TWI535377B - Storage, culture and application of umbilical cord tissue and its derived cells - Google Patents

Storage, culture and application of umbilical cord tissue and its derived cells Download PDF

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Description

臍帶組織及其衍生細胞之儲存、培養及應用
本發明是關於一種臍帶組織及其衍生細胞之儲存、培養及應用，尤其係指一種可提升臍帶衍生細胞培養之回收率以及提升臍帶衍生細胞多樣化之可能性的處理方法，再者，本發明亦關於一種利用上述方法所處理之臍帶碎塊、臍帶衍生細胞或其萃取物及其醫藥組成物、生物分子與相關應用用途。
幹細胞是指原始的未分化的細胞，保有再生及分化為其它類型細胞的能力。依據幹細胞分化程度，可以分為全能幹細胞(Totipotent/Omnipotent stem cells)、萬能幹細胞(Pluripotent stem cells)、多能幹細胞(multipotent stem cells)以及專一性幹細胞(Unipotent)。
全能幹細胞(Totipotent/Omnipotent stem cells)可分化為單一個體，來自於剛分化為數細胞的受精卵。
萬能幹細胞(Pluripotent stem cells)可以發育成多種組織，來自於全能幹細胞發展而成之三胚層。
多能幹細胞(multipotent stem cells)只能分化成特定組織或器官等特定族群細胞，成人組織中的幹細胞多屬此類。
專一性幹細胞(Unipotent)只能產生一種細胞類型，但相對於非幹細胞，還是具有自我更新之能力。
另外，胚胎幹細胞(embryonic stem cell)因為可以不停增生並且可以分化為所有組織形式，所以被認為有較大應用潛力。然而，由於取得胚胎幹細胞有道德上之問題，因而幹細胞研究逐漸轉向由非胚胎來源的成人組織取得成人幹細胞(adult stem cell)。雖然成人幹細胞較為組織專一性且複製能力較低，但仍具有相當多的分化潛力。目前取自於骨髓、脂肪、真皮以及臍帶血的非胚胎幹細胞已經有許多研究證實其可以在體外分化為許多細胞，例如軟骨細胞(chondrocytes)、脂肪細胞(adipocytes)、造骨細胞(osteoblasts)、成肌細胞(myoblasts)、心肌細胞(cardiomyocytes)及星狀膠質細胞(astrocytes)、等。
而在非來自胚胎的幹細胞中，例如臍帶血、臍帶以及胎盤等，由於取得過程不具侵入性，成為重要的幹細胞來源。其中臍帶基質瓦頓氏凝膠(Wharton’s Jelly)由於含有相當豐富的幹細胞，成為許多細胞組織庫儲存幹細胞之標的來源。
然而，欲取得上述之幹細胞，一般習知的方式，主要係先自臍帶目標組織中取得幹細胞或前驅細胞後進行超低溫儲存，其取得幹細胞或前驅細胞的方式必須藉由臍帶組織去進行細胞培養，不但所需處理時間長，且一旦目標幹細胞自臍帶組織分離後，原本之臍帶組織即於幹細胞凍存前丟棄無法再利用，未來即使科學技術進步發展，亦無再取得該臍帶組織其它部位潛在細胞之機會。
除此之外，目前的臍帶組織保存方式並未將臍帶進行細碎化處理，僅僅是將整條臍帶或大片段之臍帶組織加入抗凍溶液後直接進行超低溫儲存，儘管再解凍進行培養仍可獲得細胞，但由於整條臍帶或大片段之臍帶組織無法與抗凍溶液充分作用，使其細胞在超低溫儲存過程中受到低溫破壞，故解凍培養後回收的細胞數量相當有限，倘若欲進行繼代培養以達到細胞擴增(Cell Expansion)之目的，必須投入相當之人力、時間及成本，恐將耽誤移植病患之最佳移植時機，對於其迫切之移植需求產生相當大的風險。
因此，仍需要一有效方法可以快速進行臍帶處理，並能於需要細胞時進行解凍後培養使用，以供足量之多來源細胞用於再生醫學、組織工程或科學研究上之應用。
為解決目前臍帶儲存方式以及幹細胞取得方式所產生的缺失，本發明人特致力於臍帶組織及其衍生細胞之儲存、培養方法及其相關應用之開發，終於開發出本發明。
