TWI573873B - 體外無血清成體幹細胞放大培養技術 - Google Patents

Description

體外無血清成體幹細胞放大培養技術

本發明係藉由人類脂肪間葉幹細胞的培養，藉由不同血清取代物與細胞激素的添加，及調控其最適的濃度配方，並建立間葉幹細胞功能性的檢測系統，可以建立大量且正確的體外無血清增殖培養系統。

幹細胞是原始且未特化的細胞，它是未充分分化、具有再生各種組織器官的潛在功能，存在所有多細胞組織裡，能經由有絲分裂與分化來分裂成多種的特化細胞，而且可以利用自我更新來提供更多幹細胞。對哺乳動物來說，幹細胞分為兩大類：胚胎幹細胞與成體幹細胞，胚胎幹細胞取自囊胚裡的內細胞團；而成體幹細胞則來自各式各樣的組織。在成體組織裡，幹細胞與先驅細胞擔任身體的修復系統，補充成體組織。在胚胎發展階段，幹細胞能分化為任何特化細胞，但仍會維持新生組織(像是血液、皮膚或腸組織)的正常轉移。

1960年代Ernest A.McCulloch與James E.Till在多倫多大學的發現，開啟了研究幹細胞的大門。如今，我們可以用體外培養技術使幹細胞生長或轉變成數種特化細胞，或形成各種特定組織(像是肌肉或神經)的組成細胞。可塑性高的成體幹細胞已常態地運用在醫療上。幹細胞的來源有很多，包括胚胎、臍帶血、骨髓、脂肪與羊水等等。利用胚胎幹細胞成長為具治療性的組織甚至器官，是一個非常新穎且具挑戰性的課題，在良好的CMC產程規範下發展，或許未來會躋身成為新的醫療方式，解決現今器官移植上來源短缺的問題。醫學研究者認為幹細胞研究(也稱為再生醫學)有潛力通過用於修復特定的組織或生長器官，改變人類疾病的應對方法。但是美國政府的國家衛生研究院報告指出，「重要的技術障礙仍然存在，還需要幾年的 集中研究才能克服。」

幹細胞的來源可分為以下五種類：

1. 臍帶血幹細胞：

嬰兒出生後殘留在胎盤和臍帶中的血是富含造血幹細胞。自1988年起，臍血幹細胞就用於治療根達綜合症，亨達綜合症，和拉綜合症，急性淋巴細胞性白血病等許多兒童疾病。臍血由臍帶採集；臍帶經過清理消毒後，從臍靜脈取出臍血後，須針對傳染病源和人類白血球表面抗原進行檢驗，再放入液氮凍存備用。在使用的時候首先解凍，再注入病人靜脈。若是使用其他捐贈人幹細胞的治療方法，稱為異體移植；如果幹細胞來自患者本人即為自體移植。

2. 周邊血幹細胞：

骨髓中存有人體內最主要造血幹細胞的來源，而周邊血幹細胞則是指藉由施打白血球生長激素(G-CSF)，將骨髓中的幹細胞驅動至周邊血液中，再經由血液分離機收集取得之幹細胞。此類幹細胞屬於CD34+的造血幹細胞，臨床上常可聽聞用於改善中樞神經系統與心血管方面的疾病，也主要用於治療造血系統退化或是免疫系統不正常的疾病等；而因骨髓移植病人受到的疼痛較大需要全身麻醉，且骨髓移植係移植骨髓中的造血、間質幹細胞和基質前驅細胞等，屬適應症較廣泛或是全身性的遺傳性嚴重併症治療，如果僅針對部分系統性疾病作治療，周邊血幹細胞可用於取代骨髓移植。

3. 胚胎幹細胞：

胚胎幹細胞是從囊胚(由50-100個細胞組成的早期胚胎)未分化的內部細胞團中取得，屬於近全能幹細胞，有三胚層的分化能力，表現高端粒酶活性，可以在體外培養兩年以上的時間仍可維持自我更新的能力。胚胎幹細胞現在的研究現在仍處於剛起步的階段。許多研 究仍建立在人類以外之動物模式，例如老鼠、牛或是羊等，截至2011年，在美國臨床試驗官方註冊有一項人體試驗正在進行中。胚胎幹細胞由於效價高，所以臨床使用上的方法與適應症需要更嚴謹的實驗證實，另外，由於人類的胚胎幹細胞取得來源涉及道德倫理上的約束，在幹細胞株的建立上有所爭議。(因為幹細胞株必須取得人類胚胎，在經過培養純化等。因此許多人認為幹細胞株視同為人的一部份)。

