胞的干细胞基因表现。利用RT-PCR检验脂肪干细胞，之后以洋菜胶电泳分析(agarose gel electrophoresis)。M代表Marker，左边图为有添加PRGF的组别，右边图为没有添加PRGF的组别。缩写对照：G：gapdh，347bp；S：sox2，139bp；O：oct4，103bp；N：nanog，142bp；K：klf4，182bp；U：utf1，117bp；T：htert，258bp；M：marker

图9为BN262813、P3细胞的干细胞基因表现。利用RT-PCR检验脂肪干细胞，之后以洋菜胶电泳分析(agarose gel electrophoresis)。M代表Marker，Marker左边七行为没有添加PRGF的组别，右边七行为有添加PRGF的组别。缩写对照：G：gapdh，347bp；S：sox2，139bp；O：oct4，103bp；N：nanog，142bp；K：klf4，182bp；U：utf1，117bp；T：htert，258bp；M：marker

图10为BN456812的P2细胞进行(A)脂肪细胞与(B)骨母细胞分化至第14天；200倍放大，明视野。

图11为BN262813的P5细胞进行(A)脂肪细胞与(B)骨母细胞分化至第14天；200倍放大，明视野。

图12为BN726415的P3细胞进行(A)脂肪细胞与(B)骨母细胞分化至第14天；200倍放大，明视野。

图13为BN998619的P2细胞进行(A)脂肪细胞与(B)骨母细胞分化至第14天；200倍放大，明视野。

具体实施方式

本发明通过下面的实施例予以示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。实施例1脂肪间叶干细胞的分离及体外培养

以下实施方式是利用脂肪组织分离而得基质血管细胞群，再进一步经培养而得脂肪干细胞(脂肪基质细胞)，来对本发明作进一步说明。

1.基质血管细胞群分离

经手术取得的脂肪组织，以离心方式1000RCF、10分钟离心去除血水、大块的结缔组织等杂质留下纯脂肪组织层，随后加入适量的磷酸缓冲液与胶原蛋白酶酵素作用，酵素于37℃恒温箱中震荡作用45分钟，其后加入磷酸缓冲液冲洗，以500RCF、离心5分钟小心去除上清液，留下底下的基质血管细胞群团块，重复清洗三次后，接种至含无血清培养基的T型角瓶中培养，待1～3天后，将未贴附的细胞移去，T型角瓶已贴附的梭状细胞即为脂肪干细胞。此细胞持续以无血清培养基培养放大，作为特性分析之用。

2.脂肪干细胞培养与继代

脂肪干细胞培养上采用不含血清的-XF Basal Medium(Stem CellTechnology)，添加20％的-XF Supplement(Stem Cell Technology)、及2mML-glutamine(GIBCO)及抗生素50μg/ml gentamicin(GIBCO)作为长期培养基。T型角瓶接种细胞前预先以-XFAttachment Substrate(Stem Cell Technology)处理，以利细胞进行贴附。待细胞贴附后持续培养于37℃，5％CO₂的培养箱，当细胞密度长至八成满时，将细胞进行继代。吸取出培养基，以磷酸缓冲溶液清洗细胞后，加入Enzymatic Dissociation Solution(Stem Cell Technology)，于37℃中作用5分钟使细胞去贴附，之后加入等量Enzymatic Inhibition Solution(Stem CellTechnology)终止酵素作用，收集细胞，利用hemacytometer计算细胞数目后，将细胞重新接种于新的T型角瓶，持续培养放大，至细胞长至7分满以上时以同样方式再次继代，大约每四天继代一次，在有添加PRGF的培养组别上，将PRGF在继代或是接种时直接加入无血清培养基中，PRGF的添加量为100μl的PRGF加到10ml的无血清培养基中，每ml的无血清培养基中内含2×10⁵到1×10⁶个血小板所释放出的生长因子，如遇有继代中更换培养基，则依比例再加入PRGF。