本發明之主要目的在於提供一種臍帶組織處理方法，該方法包含下列步驟：(a)取得臍帶後於體外將該臍帶細碎化，獲得臍帶碎塊；(b)將該臍帶碎塊加入抗凍溶液予以混合，獲得一混合物；以及 (c)將該混合物進行溫度緩降後儲存於超低溫儲存狀態中。
該臍帶組織處理方法亦包括：(d)將該超低溫儲存之混合物取出、解凍，並與一溶液進行反應混合(incubation)，以恢復其臍帶碎塊之狀態；以及(e)培養該臍帶碎塊，以獲得臍帶衍生細胞。
該臍帶組織處理方法更包括：(a’)在步驟(b)之前，將該臍帶碎塊以溶液清洗或加入酵素處理。
其中，該臍帶碎塊係不大於2mm，該臍帶碎塊與該抗凍溶液係在不大於15℃之溫度下進行混合，混合的時間可不大於60分鐘，該抗凍溶液係不包含動物衍生成份(animal-derived component)但該動物排除人類。舉例而言，該臍帶碎塊與該抗凍溶液可在0℃~10℃或不大於4℃之溫度下混合20至40分鐘。
本發明之另一目的在於提供一種利用上述方法所處理的臍帶碎塊、臍帶衍生細胞或其萃取物及其醫藥組合物、生物分子與相關應用用途。
本發明之又一目的在於提供一種組織庫，其包含由上述方法所處理的臍帶碎塊。
在本發明中，所提供之方法可用於收集臍帶組織後進行臍帶碎塊凍存，並於有需求時可進行解凍培養，並依據解凍時之需求進行細胞培養及分化，未來可應用於包含但 不限於科學研究、組織重建、細胞治療、疾病治療、癌症腫瘤治療以及自體和異體移植等，任何適合由幹細胞、前驅細胞應用的狀況或疾病，皆可由本發明中的臍帶碎塊、臍帶衍生細胞或是萃取物所治療。
再者，一般習用之臍帶衍生細胞儲存方式係先由臍帶組織進行細胞培養，之後即進行細胞凍存，此方式之缺點在於該臍帶組織於培養後隨即丟棄不再利用，故培養所獲得之細胞多樣性便會受限於培養時的知識與技術，無法隨著科技進展再從該臍帶組織培養獲得更多元化之細胞種類。
另外，習用之臍帶組織儲存方式係直接將整條臍帶或大片段之臍帶組織直接凍存，需要時，再進行解凍以及細胞培養，此方式之缺點則在於抗凍溶液無法充分滲透於臍帶組織中，使得細胞在凍存過程中不易獲得充分保護，造成解凍後細胞回收率較低。
故，本發明將臍帶組織以超低溫儲存並可於解凍後培養細胞之方法，一方面可改善習用臍帶衍生細胞取得、儲存方式之缺點，於臍帶組織解凍後依當時之技術及需求進行細胞培養，藉此，將可能隨著科技進展而獲得更多樣化之細胞種類；另一方面則透過將臍帶組織予以細碎化，使得抗凍溶液充分滲透於臍帶組織，藉以保護細胞不受到低溫傷害，進而提升組織解凍後細胞培養之回收率，改善了習用臍帶組織儲存方式之缺失。
本發明係相關於一種臍帶組織處理的方法。主要包含先提供並收集臍帶，將所收集的臍帶加以細碎化而獲得臍帶碎塊後，可直接進行超低溫儲存或臍帶衍生細胞的培養，或選擇將細碎化的臍帶碎塊加入分解酵素以進行酵素消化分解，再進行臍帶碎塊的超低溫儲存，或臍帶衍生細胞的培養。
本發明係一種臍帶組織處理方法，該方法包含下列步驟：(a)取得臍帶後於體外將該臍帶細碎化，獲得臍帶碎塊；(b)將該臍帶碎塊加入抗凍溶液予以混合，獲得一混合物；以及(c)將該混合物進行溫度緩降後儲存於超低溫儲存狀態中。
本發明為了儲存臍帶組織，通常在胎兒出生後，包含但不限於人類嬰兒，立即收集臍帶或是相連結的部份，並送至實驗室於無菌的狀態下處理臍帶；臍帶處理的典型方法包含移除殘留於其上的血液，並以酒精和合適的緩衝液，例如磷酸鹽緩衝液(Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline,DPBS)，清洗數次之後，再藉由包含但不限於切割的方式，將臍帶細碎化為較小的片段，得到臍帶碎塊，再將該臍帶碎塊以超低溫儲存(Cryopreservation)。
此處所使用的「超低溫儲存」一詞，通常是指將細胞或組織以低於-150℃以下的溫度進行保存，例如以氣態或是液態氮將細胞或組織儲存於-196℃。相關技術可由習知技藝人士所進行，並且使用冷凍保護劑包含但不限於二甲亞楓(Dimethyl sulfoxide,DMSO)、甘油(glycerol)、乙二醇(ethylene glycol)、丙二醇(propylene glycol)、蔗糖(Sucrose)、海藻糖(Trehalose)或葡萄聚醣(Dextran)等，並且以溫度緩降，如程式遞降的方式，減緩細胞內冰晶的形成與降低滲透壓的傷害，進一步保護細胞或組織不受超低溫儲存的破壞。