4. 脂肪幹細胞：

以往人們因塑身而抽出的脂肪，通常是作為醫療廢棄物處置，現經由醫學專家研究證實，脂肪中含有大量的間質幹細胞，間質幹細胞具有體外增生及多重分化的潛力，可運用於組織與器官的再生與修復。

其主要特性為：

(1)、取得方式侵入性低，對人體無害。

(2)、容易大量的取得。

(3)、可進行體外增生培養。

(4)、可運用於身體之組織類型廣泛，輸入體內後能自動移至創傷部位，進行修補。

5. 皮膚細胞：

在2007年末，美國和日本兩組科學家同時成功把皮膚細胞轉化成一種可誘導萬能幹細胞(induced pluripotent stem cells，iPS)，並成功使這些幹細胞轉化成為身體器官的一部份。透過向皮膚細胞植入特定的基因，可誘導皮膚細胞改造，變成類似胚胎幹細胞的一種細胞。

脂肪組織中富含許多具有再生能力的基質細胞、前趨細胞與間質幹細胞。吾人可經由抽脂或是切脂取得自體的脂肪組織，經體外分離與培養可 得純化之脂肪幹細胞，故相較於其他的成體幹細胞，脂肪幹細胞具有取得容易的優點。脂肪組織經體外分離可得基質血管細胞群(stromal vascular fraction，SVF)，為基質細胞、血液細胞、血管內皮細胞與脂肪幹細胞等共同組合而成。其中含有CD34⁺的造血幹細胞、CD31⁺的內皮細胞、CD45⁺的免疫細胞、還有CD105⁺的間質幹細胞等，這些不同的細胞群，在人體中均各司其職，扮演著重要的角色。脂肪幹細胞在其中為一具有間質幹細胞特性，但細胞趨性略有不同的幹細胞群，科學家早期可藉由檢驗CD34、CD105、CD73、CD44和CD90等細胞表面抗原來判定其是否為幹細胞。在細胞的應用及治療方面，各種細胞與脂肪幹細胞之間的合作，對於疾病的治療是重要的關鍵。

基質血管細胞群經體外培養純化後，其細胞經特性鑑定分析稱為脂肪幹細胞(或脂肪基質細胞)。脂肪基質細胞在體外培養時屬於貼附型細胞，且因脂肪基質細胞為具有多潛能(multipotency)之幹細胞，具有跨胚層之分化能力，故在體外放大培養時，維持其細胞不分化的狀態(undifferentiated state)十分重要，換句話說，就是維持幹細胞自我更新(self renew)的能力。利用細胞型態的觀察、細胞抗原標記染色、幹細胞基因表現等，可以判斷幹細胞之生長狀態。脂肪幹細胞生長有屬於自己適合生長的微環境(microenvironment)，科學上也常稱作Niche，譬如說脂肪幹細胞屬於貼附型細胞，在培養環境之胞外基質中就需要含有屬於脂肪幹細胞特有integrin的ligands，這些ligands屬於一些胞外基質(extracellular matrix)，具有幫助細胞附著、爬行的功能。在體外培養時除了胞外基質，培養基、培養基添加物與共同培養的材料、結構、空間等都是影響細胞自我更新之重要因素，在放大培養時，維持細胞最原始與最貼近初代細胞(primary cell)的相同性(identity)就是維持幹細胞自我更新的能力。

幹細胞的用途

幹細胞(Stem cell)即起源細胞；在細胞的分化過程中，細胞往往由於高 度分化而完全失去了再分裂的能力，最終衰老死亡。生物體在發展適應過程中為了彌補此一不足，保留了一部分未分化的原始細胞。幹細胞是一類具有自我更新和分化潛能的細胞，學者相信有應用於治療遺傳性疾病、惡性腫瘤和其他種慢性病等；以幹細胞為種子培育成組織和器官，可用於移植及抗衰老醫學及延長人類的壽命和生活品質。

幹細胞移植治療技術，被譽為人類有史以來的最飛躍式醫療手段，實現人體各個器官修復和更新，能消除目前80%以上的各類疾病。

利用成體幹細胞進行治療的困難，在於並非所有的組織器官皆能分離出幹細胞，且數量很少；若以其他器官分離出來的幹細胞發育成特定的組織細胞，其移植和功能性皆低於原器官分離出的幹細胞。經由體外培養的幹細胞，其特性可能會在培養過程中改變，因而有體外研究結果與臨床應用於人體的實際狀況有所差異的情形發生。若是要由患者本身分離幹細胞來進行治療，其幹細胞也可能有發病的潛在因子，若進行移植配對來尋找捐贈者又很耗時。研究上，成體幹細胞分化的功能尚未完全釐清，應用於治療上仍可能有風險存在。