3.自体生长因子PRGF制备

准备CPT(BD REF 362761)迷彩蓝头管采血，CPT管内含有抗凝血剂、Ficoll与一层固体胶，每支约可收集8ml血液。分离时，以1700RCF于室温下离心20分钟，离心完后，血液在CPT管内分四层，从上到下分别为血浆层(plasma)、血小板层(platelet rich plasma，PRP)、固体胶层含Ficoll、红血球层(Red blood cell)；将上层的血浆层吸出放入新的50ml离心管中，将白色的PRP层吸出放入新的15ml离心管中。依照比例(血浆层对血小板层体积之比为1∶2.5)吸取适量血浆加入另外一个新的15毫升离心管中，之后加入依比例计算出的葡萄糖酸钙(葡萄糖酸钙对血浆的体积比为0.3∶1)，置于37℃中反应15分钟，以700RCF室温离心10分钟。取其离心后上清液加入PRP中充分混合，置于37℃中反应40分钟，即完成PRGF制备。

4.血小板层PRP与血浆中血小板定量

以Flow cytometry定量PRP中血小板的数量，将50μl PRP与50μl血浆加入磷酸缓冲液中，再加入anti-CD41-PE抗体染色，免疫染色结束，加入Count Bright Beads(Invitrogen)当作计数的参考数值，再加入磷酸缓冲溶液将总体积补到约0.5ml后上机分析(FACS Calibur 3color，BD)。分析结果套入下列公式即可算出PRP与血浆中的血小板含量。

其中A＝血小板的数量；B＝beads的数量；C＝beads使用批号中每50μl含有的数量；D＝样品的体积(μl)

5.细胞表面抗原分析

本研究所得的干细胞，以流式细胞仪(Flow Cytometry，BD FACScalibur)进行细胞表面抗原的测定。将细胞去附着并以磷酸缓冲液清洗后，回溶于适量的磷酸缓冲液中，分别对不同的抗原以相对应的免疫荧光抗体进行染色，包括IgG、CD34、CD45、CD44、CD73、CD90、HL-ADR等。避光于室下温染色15分钟后，加入适量磷酸缓冲液后上机分析，经流式细胞仪收集数据后，以CELLQuest^TM(BD)软件进行分析。

6.脂肪干细胞体外分化

骨母细胞(Osteoblast)分化中，将所得的脂肪干细胞以3000cells/cm²培养于Dulbecco′s Modified Eagle Medium(DMEM high glucose，GIBCO)添加10mMβ-glycerophosphate(Sigma)、0.1M Dexamethasone(Sigma)、0.2mM Ascorbic acid(Sigma)、10％(v/v)胎牛血清(Hyclone)的硬骨诱导培养基，每三天更换一次培养基。脂肪细胞(Adipocyte)分化中，将所得的脂肪干细胞以10000cells/cm²培养于DMEM添加0.5mM 3-Isobutyl-1-methylxanthine(IBMX，Sigma)、10μg/mLInsulin(Sigma)、100μMIndomethacin(Sigma)、1μM Dexamethasone(Sigma)、10％(v/v)胎牛血清(Hyclone)的脂肪诱导培养基，每三天更换一次培养基。

7.细胞化学染色

分化的脂肪细胞以碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)进行染色，先将FastBlue RR Salt solution与AS-MX phosphate Alkaline solution以24∶1比例混合置于25℃并避光；将分化培养基吸除，以磷酸缓冲液冲洗后；以citrate buffered acetone固定30秒，再以二次水浸润45秒；然后将先前的混合液加入培养瓶中，置于37℃下避光60分钟后吸除，以二次水浸润2分钟后，再以hematoxylin solution(Sigma)染细胞核1分钟；以二次水持续冲洗，直到二次水转变为淡蓝色后再以显微镜观察。分化的骨母细胞以Oil red-O进行染色，将分化培养基吸除，以磷酸缓冲液冲洗，以3.7％paraformaldehyde in PBS/pH7.4将细胞于室温下固定15分钟后，以二次水冲洗，以Oil Red O(Sigma)染色10分钟后，以50％ethanol浸润，并以二次水冲洗；再以hematoxylin solution(Sigma)染细胞核1分钟；以二次水持续冲洗，直到二次水转变为淡蓝色后再以显微镜观察。