此處所使用的「臍帶衍生細胞」一詞，是指任何得自臍帶組織的經過培養、增生或分化後所得的細胞，包含但不限於間質細胞、內皮細胞、上皮細胞、纖維母細胞或分化後的細胞(例如硬骨細胞、軟骨細胞、血管內皮細胞、脂肪細胞、肝細胞、神經細胞、上皮細胞或肌肉細胞)；再者，該臍帶組織衍生細胞係得自於任何哺乳動物，例如鼠科、犬科、貓科或是靈長類動物，在此最佳實施例為人類嬰兒臍帶組織。
臍帶衍生細胞所使用的培養液與試劑如習知技藝所使用者：適合用於組織凍存的例子包含但不限於Dulbecco’s改良細胞培養液(Dulbecco’s modified eagle medium,DMEM)，RPMI培養液，Hanks平衡鹽溶液(Hank’s Balanced salt solution,HBSS)和磷酸鹽緩衝液(Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline,DPBS)。在一些實施例中，以後者較佳。
此外，本發明所提供的方法更包含：(d)將該超低溫儲存之混合物取出、解凍，並與一溶液進行反應混合(incubation)，以恢復其臍帶碎塊之狀態；以及(e)培養該臍帶碎塊，以獲得臍帶衍生細胞。
再者，本發明所提供的方法更包含：(a’)將該臍帶碎塊以溶液清洗或加入酵素處理。
此處「酵素處理」一詞是代表加入酵素包含但不限於胰蛋白酶(Trypsin)、膠原蛋白酶(Collagenase)、中性蛋白酶(Dispase)、膠酶(Gelatase)、玻尿酸酶(Hyaluronidase)或其混合組成物；以該等酵素將該臍帶碎塊進行更均一的細碎化，並加入培養液中，小心使臍帶衍生細胞自臍帶碎塊移出(Migrate)和外殖(Explant)。在此最佳實施例為使用胰蛋白酶。
在上述方法中，該臍帶碎塊係不大於2mm，該臍帶碎塊與該抗凍溶液係在不大於15℃、0℃~10℃或不大於4℃之溫度下進行混合，混合的時間可不大於60分鐘或介於20至40分鐘，具體如介於25~35分鐘或28~32分鐘，該抗凍溶液係不包含動物衍生成份(animal-derived component)但該動物排除人類。
在一實施例中，本發明提供無血清/血漿的臍帶碎塊處理及儲存流程，並且可以在臍帶碎塊解凍之後，於培養液 中添加接受移植者之血清、血漿或血小板添加劑(Platelet Rich Plasma,PRP)，以進行解凍後的組織處理或細胞培養。
組織儲存時採用自體血清/血漿為最佳狀況，然而收集臍帶組織時，被收集者仍為嬰兒，當下不適合採集足量之血液以進行血清/血漿之製備，故只能採用其他來源血清/血漿或無血清/血漿方式處理及儲存。然而，使用其他血清/血漿仍有其缺點，故使用無血清/血漿方式處理及儲存為最佳之方式。
如前文所述，臍帶碎塊的儲存流程使用其他血清/血漿之其缺點在於：
1.有同種異體病原感染之風險。其中同種異體病原包含但不限於人類後天免疫不全症候群病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)或其他同種異體的感染；雖可進行血清/血漿之感染性病原與安全性檢測，但可能出現空窗期或是受限於科技極限而有無法檢測或偽陰性風險。
2.有異種病原的污染之風險。異種病原包含但不限於變異的prion蛋白質所造成的新型庫賈氏症(new variant Creutzfeldt-Jakob Disease,nvCJD)汙染或其他異種病原的感染；
3.可能產生免疫反應，如過敏或排斥反應。在許多臨床經驗亦證實，於移植前的處理及儲存流程中使用異種的血清，會造成過敏反應；或是殘留的 物質附著於移植物上，造成對移植物的排斥反應，進一步造成移植的失敗。
上述所提之風險，雖可於不同處理階段進行管控，但現有技術仍有其限制，故本發明更進一步提供一種選項，可於移植前採集實際接受移植者之血液以進行血清/血漿之製備，提供臍帶碎塊的解凍處理或進一步進行細胞培養，以減少上述感染或移植失敗之風險，提供最佳移植物給待移植病患，提升最佳移植效果。
本發明亦提供一種含血清或無血清的抗凍溶液，提供臍帶碎塊進行超低溫儲存，在此含血清的抗凍溶液配方可包含但不限於使用人類臍帶血血清(human umbilical cord blood serum)或周邊血血清混合抗凍劑所製備成的抗凍溶液；在此不含血清的抗凍溶液配方可包含但不限於使用白蛋白(Albumin)或血漿蛋白質(Plasma protein Fraction,PPF)混合抗凍劑所製備成的抗凍溶液。