傳統用於體外大量培養幹細胞的技術是使用血清來做為培養基的添加物，血清在細胞培養中提供細胞生長所需的各種成分，例如賀爾蒙、生長因子及結合蛋白等。然而使用血清也同時潛在著細菌、黴漿菌或病毒等病源污染的危險，加上血清的成本昂貴、批次變異性大且會干擾產物後續的回收純化。因此，針對人類脂肪間葉幹細胞的培養，藉由不同血清取代物與細胞激素的添加，及調控其最適的濃度配方，並建立間葉幹細胞功能性的檢測系統，可以建立大量且正確的體外無血清增殖培養系統。

是以，本案發明人鑑於上述，以及的可能性，乃亟思加以改良創新，並經多年苦心孤詣潛心研究後，終於成功研發完成本件體外無血清成體幹細胞放大培養技術。

本發明之主要目的在於提供不同血清取代物與細胞激素的添加，及調控其最適的濃度配方，並建立間葉幹細胞功能性的檢測系統，可以建立大量且正確的體外無血清增殖培養系統。

本發明之次要目的為提供一種體外無血清成體幹細胞放大培養之方法，該方法包含下列步驟：步驟一：提供一人體組織；步驟二：以酵素水解步驟一所得之組織，並以離心方式將未水解之組織與人類成體幹細胞予以分離；步驟三：將人體之血液離心分離獲得血漿層及血小板層，依照血漿對血小板之體積比為1：2.5之比例吸取該血漿，並再依照葡萄糖酸鈣對該血漿之體積比為0.3：1之比例將加入葡萄糖酸鈣與該吸取之血漿混合，離心取上清液，再將該上清液加入該血小板中反應以形成自體生長因子(PRGF)步驟四：將步驟二所得人類成體幹細胞於含有體積比例為0.1~10%之該自體生長因子(PRGF)之無血清幹細胞培養液中進行初代培養；步驟五：取出步驟四中初代培養液中之黏貼型細胞，於含有體積比例為0.1~10%之該自體生長因子之無血清幹細胞培養液進行繼代培養，以完成人類成體幹細胞放大培養。

其中該人體組織係選自於臍帶、骨髓、胎盤、脂肪、血液及乳牙所組成的群組。

其中用以水解人體組織之酵素為胰蛋白分解酵素或膠原蛋白分解酵素。

其中該初代培養之步驟係進行3至15日。

其中該含有自體生長因子之無血清幹細胞培養液，係添加分離自自體 血液之自體生長因子(PRGF)於無血清幹細胞培養液中；該自體生長因子添加於無血清幹細胞培養液的比例為0.1~10%(體積比)。

其中該步驟更包含：以流式細胞儀確認初代培養及繼代培養之人類成體幹細胞之表面抗原標記特徵。

其中經過繼代培養後之人類成體幹細胞仍保持在實質未分化的狀態。

本發明之目的為提供一種培養人類成體幹細胞之無血清成體幹細胞培養液，其係包含一自體生長因子及無血清幹細胞培養液所製得者。

其中該含有自體生長因子之無血清培養液，係添加分離自自體血液之自體生長因子(PRGF)於成體幹細胞培養液中；該自體生長因子添加於成體幹細胞培養液的比例為0.1~10%(體積比)。

其中該自體生長因子(PRGF)是由人類自體血液分離純化後所獲得者。

其係用以進行人類成體幹細胞之初代培養及繼代培養。

其中該人類成體幹細胞係選自於臍帶血幹細胞、骨髓幹細胞、胎盤幹細胞、脂肪間葉幹細胞、人類血液細胞及乳牙幹細胞所組成的群組。

其中經過繼代培養後之人類成體幹細胞仍保持在實質未分化的狀態。

本發明係以下面的實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例所限制。

實施例一、脂肪間葉幹細胞的分離及體外培養

以下實施方式係利用脂肪組織分離而得基質血管細胞群，再進一步經培養而得脂肪幹細胞(脂肪基質細胞)，來對本發明作進一步說明。

1. 基質血管細胞群分離

經手術取得之脂肪組織，以離心方式1000 RCF、10分鐘離心去除血水、大塊的結締組織等雜質留下純脂肪組織層，隨後加入適量之磷酸緩衝 液與膠原蛋白酶酵素作用，酵素於37℃恆溫箱中震盪作用45分鐘，其後加入磷酸緩衝液沖洗，以500 RCF、離心5分鐘小心去除上清液，留下底下的基質血管細胞群團塊，重覆清洗三次後，接種至含無血清培養基的T型角瓶中培養，待1~3天後，將未貼附之細胞移去，T型角瓶已貼附之梭狀細胞即為脂肪幹細胞。此細胞持續以無血清培養基培養放大，作為特性分析之用。