8.反转录-链锁酶连锁聚合反应

本研究所得的脂肪干细胞，以反转录-链锁酶连锁聚合反应(RT-PCR)来分析未分化干细胞的相关基因的表现。将培养出的细胞以磷酸缓冲液清洗后，收集在1.5mleppendorf中，加入1ml TriZol(10296-010，Invitrogen)试剂，于室温放置五分钟，加入100μl BCP(BP.151，MRC)溶液，以Vortex混匀至成粉红色溶液后，室温放置15分钟，再以15,000g离心15分钟在4℃。离心完后，eppendorf内会分三层，下层是红色层，中间一层薄薄的白色层，上层是透明层，将上层吸出放入新的1.5ml eppendorf中，吸取过程中要小心不要吸到另外两层。于新的eppendorf中加入0.5ml isopropanol，摇匀后，室温放置30分钟，之后再以15,000g离心10分钟在4℃，将上清液抽出，不要吸到pellet，加入1ml 75％ethanol清洗，再以15,000g离心10分钟在4℃，抽掉ethanol后，空气干燥10分钟，以含有DEPC的水回溶后即完成RNA萃取。吸取适量RNA，加入NCode cDNA synthesis Kit(A11193-050，Invitrogen)，以PCR machine完成RT后加入GoTaq Green Master Mix(M7122，Promega)跑PCR，PCR设定条件因不同Primer的不同Tm值而略有调整。分析跟干细胞相关未分化的相关基因，像是oct4，nanog，sox2，cMyc，Lin28，hTERT等，本专利分析oct4，sox2，klf4，nanog，utf1，hTERT和控制组基因GAPDH。分析各基因所使用的primer如下表所列：

Primer name	Sequence (5’to 3’)	Amplicon	Tm
				GAPDH_Forward	GCATCCTGCACCACCACCTG	57.9
GAPDH_Reverse	GCCTGGTTCACGACGTTCTT	347	53.8
				SOX2_Forward	CCATCCACACTCACGCAAAA	51.8
SOX2_Reverse	TATACAAGGTCCATTCCCCCG	139	54.4

OCT4_Forward	TCCCATGCATTCAAACTGAGG	52.4
			OCT4_Reverse	CCAAAAACCCTGGCACAAACT	103	52.4
NANOG_Forward	TGGACACTGGCTGAATCCTTC	54.4
			NANOG_Reverse	CGTTGATTAGGCTCCAACCAT	142	52.4
KLF4_Forward	CTGCGGCAAAACCTACACAA	51.8
			KLF4_Reverse	GGTCGCATTTTTGGCACTG	182	51.1
UTF1_Forward	CGACATCGCGAACATCCTG	53.2
			UTF1_Reverse	AGAATGAAGCCCACGGCCA	117	53.2
hTERT_Forward	GAACAGTGCCTTCACCCTCGA	56.3
			hTERT_Reverse	CGGAAGAGTGTCTGGAGCAAGT	258	56.7

实施例2添加PRGF于无血清培养基用以放大培养成体干细胞

1.脂肪基质血管细胞群分离

本发明用以研究的临床人类检体共四例，分别以编号BN456812、BN262813、BN726415、BN998619称之。

所分离的基质血管细胞群进一步培养成脂肪干细胞，培养与继代记录如后所述。

2.脂肪干细胞培养

脂肪干细胞以无血清培养基培养，方法如上述；在培养过程中，依照PRP的定量结果，于每毫升培养基中添加相当于1×10⁷血小板分离所得的PRGF，比较有无添加PRGF的细胞生长曲线及细胞定性结果。本发明的细胞无血清培养收得细胞数记录如下表所列：