保存與儲存真核細胞，特別是哺乳類動物細胞的方法與流程，為習知技藝者所知，而本發明更進一步的改良此流程，將臍帶組織細碎化獲得臍帶碎塊，加入抗凍溶液混合均勻後，以自動化緩降儀器包含但不限於BIOARCHIVE®，緩降程式遞降儀，或以手動緩降方式將臍帶碎塊以液態氮或氣態氮進行溫度緩慢遞減及超低溫儲存，減緩細胞內冰晶的形成與降低滲透壓的傷害，進一步降低對於細胞之傷害；並於解凍後進行臍帶衍生細胞之培 養；在此最佳實施例為解凍後的臍帶碎塊經培養後，其培養出的臍帶衍生細胞的生長不受超低溫儲存後影響。
又在一實施例中，本發明証實臍帶衍生細胞源自臍帶碎塊移出和外殖，同時也證實在臍帶組織細碎化的過程當中，其細碎的程度未到達單一個細胞的大小，因此臍帶碎塊仍然是以多個細胞所組成組織型態，同時也證實所培養的臍帶衍生細胞是由臍帶碎塊所衍生出來的，細碎化的過程中也不會釋出單一細胞。
以本發明所培養出的臍帶衍生細胞可進行純系繁殖(Clonal expansion)與繼代培養(Sub-culture)，在此，該臍帶衍生細胞之最佳實施例為臍帶間葉幹細胞。
如上述「純系繁殖」(Clonal expansion)一詞，此技藝不限於特定的方法，通常是藉由在適合特定細胞增生的培養液中培養臍帶衍生細胞，而達到誘導細胞培養出單一特定族群的方式，相關的培養液可以由許多供應商購得，或者，培養液可含有誘導細胞增生的試劑或營養因子(nutrient factor)，包含但不限於生長因子(Growth factors)，例如上皮生長因子，類胰島素生長因子和胰島素等，或細胞激素(cytokines)，例如幹細胞因子(Stem cell factor,SCF)、血小板生成素(Throbopoientin,TPO)和FMS樣酪氨酸激酶3配體(Flt3-Ligand,Flt3L)等，以任何適合的組合，進行特定細胞的純系繁殖。
如上述「繼代培養」(Sub-culture)一詞，將培養細胞從培養器皿中取出，把一部分細胞移至新的培養器皿中再進行培養，這種培養方式亦稱為傳代培養或連續培養。
在一實施例中，本發明所獲得之臍帶衍生細胞具有如胚胎幹細胞的特性；該臍帶衍生細胞可被分化成任何形式的細胞，包含但不限於硬骨細胞、軟骨細胞、血管內皮細胞、脂肪細胞、肝細胞、神經細胞、上皮細胞或肌肉細胞的變異與衍生物。
如「胚胎幹細胞的特性」一詞，指的是該臍帶衍生細胞具有如胚胎幹細胞可分化為所有細胞或組織形式的能力，表示其為潛能幹細胞；在一實施例中，臍帶衍生細胞表現胚胎幹細胞早期標記基因，或可偵測到有助於細胞增生的相關訊息路徑之基因表現，在此，該臍帶衍生細胞之最佳實施例為臍帶間葉幹細胞。
在一實施例中，本發明利用臍帶碎塊所培養出來的臍帶衍生細胞，或是經過誘導分化過後的細胞，可作餵食層(Feeder layer)的角色，當其與造血幹細胞共同培養時，可促進造血幹細胞之增生；在此，該臍帶衍生細胞之最佳實施例為臍帶間葉幹細胞，其可分化為網狀內皮細胞(reticular endothelial cells)、纖維母細胞(Fibroblast)、脂肪細胞(Adipocytes)和骨母細胞前驅細胞(Osteogenetic precursor cell)等，該等細胞可組成基質細胞(Stromal cell)，該基質細胞一方面可提供細胞之間的接觸(cell to cell interaction)，另一方面又可提供營養因子，包括細胞生長 因子(Growth factors)、細胞激素(cytokine)和基質蛋白質(matrix proteins)；藉此，將臍帶間葉幹細胞與造血幹細胞進行共同培養時，即可提供有助於造血幹細胞增殖的微環境(Microenvironment)，而促使造血幹細胞增生。
根據以上所述，本發明亦是關於以上述方法得到取自臍帶碎塊、臍帶衍生細胞或其萃取物之醫藥組合物，是用於協助免疫調節、降低移植引發之移植體對宿主反應(Graft-versus-Host Disease,GVHD)、降低宿主對移植物之排斥反應或加強植入率(Enhance engraftment)。其中該醫藥組合物可包含自該臍帶衍生細胞或造血幹細胞所分化的細胞。該醫藥組合物可為任何種類，且通常包含該臍帶碎塊、臍帶衍生細胞、造血幹細胞、自其所分化的細胞或細胞分泌物、或是臍帶碎塊/臍帶衍生細胞/造血幹細胞之萃取物與合適的治療上可接受的載體。在細胞分泌的例子中，可直接於上清液取得所需的生物分子，或是藉由純化與濃縮的方式取得相關生物分子，進一步添加於該醫療組合物中，並且，該醫藥組合物是用於系統性或局部性的應用。