2. 脂肪幹細胞培養與繼代

脂肪幹細胞培養上採用不含血清之MesenCult®-XF Basal Medium(Stem Cell Technology)，添加20%的MesenCult®-XF Supplement(Stem Cell Technology)、及2mM L-glutamine(GIBCO)及抗生素50μg/ml gentamicin(GIBCO)作為長期培養基。T型角瓶接種細胞前預先以MesenCult®-XF Attachment Substrate(Stem Cell Technology)處理，以利細胞進行貼附。待細胞貼附後持續培養於37℃，5% CO₂之培養箱，當細胞密度長至八成滿時，將細胞進行繼代。吸取出培養基，以磷酸緩衝溶液清洗細胞後，加入MesenCult® Enzymatic Dissociation Solution(Stem Cell Technology)，於37℃中作用5分鐘使細胞去貼附，之後加入等量MesenCult® Enzymatic Inhibition Solution(Stem Cell Technology)終止酵素作用，收集細胞，利用hemacytometer計算細胞數目後，將細胞重新接種於新的T型角瓶，持續培養放大，至細胞長至7分滿以上時以同樣方式再次繼代，大約每四天繼代一次，在有添加PRGF的培養組別上，將PRGF在繼代或是接種時直接加入無血清培養基中，PRGF的添加量為100μl的PRGF加到10ml的無血清培養基中，每ml的無血清培養基中內含2×10⁵到1×10⁶個血小板所釋放出之生長因子，如遇有繼代中更換培養基，則依比例再加入PRGF。

3. 自體生長因子PRGF製備

準備CPT(BD REF 362761)迷彩藍頭管採血，CPT管內含有抗凝血劑、Ficoll與一層固體膠，每支約可收集8ml血液。分離時，以1700 RCF於室溫下離心20分鐘，離心完後，血液在CPT管內分四層，從上到下分別為血漿層(plasma)、血小板層(platelet rich plasma,PRP)、固體膠層含Ficoll、紅血球層(Red blood cell)；將上層之血漿層吸出放入新的50ml離心管中，將白色的PRP層吸出放入新的15ml離心管中。自前述放有血漿層之50ml離心管中，依照血漿對血小板之體積比為1：2.5之比例，吸取適量血漿加入另外一個新的15毫升離心管中，之後，依照葡萄糖酸鈣對血漿之體積比為0.3：1之比例加入葡萄糖酸鈣至前述吸取有該血漿之15毫升離心管中，置於37℃中反應15分鐘，以700 RCF室溫離心10分鐘。取其離心後上清液加入PRP中充分混合，置於37℃中反應40分鐘，即完成PRGF製備。

4. 血小板層PRP與血漿中血小板定量

以Flow cytometry定量PRP中血小板之數量，將50μl之PRP與50μl之血漿加入磷酸緩衝液中，再加入anti-CD41-PE抗體染色，免疫染色結束，加入Count Bright Beads(Invitrogen)當作計數之參考數值，再加入磷酸緩衝溶液將總體積補到約0.5ml後上機分析(FACS Calibur 3 color,BD)。分析結果套入下列公式即可算出PRP與血漿中的血小板含量。

其中A=血小板的數量；B=beads的數量；C=beads使用批號中每50μl含有的數量；D=樣品的體積(μl)

5. 細胞表面抗原分析

本研究所得之幹細胞，以流式細胞儀(Flow Cytometry,BD FACScalibur)進行細胞表面抗原之測定。將細胞去附著並以磷酸緩衝液清洗後，回溶於適量之磷酸緩衝液中，分別對不同的抗原以相對應的免疫螢光抗體進行染 色，包括IgG、CD34、CD45、CD44、CD73、CD90、HL-ADR等。避光於室下溫染色15分鐘後，加入適量磷酸緩衝液後上機分析，經流式細胞儀收集數據後，以CELL Quest^TM(BD)軟體進行分析。

6. 脂肪幹細胞體外分化

骨母細胞(Osteoblast)分化中，將所得之脂肪幹細胞以3000cells/cm²培養於Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM high glucose,GIBCO)添加10mM β-glycerophosphate(Sigma)、0.1M Dexamethasone(Sigma)、0.2mM Ascorbic acid(Sigma)、10%(v/v)胎牛血清(Hyclone)的硬骨誘導培養基，每三天更換一次培養基。脂肪細胞(Adipocyte)分化中，將所得之脂肪幹細胞以10000cells/cm2培養於DMEM添加0.5mM 3-Isobutyl-1-methylxanthine(IBMX,Sigma)、10μg/mL Insulin(Sigma)、100μM Indomethacin(Sigma)、1μM Dexamethasone(Sigma)、10%(v/v)胎牛血清(Hyclone)的脂肪誘導培養基，每三天更換一次培養基。