表1、脂肪干细胞培养记录表，表中记录有无添加PRGF的情况下细胞培养结果

编号	添加PRGF	P0细胞数	P1细胞数	P2细胞数	P3细胞数
						BN456812	无	4.4×10⁶	3.9×10⁷	2.5×10⁸	4.2×10⁸
	有	4.5×10⁶	4.3×10⁷	3.8×10⁸	7.8×10⁸
						BN262813	无	2.8×10⁶	8.0×10⁶	4.0×10⁷	2.6×10⁸
	有	4.0×10⁶	2.1×10⁷	1.7×10⁸	1.3×10⁹
						BN726415	无	3.6×10⁶	2.9×10⁷	1.7×10⁸	7.3×10⁸

有	3.9×10⁶	3.3×10⁷	2.6×10⁸	1.9×10⁹
					BN998619	无	6.1×10⁶	5.5×10⁷	2.2×10⁸	8.8×10⁸
有	6.8×10⁶	6.3×10⁷	4.9×10⁸	3.9×10⁹

注：本表所收得的细胞数，均培养自17ml脂肪组织所分离的基质血管细胞群。

将上表的实验数据画成细胞生长图(如图1)，可以明显看出有添加PRGF的细胞培养组，相较于没有添加的组别，细胞生长较快。细胞在早期代数生长时(P0～P1)，因细胞较年轻，容易维持自我更新，两组间在细胞数上没有显著差异；然而，随着继代，细胞渐趋老化后，因为PRGF中富含生长因子，推测可以帮助干细胞讯息传递启动，维持干细胞自我更新的能力，所以生长速率仍可维持。

若将细胞数换算成细胞放大倍率(表2)，更可以清楚的看到，到第二代时，细胞数已经差到两倍以上；到第3代，细胞数在有添加跟没添加PRGF得组别有显著的差异(如图2)；干细胞在维持不分化生长时，需要自分泌(autocrine)和旁分泌(paracrine)彼此作用，调控讯息传递的进行；细胞在无血清的培养环境下，容易改变原有的特性，因为无血清培养环境不像血清可以提供很多生长必须的生长因子与细胞激素，甚至还有些微量矿物元素等，若长期培养在这样恶劣的环境下，细胞会失去原有在生理环境下的一致性(identity)；PRGF的功用即在于供给许多种类的自体生长因子与细胞激素，或是一些微量化学物质等，这些东西对于帮助脂肪干细胞旁分泌讯息传递是不可或缺的，对于长时间体外维持一致性(long-term maintenance)，干细胞讯息传递(stemness signaling pathway)的进行与交互影响十分重要。

表2、脂肪干细胞生长放大倍率的数据表列(平均±标准偏差，n＝4)

细胞代数	没有PRGF	有PRGF
			P1/P0	7.2±2.9	8.1±2.0
P2/P0	38.6±18.3	66.4±17.6
			P3/P0	133.8±51.7	389.8±177.3

脂肪干细胞在体外培养时，可以通过型态观察判断细胞的状态，从脂肪干细胞型态了解其生长状况和分化状态。脂肪干细胞在培养时属于贴附型细胞，具有类似纤维母细胞的梭状细胞型态。本发明中，利用无血清环境培养的脂肪干细胞型态正常，在早期继代数(P0～P1)，有添加和没有添加PRGF的培养组别中，脂肪干细胞都呈现正常的梭状细胞型态，不过已经可以看出有些微的差异；没有添加PRGF的组别中，有些游走型态的细胞，型态上不规则，偶为细长，偶为大而扁平，所能达到的细胞密度也较低(如图3A)；然而，在有添加PRGF的组别当中，细胞型态圆而小较为一致，核质比大且细胞密度较高(如图3B)。细胞培养到后期代数(如P3)的时后，细胞在型态上的差异也越趋明显，没有添加PRGF的细胞会变得比较细长，越趋不规则，也会发现有些细胞的细胞质有皱折且细胞摊平，这些是典型细胞老化或是基因沉默(gene senescence)的现象(如图4A)；反之，有添加PRGF的培养组别，细胞排列规则，侧向排列(lateral association)的行为良好，细胞型态圆而小，很贴近初代细胞的细胞型态(如图4B)。