該醫藥組合物適合用於系統性應用的製備為熟悉此技藝人士所知，其中該臍帶碎塊/臍帶衍生細胞/造血幹細胞或萃取物使溶解於緩衝液中，例如可用於注射或是浸泡。適合用於局部應用的醫藥組合物可以是液體或是黏稠形式，包含凝膠、軟膏、霜或乳液及其相似物。
本發明的臍帶衍生細胞/造血幹細胞可分化為所要的形式，例如但不限於硬骨細胞、軟骨細胞、血管內皮細胞、 脂肪細胞、肝細胞、神經細胞、上皮細胞或肌肉細胞的變異與衍生物；原則上任何適用由臍帶碎塊/臍帶衍生細胞/造血幹細胞所治療之狀況或疾病，皆可由本發明的臍帶碎塊/臍帶衍生細胞/造血幹細胞、萃取物或其所分化之細胞所治療；而該等疾病是選自於該欲被治療的疾病可為先天性或後天性的缺陷，選自硬骨、軟骨、神經、肌肉、心血管、上皮、脂肪、肝、肺、胰臟、癌症腫瘤、克隆氏症(Crohn's disease)及免疫相關疾病或缺陷所組成的群組。因此，本發明亦是關於治療有疾病之個體的方法，投予該個體有效量的上述臍帶碎塊/臍帶衍生細胞/造血幹細胞、其萃取物或其所分化之細胞。
在另一醫療使用中，本發明的臍帶衍生細胞/造血幹細胞可被使用於基因治療，可將一蛋白質之核苷酸編碼送入該細胞中轉型(Transform)，可使用熟之此技藝之人士所知的任何一種方法，將核苷酸送入細胞中，例如使用病毒載體、化學藥劑或含有轉染組合物之脂質(Lipsome)。藉由本發明之細胞作為載體細胞，以達基因治療之目的。
與以上敘述一致的另一醫療使用，本發明的臍帶衍生細胞/造血幹細胞可用於產生任何生物分子，所述的生物分子可以是細胞中產生的任何自然生物分子，或是藉由細胞轉型(Transform)的技術送入的核苷酸分子所產出的生物分子。該生物分子包含但不限於核苷酸、蛋白質、脂質或糖類。
本發明描述至此，其實施不限於此處所描述者，因此，所使用「包含」一詞並不具限制作用，此外，此處所使用的詞句是用以描述本發明而非限制本發明，且其用詞並不排除所顯示的特徵之均等物，因此在本發明所主張的範圍之內，可有不同的修飾，同時可了解本發明之較佳實施例所揭露的訊息，熟知此技藝人士當知本發明的實施例與變化，任何修飾與變化仍落於本發明所主張的範圍之內。
實施例一 製備培養臍帶衍生細胞之細胞培養液
本實施例之細胞培養液具有以下幾種態樣：
態樣一：以市售細胞培養液為之。
態樣二：以市售細胞培養液培養細胞株，獲取含有細胞分泌物質之細胞培養液後，稀釋或取代原有之市售培養液。
態樣三：以市售細胞培養液添加細胞培養添加劑。
態樣四：態樣二加細胞培養添加劑。
其中，該市售細胞培養液包含但不限於RPMI、IMDM、DMEM、α-MEM、F12K、McCoy’s 5a、X-VIVO 10或其他習知技藝者常用的細胞培養液。
該細胞株包含但不限於人類臍帶內皮細胞株(HUVEC)、小鼠基質細胞株(MS-5)或人類基質細胞株(Human stoma cell line)。
該細胞培養添加劑包含但不限於胎牛血清(FBS)、小牛血清(FCS)、人類周邊血血清、臍帶血清和血小板添加劑(Platelet Rich Plasma,PRP)、細胞生長因子例如介白素 -3(IL-3)、介白素-6(IL-6)、TPO、FltL-3、SCF、上皮細胞生長因子(EGF)、TGF-β、鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)等、丙酮酸鈉(Sodium Pyruvate)、葡萄糖(Glucose)、L-麩胺酸(L-Glutamine)或HEPES。
實施例二 臍帶組織的處理
取得臍帶後，將該臍帶以酒精及磷酸緩衝液進行數次的清洗，以滅菌的器械截取適當長度的臍帶組織，再利用不銹鋼剪刀、組織均質器或研磨器具等，將該臍帶組織進行細碎化作業，以獲得臍帶碎塊，該臍帶碎塊之大小係不大於2mm。
另外，可選擇加入酵素輔助消化臍帶碎塊，並在酵素作用之後，並以酵素抑制劑，包含但不限於胰蛋白酶抑制劑(Trypsin inhibitor)、含有血清之培養液，或是含EDTA的緩衝溶液來抑制或終止酵素的活性；透過此酵素處理之步驟，可將該臍帶碎塊予以均質化，以利後續之臍帶衍生細胞培養。