7. 細胞化學染色

分化的脂肪細胞以鹼性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)進行染色，先將Fast Blue RR Salt solution與AS-MX phosphate Alkaline solution以24：1比例混合置於25℃並避光；將分化培養基吸除，以磷酸緩衝液沖洗後；以citrate buffered acetone固定30秒，再以二次水浸潤45秒；然後將先前之混合液加入培養瓶中，置於37℃下避光60分鐘後吸除，以二次水浸潤2分鐘後，再以hematoxylin solution(Sigma)染細胞核1分鐘；以二次水持續沖洗，直到二次水轉變為淡藍色後再以顯微鏡觀察。分化的骨母細胞以Oil red-O進行染色，將分化培養基吸除，以磷酸緩衝液沖洗，以3.7% paraformaldehyde in PBS/pH7.4將細胞於室溫下固定15分鐘後，以二次水沖洗，以Oil Red O(Sigma)染色10分鐘後，以50% ethanol浸潤，並以二 次水沖洗；再以hematoxylin solution(Sigma)染細胞核1分鐘；以二次水持續沖洗，直到二次水轉變為淡藍色後再以顯微鏡觀察。

8. 反轉錄-鏈鎖酶連鎖聚合反應

本研究所得之脂肪幹細胞，以反轉錄-鏈鎖酶連鎖聚合反應(RT-PCR)來分析未分化幹細胞之相關基因的表現。將培養出之細胞以磷酸緩衝液清洗後，收集在1.5ml eppendorf中，加入1ml TriZol(10296-010,Invitrogen)試劑，於室溫放置五分鐘，加入100μl BCP(BP.151,MRC)溶液，以Vortex混勻至成粉紅色溶液後，室溫放置15分鐘，再以15,000g離心15分鐘在4℃。離心完後，eppendorf內會分三層，下層是紅色層，中間一層薄薄的白色層，上層是透明層，將上層吸出放入新的1.5ml eppendorf中，吸取過程中要小心不要吸到另外兩層。於新的eppendorf中加入0.5ml isopropanol，搖勻後，室溫放置30分鐘，之後再以15,000g離心10分鐘在4℃，將上清液抽出，不要吸到pellet，加入1ml 75% ethanol清洗，再以15,000g離心10分鐘在4℃，抽掉ethanol後，空氣乾燥10分鐘，以含有DEPC的水回溶後即完成RNA萃取。吸取適量RNA，加入NCode cDNA synthesis Kit(A11193-050,Invitrogen)，以PCR machine完成RT後加入GoTaq Green Master Mix(M7122,Promega)跑PCR，PCR設定條件因不同Primer之不同Tm值而略有調整。分析跟幹細胞相關未分化之相關基因，像是oct4,nanog,sox2,cMyc,Lin28,hTERT等，本專利分析oct4,sox2,klf4,nanog,utf1,hTERT和控制組基因GAPDH。分析各基因所使用之primer如下表所列：

實施例二、添加PRGF於無血清培養基用以放大培養成體幹細胞 1. 脂肪基質血管細胞群分離

本發明用以研究之臨床人類檢體共四例，分別以編號BN456812、BN262813、BN726415、BN998619稱之。

所分離之基質血管細胞群進一步培養成脂肪幹細胞，培養與繼代記錄如後所述。

2. 脂肪幹細胞培養

脂肪幹細胞以無血清培養基培養，方法如上述；在培養過程中，依照PRP之定量結果，於每毫升培養基中添加相當於1x10⁷血小板分離所得之PRGF，比較有無添加PRGF之細胞生長曲線及細胞定性結果。。本發明之細胞無血清培養收得細胞數記錄如下表所列：

將上表之實驗數據畫成細胞生長圖(如圖一)，可以明顯看出有添加PRGF之細胞培養組，相較於沒有添加的組別，細胞生長較快。細胞在早期代數生長時(P0~P1)，因細胞較年輕，容易維持自我更新，兩組間在細胞數上沒有顯著差異；然而，隨著繼代，細胞漸趨老化後，因為PRGF中富含生長因子，推測可以幫助幹細胞訊息傳遞啟動，維持幹細胞自我更新的能力，所以生長速率仍可維持。

若將細胞數換算成細胞放大倍率(表二)，更可以清楚的看到，到第二代時，細胞數已經差到兩倍以上；到第3代，細胞數在有添加跟沒添加PRGF得組別有顯著的差異(如圖二)；幹細胞在維持不分化生長時，需要自分泌(autocrine)和旁分泌(paracrine)彼此作用，調控訊息傳遞的進行；細胞在無血清的培養環境下，容易改變原有的特性，因為無血清培養環境不像血清可以提供很多生長必須的生長因子與細胞激素，甚至還有些微量礦物元素等，若長期培養在這樣惡劣的環境下，細胞會失去原有在生理環境下的一致性(identity)；PRGF的功用即在於供給許多種類的自體生長因子與細胞激素，或是一些微量化學物質等，這些東西對於幫助脂肪幹細胞旁分泌訊息傳遞是不可或缺的，對於長時間體外維持一致性(long-term maintenance)，幹細胞訊息傳遞(stemness signaling pathway)的進行與交互影響十分重要。