从细胞培养型态观察总结可以发现，有添加PRGF的细胞型态较没添加的圆而小，较贴近未分化的状态(undifferentiated state)；另外，发现能长到比较满的细胞密度，有添加PRGF时，细胞在P3前可以达到约55,000cells/cm²，也反映在细胞生长变快，细胞数较多。

3.脂肪干细胞定性

3.1细胞表面抗原分析

于无血清培养下放大的脂肪干细胞，以流式细胞仪分析表面抗原，可以发现细胞族群为CD34-、CD45-、HLADR-、CD44+、CD73+、CD90+，为类似间质干细胞的细胞族群。在培养的过程中，细胞的族群会越来越纯，可以从流式细胞仪FSC对SSC的点状图中观察到(如图5、图6)，点越密集，代表族群越集中。统计实施例的细胞分析结果，结果记录于表3：

表3、脂肪干细胞表面抗原分析统计，表中的P1(passage 1)代表代数1，P2(passage 2)代表代数2，依此类推。

脂肪干细胞在培养过程中，如果型态不健康、不一致、培养状况不良如有死细胞等，都会影响到流式细胞仪的分析结果。有添加PRGF的培养组别中，FSC对SSC的点状图可以看到群落集中(如图6)，相较下，没有添加PRGF的组别，则群落较为分散(如图5)。另外，有添加PRGF的培养组别在CD73和CD90的表现量上较高，且表现的强度较一致，分析图中的峰比较尖(如图6)，也呼应到细胞的形态观察上比较一致。在后期代数的培养上(如P7)，细胞型态容易变形，这型态变化会反应在CD73和CD90的染色结果上，如CD73和CD90的染色结果比较低，则可能暗指说细胞没有维持在不分化的生长状态。

将细胞表面抗原的表现量用统计分析后，发现添加PRGF培养脂肪干细胞的组别较容易维持细胞的一致性，代表脂肪干细胞的细胞标记表现比例都比未添加PRGF的组别高(如图7)；其中CD44高3.2％(n＝7，p＝0.033)；CD73高3.3％(n＝7，p＝0.0425)；CD90高2.9％(n＝7，p＝0.079)；三个负向的细胞标记表现量均低。CD44扮演着细胞间互相沟通、影响的功能；CD90是多种干细胞会表现的细胞标记；CD73是一种干细胞会表现的酵素。在细胞状态维持一致时，这些表面标记的表现量会一致，而且脂肪干细胞都会表现；反之，如果细胞特性改变，则细胞标记表现也会随之改变。细胞体外大量无血清培养时，需维持良好的一致性，经过添加PRGF的培养方法较未添加的方法，在维持干细胞表面抗原的表现上有更好的效果。

3.2干细胞基因表现分析

利用RT-PCR分析脂肪干细胞的基因表现，特别针对六种干细胞基因(stemnessgene)作分析，可以发现oct4、sox2、nanog、klf4、utf1和htert都会在脂肪干细胞中表现，oct4、sox2、nanog是干细胞中重要的转录因子(transcription factor)，会调控、启动很多下游基因的表现，对于维持干细胞自我更新是必须的；klf4也是一个在胚胎干细胞和间质干细胞中都有的重要蛋白质，对于维持干细胞的效价扮演着重要的功能。2007年日本的yamanaka和美国的Thomson等人也利用这些基因的组合成功的将体细胞引导成近全能型干细胞(induced pluripotent stem cells，IPS cells)，说明这些基因对于干细胞的重要性。此外，实验结果也并且可以发现如果有添加PRGF，较容易维持utf1和htert的基因表现(如图8和图9)，意指脂肪干细胞在无血清培养下添加PRGF时，可以维持细胞生长和不分化的状态；utf1全名是undifferentiated transcription factor 1，意即干细胞未分化时会表现的转录因子，会调控其它干细胞基因的表现；htert全名是human telomerase reversetranscriptase，是人类端粒酶反转录酵素，可以延长人类端粒缩短的时间，跟人类细胞的寿命有直接的关系。