其中，該酵素可為胰蛋白酶(Trypsin)、膠原蛋白酶(Collagenase)、中性蛋白酶(Dispase)、膠酶(Gelatase)、玻尿酸酶(Hyaluronidase)或其混合組成物；該含有血清之培養液所使用血清為人類血清(human serum)或禽畜血清。
在本實施例中，係使用胰蛋白酶(Trypsin)及/或膠原蛋白酶(Collagenase)進行酵素處理，血清則使用人類臍帶血清或胎牛血清。
最後，將未經過或經過酵素處理後之臍帶碎塊，經磷酸緩衝液清洗後，加入抗凍溶液進行超低溫儲存，或是不加入抗凍溶液而直接進行臍帶衍生細胞的培養。
請參考第三圖所示，針對不同處理組別進行細胞相對數量比較臍帶經細碎化處理過後，有無酵素處理或超低溫儲存，培養所獲之臍帶衍生細胞數量。
另外，為了讓臍帶碎塊能夠作臨床上的應用，本發明可搭配下述之品質管制方式，提供一組織儲存(Banking)的方法，該品質管制方式係包含各式檢測項目，包含但不限於黴漿菌檢測(Mycoplasma test)，內毒素檢測(Endotoxin test)、微生物檢測(Sterile test)與感染病原檢測，其中，感染病原檢測包含檢測人類後天免疫不全症候群病毒抗體(Anti-HIV)、B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、C型肝炎病毒抗體(Anti-HCV)、人類T細胞淋巴病毒抗體(Anti-HTLV)、巨細胞病毒抗體(CMV IgG)、梅毒血清反應(RPR)以及各類未列舉但可能為影響儲存品質或是任何有感染性風險的各項檢測事項。
實施例三 抗凍溶液的製備與臍帶碎塊超低溫儲存
抗凍溶液具有以下幾種態樣：態樣一：緩衝溶液或細胞培養液加抗凍劑；態樣二：態樣一加血清；態樣三：態樣一加蛋白質。
其中，該緩衝溶液係可為磷酸緩衝液(DPBS)；該細胞培養液係可為DMEM培養液；該抗凍劑係可為二甲基亞碸 (Dimethyl sulfoxide,DMSO)、甘油(glycerol)、乙二醇(ethylene glycol)或丙二醇(propylene glycol)；該血清係可為人類血清或動物血清；該蛋白質包含但不限於白蛋白(Albumin)或血漿蛋白質(Plasma protein Fraction,PPF)。
再者，該抗凍溶液更可添加醣類，包含但不限於蔗糖(Sucrose)、海藻糖(Trehalose)或葡萄聚醣(Dextran)。
在本實施例中，態樣一之抗凍溶液為DMEM培養液或DPBS加上DMSO或甘油(glycerol)；態樣二之抗凍溶液係以態樣一佐以人類臍帶血清或胎牛血清；態樣三之抗凍溶液則使用態樣一與白蛋白或血漿蛋白質(Plasma protein Fraction,PPF)混合所製備而成；故該抗凍溶液係可不包含動物衍生成份(animal-derived component)但該動物排除人類。
將臍帶碎塊與上述抗凍溶液在0℃~10℃之溫度下進行混合，混合的時間係介於28~32分鐘，均勻混合後，以可密封的抗凍容器進行儲存，並以含自動化溫度緩降程式儀器包含但不限於BIOARCHIVE®液態氮自動化儲存槽和緩降儀/程式遞降儀來進行溫度緩降，最佳實施例為使用BIOARCHIVE®液態氮自動化儲存槽。
請參考第四圖所示，針對不同處理組別進行細胞相對數量的比較，可得知凍存前後無顯著差異。由此可以證實，臍帶經細碎化處理過後，不論有無超低溫儲存，培養所獲得之臍帶衍生細胞數量並未產生顯著的差異，亦即，凍存後之臍帶碎塊經解凍、培養所獲得臍帶衍生細胞數量，並 未因凍存而產生負面影響，故本實施例所提供之抗凍溶液與凍存方式，能夠使凍存後解凍之臍帶碎塊經培養後獲得之臍帶衍生細胞數量，無異於凍存前之臍帶碎塊。
實施例四 新鮮臍帶碎塊與凍存臍帶碎塊培養之臍帶衍生細胞生長狀況比較
如實施例一，製備可培養臍帶衍生細胞之細胞培養液，並將臍帶碎塊置於培養盤，七天後觀察自臍帶碎塊所外殖的臍帶衍生細胞生長狀況，其具有紡錘外型並且可以在體外快速的生長。
請參考第一(A)至(E)圖所示，其說明將臍帶碎塊經過不同的處理程序，將臍帶碎塊培養於培養液七天後，以光學顯微鏡放大四十倍後拍攝成之照片。
第一(A)圖為臍帶組織細碎化後獲得臍帶碎塊，再以酵素消化一段時間後，加入酵素抑制物，包含但不限於胎牛/人類血清/大豆蛋白質萃取物，以緩衝液或培養液清洗數次與離心去除消化酵素後，加入培養液培養，並每隔三到七天更換新鮮的培養液，培養七天獲得一臍帶衍生細胞之照相圖。