表二、脂肪幹細胞生長放大倍率之數據表列(平均±標準偏差，n=4)

脂肪幹細胞在 體外培養時，可以藉由型態觀察判斷細胞的狀態，從脂肪幹細胞型態了解其生長狀況和分化狀態。脂肪幹細胞在培養時屬於貼附型細胞，具有類似纖維母細胞的梭狀細胞型態。本發明中，利用無血清環境培養之脂肪幹細胞型態正常，在早期繼代數(P0~P1)，有添加和沒有添加PRGF之培養組別中，脂肪幹細胞都呈現正常的梭狀細胞型態，不過已經可以看出有些微的差異；沒有添加PRGF的組別中，有些遊走型態的細胞，型態上不規則，偶為細長，偶為大而扁平，所能達到的細胞密度也較低(如圖三A)；然而，在有添加PRGF的組別當中，細胞型態圓而小較為一致，核質比大且細胞密度較高(如圖三B)。細胞培養到後期代數(如P3)的時後，細胞在型態上的差異也越趨明顯，沒有添加PRGF的細胞會變得比較細長，越趨不規則，也會發現有些細胞的細胞質有皺摺且細胞攤平，這些是典型細胞老化或是基因沉默(gene senescence)的現象(如圖四A)；反之，有添加PRGF的培養組別，細胞排列規則，側向排列(lateral association)的行為良好，細胞型態圓而小，很貼近初代細胞的細胞型態(如圖四B)。

從細胞培養型態觀察總結可以發現，有添加PRGF的細胞型態較沒添加的圓而小，較貼近未分化的狀態(undifferentiated state)；另外，發現能長到比較滿的細胞密度，有添加PRGF時，細胞在P3前可以達到約55,000cells/cm²，也反映在細胞生長變快，細胞數較多。

3. 脂肪幹細胞定性 3.1 細胞表面抗原分析

於無血清培養下放大之脂肪幹細胞，以流式細胞儀分析表面抗原， 可以發現細胞族群為CD34^-、CD45^-、HLADR^-、CD44⁺、CD73⁺、CD90⁺，為類似間質幹細胞的細胞族群。在培養的過程中，細胞的族群會越來越純，可以從流式細胞儀FSC對SSC的點狀圖中觀察到(如圖五、圖六)，點越密集，代表族群越集中。統計實施例之細胞分析結果，結果記錄於表三：

脂肪幹細胞在培養過程中，如果型態不健康、不一致、培養狀況不良如有死細胞等，都會影響到流式細胞儀的分析結果。有添加PRGF的培養組別中，FSC對SSC的點狀圖可以看到群落集中(如圖六)，相較下，沒有添加PRGF的組別，則群落較為分散(如圖五)。另外，有添加PRGF的培養組別在CD73和CD90的表現量上較高，且表現的強度較一致，分析圖中的峰比較尖(如圖六)，也呼應到細胞的形態觀察上比較一致。在後期代數的培養上(如P7)，細胞型態容易變形，這型態變化會反應在CD73和CD90的染色結果上，如CD73和CD90的染色結果比較低，則可能暗指說細胞沒有維持在不分化的生長狀態。

將細胞表面抗原的表現量用統計分析後，發現添加PRGF培養脂肪幹細胞之組別較容易維持細胞之一致性，代表脂肪幹細胞的細胞標記表現比例都比未添加PRGF的組別高(如圖七)；其中CD44高3.2%(n=7, p=0.033)；CD73高3.3%(n=7,p=0.0425)；CD90高2.9%(n=7,p=0.079)；三個負向之細胞標記表現量均低。CD44扮演著細胞間互相溝通、影響的功能；CD90是多種幹細胞會表現的細胞標記；CD73是一種幹細胞會表現的酵素。在細胞狀態維持一致時，這些表面標記的表現量會一致，而且脂肪幹細胞都會表現；反之，如果細胞特性改變，則細胞標記表現也會隨之改變。細胞體外大量無血清培養時，需維持良好之一致性，經過添加PRGF之培養方法較未添加的方法，在維持幹細胞表面抗原的表現上有更好的效果。