3.3脂肪干细胞分化

体外培养的脂肪干细胞具有分化成中胚层细胞的能力，像是脂肪和骨头细胞，实施例中证实利用PRGF所培养出来的脂肪干细胞可以分化成脂肪和骨头，具有间质干细胞的分化能力，且实验发现脂肪细胞的分化能力很强，只需要分化七天即有大量油滴产生，可能是因为来源是脂肪干细胞的关系(如图10、图11、图12、图13)。

4.自体生长因子PRGF定量

利用定量检体中血小板的数目间接定量PRGF的浓度。CD41为血小板会表现的表面抗原，在PRGF的制作过程中，血小板会破裂，使得血小板中的物质释放到PRGF溶液中，其中含有许许多多的生长因子，包括VEGF、PDGF-BB、FGF2等，本实施例用流式细胞仪分析样品中会表现CD41的颗粒，另外再加上内参考组，利用公式即可算出CD41+颗粒的实际数量。BN456812的PRGF血小板含量为4371颗/μl、BN262813的PRGF血小板含量为94101颗/μl、BN726415的PRGF血小板含量为53995颗/μl、BN998619的PRGF血小板含量为11028颗/μl。

Claims

1.一种体外无血清成体干细胞放大培养的方法，其特征在于，该方法包含下列步骤：

步骤一：提供人体组织；

步骤三：以CPT迷彩蓝头管对该人体进行采血，该CPT管内含有抗凝血剂、Ficoll与一层固体胶，每支可收集8ml血液；将该CPT管以1700RCF于室温下离心20分钟，离心完后，血液在该CPT管内分四层，从上到下分层为血浆层、血小板层、固体胶层含Ficoll、红血球层；将该血浆层吸出放入50ml离心管中，将该血小板层吸出放入第一15ml离心管中；依照血浆层对血小板层体积比为1∶2.5的比例吸取该血浆放入第二15ml离心管中，于该第二15ml离心管中加入葡萄糖酸钙并置于37℃中反应15分钟，再以700RCF室温离心10分钟；取其离心后的上清液，再将该上清液加入该血小板中并置于37℃中反应40分钟以获得自体生长因子；其中，该葡萄糖酸钙对该血浆的体积比为0.3∶1；

步骤四：将步骤二所得人类成体干细胞于含有体积比例为0.1～10％之该自体生长因子的无血清干细胞培养液中进行初代培养；

步骤五：取出步骤四中初代培养液中的黏贴型细胞，于含有体积比例为0.1～10％之该自体生长因子的无血清干细胞培养液进行继代培养，以完成人类成体干细胞放大培养。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人体组织选自于脐带、骨髓、胎盘、脂肪、血液或乳牙所组成的群组。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，用以水解人体组织的酵素为胰蛋白分解酵素或胶原蛋白分解酵素。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述初代培养的步骤进行3至15日。

5.如权利要求1项所述的方法，其特征在于，所述含有自体生长因子的无血清干细胞培养液，是添加分离自自体血液的自体生长因子于无血清干细胞培养液中。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤还包含：以流式细胞仪确认初代培养及继代培养的人类成体干细胞的表面抗原标记特征。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，经过继代培养后的人类成体干细胞仍保持在实质未分化的状态。

8.一种培养人类成体干细胞的无血清成体干细胞培养液，其特征在于，包含体积比例为0.1～10％之权利要求1所述的自体生长因子及无血清干细胞培养液所制得者。

9.如权利要求8所述的培养液，其特征在于，所述含有自体生长因子的无血清干细胞培养液，是添加分离自自体血液的自体生长因子于成体干细胞培养液中。

10.如权利要求8所述的培养液，其特征在于，所述自体生长因子是由人类自体血液分离纯化后所获得的。

11.如权利要求8所述的培养液，其特征在于，用以进行人类成体干细胞的初代培养及继代培养。

12.如权利要求8所述的培养液，其特征在于，所述人类成体干细胞选自于脐带血干细胞、骨髓干细胞、胎盘干细胞、脂肪间叶干细胞、人类血液细胞或乳牙干细胞所组成的群组。

13.如权利要求8所述的培养液，其特征在于，经过继代培养后的人类成体干细胞仍保持在实质未分化的状态。