第一(B)圖是將臍帶碎塊以酵素消化並去除酵素活性後，將均質化的臍帶碎塊放入含有抗凍劑的抗凍溶液中，並注入抗凍管/袋，以迴轉式震盪器於低溫的環境下均勻搖晃後，再以自動化的冷凍儲存設備，以溫度緩降的方式將凍存的組織降溫至攝氏-196℃後，超低溫儲存至少一週後，解凍並加入培養液培養臍帶衍生細胞七天後之照相圖； 第一(C)圖是將新鮮的臍帶碎塊加入培養液後培養臍帶衍生細胞之照相圖。
第一(D)圖則是如上述方式以超低溫儲存臍帶碎塊，解凍臍帶碎塊並以酵素消化該臍帶碎塊後，加入如實施例一之細胞培養液，培養七天獲得一臍帶衍生細胞之照相圖。
第一(E)圖是如上述方式以超低溫儲存臍帶碎塊，解凍臍帶碎塊加入培養液後培養臍帶衍生細胞之照相圖。
從第一(A)、(B)、(C)、(D)及(E)圖中，可以觀察得知，凍存後的臍帶碎塊相較於新鮮的臍帶碎塊，不論是否經過酵素處理，其培養獲得之臍帶衍生細胞在細胞型態上均沒有顯著的差異。
實施例五 新鮮臍帶碎塊與凍存臍帶碎塊培養之臍帶衍生細胞特性比較
將收集後的臍帶衍生細胞經磷酸鹽緩衝液沖洗後分別與抗體(採購於BD公司)CD13、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC、HLA-DR、7AAD或SSEA-4進行反應，上述抗體上均預先結合有異構硫氰酸鹽螢光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)、藻紅素(phycoerythrin,PE)或藻紅素與花青素複合染劑(Phycoerythrin-Cyanine Dyes 5,PE-Cy5)。最後，再使用流式細胞儀進行檢測並分析上述臍帶衍生細胞的表面抗原。
請參考第二(A)至(C)圖所示，其中(A)代表臍帶碎塊凍存前以酵素處理再解凍培養之臍帶衍生細胞、(B)代表臍帶碎塊凍存後再解凍以酵素處理並培養之臍帶衍生細胞、(C) 代表臍帶碎塊凍存前後均不經酵素處理再解凍並培養之臍帶衍生細胞，此三種不同處理流程所得之臍帶衍生細胞的前方散射光(Forward Scattering,FSC，代表細胞大小)及側方散射光(Side Scattering,SSC，代表細胞顆粒性)大致上具有相同的性質。
請參考第四圖所示，該圖說明臍帶碎塊在凍存前與凍存後，計算繼代培養的細胞倍增時間，公式為：細胞倍增時間=(培養時數)X Log2/Log(終止培養細胞數/起始培養細胞數)，結果可知經過本發明技術所凍存之臍帶碎塊，解凍後再培養而獲得之臍帶衍生細胞，其細胞倍增時間與新鮮培養無顯著差異。
實施例六 臍帶衍生細胞係自臍帶碎塊中移出(Migrate)和外殖(Explant)
從實施例五所獲得的臍帶碎塊，將其與緩衝溶液混合後得到一混合物後，以無菌孔徑為100μM的細胞過濾篩(Cell Strainer，BD公司購得)，將混合物分為臍帶碎塊與通過之懸浮液(Flow through)，分別收集並加入培養液，以培養臍帶衍生細胞，第五圖顯示從臍帶碎塊去培養臍帶衍生細胞的組別，可觀察到臍帶衍生細胞的生長，從懸浮液則無法培養出任何細胞。
故在此實施例中，可證實臍帶衍生細胞從臍帶碎塊中移出(migrate)和外殖(explant)，而非自游離細胞直接生長而成。
實施例七 臍帶組織有無細碎化之比較
取得臍帶後，將該臍帶以酒精及磷酸緩衝液進行數次的清洗，以滅菌的器械截取適當長度的臍帶組織後不經細碎化，直接以實施例三所述方式，將臍帶組織進行超低溫儲存五到七天後，解凍培養臍帶衍生細胞；另外，如實施例二方式所獲得之臍帶碎塊解凍後培養臍帶衍生細胞；之後，比較相同來源的臍帶組織有無細碎化後所獲得之臍帶衍生細胞移出(migrate)外殖(explant)之細胞群落數量。
請參考第六A圖所示，如上述方式加入細胞培養液，培養十天後，並比較臍帶組織細碎化前後所獲得移出(migrate)外殖(explant)之細胞群落數量。統計結果顯示，臍帶組織經過細碎化後取得一臍帶碎塊，其培養出的細胞群落數(Colony Forming Unit,CFU)顯著多於未經過細碎化處理的臍帶組織。
請參考第六B圖所示，如上述方式，將培養出的臍帶衍生細胞以錐藍(Trypan blue,Invtrogen)和細胞計數盤(hemocytometer)計算細胞數。統計結果顯示，臍帶組織經過細碎化後取得之臍帶碎塊，其培養出的初代細胞(P0)數顯著多於未經過細碎化處理的臍帶組織。