3.2 幹細胞基因表現分析

利用RT-PCR分析脂肪幹細胞的基因表現，特別針對六種幹細胞基因(stemness gene)作分析，可以發現oct4、sox2、nanog、klf4、utf1和htert都會在脂肪幹細胞中表現，oct4、sox2、nanog是幹細胞中重要的轉錄因子(transcription factor)，會調控、啟動很多下游基因的表現，對於維持幹細胞自我更新是必須的；klf4也是一個在胚胎幹細胞和間質幹細胞中都有的重要蛋白質，對於維持幹細胞的效價扮演著重要的功能。2007年日本的yamanaka和美國的Thomson等人也利用這些基因的組合成功的將體細胞引導成近全能型幹細胞(induced pluripotent stem cells,IPS cells)，說明這些基因對於幹細胞的重要性。此外，實驗結果也並且可以發現如果有添加PRGF，較容易維持utf1和htert的基因表現(如圖八和圖九)，意指脂肪幹細胞在無血清培養下添加PRGF時，可以維持細胞生長和不分化的狀態；utf1全名是undifferentiated transcription factor 1，意即幹細胞未分化時會表現的轉錄因子，會調控其他幹細胞基因的表現；htert全名是human telomerase reverse transcriptase，是人類端粒酶反轉錄酵素，可以延長人類端粒縮短的時間，跟人類細胞的壽命有直接的關係。

3.3 脂肪幹細胞分化

體外培養之脂肪幹細胞具有分化成中胚層細胞的能力，像是脂肪和骨頭細胞，實施例中證實利用PRGF所培養出來的脂肪幹細胞可以分化成脂肪和骨頭，具有間質幹細胞的分化能力，且實驗發現脂肪細胞的分化能力很強，只需要分化七天即有大量油滴產生，可能是因為來源是脂肪幹細胞的關係(如圖十、圖十一、圖十二、圖十三)。

4. 自體生長因子PRGF定量

利用定量檢體中血小板的數目間接定量PRGF的濃度。CD41為血小板會表現的表面抗原，在PRGF的製作過程中，血小板會破裂，使得血小板中的物質釋放到PRGF溶液中，其中含有許許多多的生長因子，包括VEGF、PDGF-BB、FGF2等，本實施例用流式細胞儀分析樣品中會表現CD41的顆粒，另外再加上內參考組，利用公式即可算出CD41+顆粒的實際數量。BN456812的PRGF血小板含量為4371顆/μl、BN262813的PRGF血小板含量為94101顆/μl、BN726415的PRGF血小板含量為53995顆/μl、BN998619的PRGF血小板含量為11028顆/μl。

上列詳細說明係針對本發明之一可行實施例之具體說明，惟該實施例並非用以限制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更，均應包含於本案之專利範圍中。

綜上所述，本案所提供之無血清成體幹細胞放大培養技術，具有上述多項功效，應已充分符合新穎性及進步性之法定發明專利要件，爰依法提出申請，懇請 貴局核准本件發明專利申請案，以勵發明，至感德便。

圖一、脂肪幹細胞細胞於無血清培養下有無添加PRGF之生長情形。P0為初代培養，P1為繼代第一代，依此類推。實施例於培養角瓶中以無血清培養四天後，繼代算細胞，白色的組別為沒有加PRGF的組別，灰色的組別為有加PRGF的組別。

*：-/+ PRGF組別有顯著差異(p<0.05)，n=4，t-test單尾統計。

圖二、脂肪幹細胞細胞於無血清培養下有無添加PRGF之生長放大倍率圖。P1/P0為初代到第一代的放大倍數，P2/P0為初代到第二代的放大倍率。實施例於培養角瓶中以無血清培養四天後，繼代算細胞，白色的組別為沒有加PRGF的組別，灰色的組別為有加PRGF的組別。

*：-/+ PRGF組別有顯著差異(p<0.05)，n=4，t-test單尾統計。

圖三、BN998619之P1細胞培養在無血清下第四天之相位差放大照片(200X)，(A)沒有添加PRGF，(B)有添加PRGF。

圖四、BN726415之P3細胞培養在無血清下第四天之相位差放大照片(200X)，(A)沒有添加PRGF，(B)有添加PRGF。

圖五、BN262813之P7細胞於無血清且沒有添加PRGF的培養基下培養四天後，以流式細胞儀分析CD34、CD45、HLADR、CD44、CD73、CD90等表面抗原標記之表現，並利用CellQuest軟體作分析。

圖六、BN262813之P7細胞於無血清，添加PRGF的培養基下培養四天後，以流式細胞儀分析CD34、CD45、HLADR、CD44、CD73、CD90等表面抗原標記之表現，並利用CellQuest軟體作分析。

圖七、脂肪幹細胞於無血清培養下有無添加PRGF之表面抗原之表現比率。在無血清培養下四天後以流式細胞儀分析CD34、CD45、HLADR、CD44、CD73、CD90等表面抗原標記之表現，白色的組別為沒有加PRGF的組別，灰色的組別為有加PRGF的組別。

*：-/+ PRGF組別有顯著差異(p<0.05)，n=4，t-test單尾統計。

圖八、BN456812、P2細胞之幹細胞基因表現。利用RT-PCR檢驗脂肪幹細胞，之後以洋菜膠電泳分析(agarose gel electrophoresis)。M代表Marker，左邊圖為有添加PRGF的組別，右邊圖為沒有添加PRGF的組別。縮寫對照：G：gapdh,347bp；S：sox2,139bp；O：oct4,103bp；N：nanog,142bp；K：klf4,182bp；U：utf1,117bp；T：htert,258bp；M：marker

圖九、BN262813、P3細胞之幹細胞基因表現。利用RT-PCR檢驗脂肪幹細胞，之後以洋菜膠電泳分析(agarose gel electrophoresis)。M代表Marker，Marker左邊七行為沒有添加PRGF的組別，右邊七行為有添加PRGF的組別。縮寫對照：G：gapdh,347bp；S：sox2,139bp；O：oct4,103bp；N：nanog,142bp；K：klf4,182bp；U：utf1,117bp；T：htert,258bp；M：marker

圖十、BN456812之P2細胞進行(A)脂肪細胞與(B)骨母細胞分化至第14天；200倍放大，明視野。

圖十一、BN262813之P5細胞進行(A)脂肪細胞與(B)骨母細胞分化至第14天；200倍放大，明視野。

圖十二、BN726415之P3細胞進行(A)脂肪細胞與(B)骨母細胞分化至第14天；200倍放大，明視野。

圖十三、BN998619之P2細胞進行(A)脂肪細胞與(B)骨母細胞分化至第14天；200倍放大，明視野。

Claims (13)

1. 一種體外無血清成體幹細胞放大培養之方法，該方法包含下列步驟：步驟一：提供一人體組織；步驟二：以酵素水解步驟一所得之組織，並以離心方式將未水解之組織與人類成體幹細胞予以分離；步驟三：將人體之血液離心分離獲得血漿層及血小板層，依照血漿對血小板之體積比為1：2.5之比例吸取該血漿，並再依照葡萄糖酸鈣對該血漿之體積比為0.3：1之比例將葡萄糖酸鈣與該吸取之血漿混合，離心取上清液，再將該上清液加入該血小板中反應以形成自體生長因子；步驟四：將步驟二所得人類成體幹細胞於無血清幹細胞培養液中進行初代培養，該無血清幹細胞培養液含有體積比例為0.1~10%之該步驟三之自體生長因子(PRGF)；步驟五：取出步驟四中初代培養液中之黏貼型細胞，於含有體積比例為0.1~10%之該自體生長因子(PRGF)之無血清幹細胞培養液進行繼代培養，以完成人類成體幹細胞放大培養。
2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該人體組織係選自於臍帶、骨髓、胎盤、脂肪、血液及乳牙所組成的群組。
3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中用以水解人體組織之酵素為胰蛋白分解酵素或膠原蛋白分解酵素。
4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該初代培養之步驟係進行3至15日。
5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該含有自體生長因子之無血清幹細胞培養液，係添加分離自自體血液之自體生長因子(PRGF)於無血清幹細胞培養液中。
6. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該步驟更包含：以流式細胞儀確認初代培養及繼代培養之人類成體幹細胞之表面抗原標記特徵。
7. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中經過繼代培養後之人類成體幹細胞仍保持在實質未分化的狀態。
8. 一種培養人類成體幹細胞之無血清成體幹細胞培養液，其係包含體積比例為0.1~10%之申請專利範圍第1項所述之步驟三之自體生長因子(PRGF)。
9. 如申請專利範圍第8項所述之培養液，其中該含有自體生長因子之無血清培養液，係添加分離自自體血液之自體生長因子(PRGF)於成體幹細胞培養液中。
10. 如申請專利範圍第8項所述之培養液，其中該自體生長因子(PRGF)是由人類自體血液分離純化後所獲得者。
11. 如申請專利範圍第8項所述之培養液，其係用以進行人類成體幹細胞之初代培養及繼代培養。
12. 如申請專利範圍第8項所述之培養液，其中該人類成體幹細胞係選自於臍帶血幹細胞、骨髓幹細胞、胎盤幹細胞、脂肪間葉幹細胞、人類血液細胞及乳牙幹細胞所組成的群組。
13. 如申請專利範圍第8項所述之培養液，其中經過繼代培養後之人類成體幹細胞仍保持在實質未分化的狀態。