由此可以證實，臍帶組織經過細碎化後再培養細胞，可較快提供足量移植所需之細胞量，進而減少耽誤移植病患之最佳移植時機，降低等待移植時間所造成之風險。
實施例八 反轉錄聚合反應偵測胚胎幹細胞早期標記基因和其他功能性基因
取得臍帶衍生細胞後，以Rneasy Mini Kit(QIAgen公司)進行RNA的萃取並進行cDNA的反轉錄，並偵測胚胎幹細胞早期標記基因及有助於細胞增生的相關訊息路徑基因。
請參考第七圖偵測胚胎幹細胞早期標記基因，為BMP4、OCT4、REX1、SOX2和Nanog；第八B圖偵測針對有助於細胞增生的相關訊息路徑，在此較佳的實施例包含：IGF-2訊息路徑例如IGF-2和IGFBP5，FGF訊息路徑例如FGF-1和FGF-2，Gap訊息路徑例如Panx-1和Panx-2，Wnt訊息路徑例如Wnt5a、SFRP1和DKK3，上皮間充質轉換基因(epithelial to mesenchymal transition,EMT)例如β-SMA、Osteopontin、CK18、E-cadherin、Twist、BMP-2、BMP-4和TGF-b1，表面黏著分子(Adhesion molecule)例如N-cadherin和β-catenin，以及其他基因例如angptl-1、angptl-2、dlk和mKirre，內部對照組則為GAPDH。
實施例九 臍帶衍生細胞與造血幹細胞的共同培養
熟習本技術領域之技藝者已知造血幹細胞的來源包含但不限於人類臍帶血和周邊血，在此最佳實施例為使用人類臍帶血。
並以單核球細胞分離液(Ficol-Paque)去除紅血球與顆粒細胞，在此最佳的實施例為使用由GE公司所購得的FICOL-PAQUETM Plus。
再以磁力活性細胞分類法(magnetic activated cell sorting,MACS)將細胞進行純化與分離，在一最佳實施例 中，使用CD34細胞分離套組(CD34 microbeads,MiltenyiBiotec公司)與強力磁鐵進行造血幹細胞的純化與分離。
將臍帶衍生細胞進行繼代培養後，將該臍帶衍生細胞接種於六孔細胞培養盤中，在95%溼度的37℃二氧化碳培養箱中培養數天後，更換培養液、添加營養因子並與有CD34抗原表現的造血幹細胞共同培養一週，每隔兩到三天再更換或添加培養液，最後以錐藍(Trypan blue,Invitrogen)和細胞計數盤(hemocytometer)計算細胞數；在本實施例中，該營養因子包含但不限於幹細胞因子(Stem cell factor,SCF)、血小板生成素(Throbopoientin,TPO)和FMS樣酪氨酸激酶3配體(Flt3-Ligand,Flt3L)。
請參考第八A圖所示，上述臍帶衍生細胞與造血幹細胞共同培養後，可觀察到圓石形成(Cobble stone forming)之現象，由此可以證實，臍帶衍生細胞與造血幹細胞共同培養後，可促進造血幹細胞的增生。
實施例十 將臍帶組織衍生細胞分化成脂肪細胞
自臍帶碎塊培養臍帶衍生細胞，為了將其分化成脂肪細胞，將臍帶衍生細胞培養至長到約百分之百的覆蓋程度，並且以無血清的培養液飢餓培養四十八小時。將臍帶衍生細胞置於脂肪誘導培養液培養四週，再將該細胞進行油紅-O染色(Oil-Red)。
該脂肪誘導培養液如習之技藝者所知，包含DMEM/血清、抗生素(鏈四環黴素和盤尼西林)、異丁純-甲基黃嘌呤 (isobutylmethyl xanthine)、地塞松(dexamethasone)、胰島素以及吲哚美洒辛(indomethacin)。
如第九A圖所示，將誘導分化四週後的細胞進行油紅-O染色，染色顯示加入脂肪誘導培養液之細胞，其可被油紅-O染上，產生正結果，顯示該細胞被分化為脂肪細胞。故由此可證實本發明之臍帶衍生細胞具多能性，且可以分化成脂肪細胞。
實施例十一 將臍帶組織衍生細胞分化成軟骨細胞
自臍帶碎塊培養臍帶衍生細胞，為了將其分化成軟骨細胞，將臍帶衍生細胞培養於DMEM/血清，以如先前所述之繼代培養方式收取細胞後，培養於軟骨誘導培養液培養二到三週，並且每三天更換軟骨誘導培養液；再將軟骨組織進行冷凍切片與阿利新藍(Alcian blue)染色。
該軟骨誘導培養液包含DMEM/血清、抗生素(鏈四環黴素和盤尼西林)、地塞松(dexamethasone)、丙酮酸鈉(Sodium pyruvate)和TGF-β3。
將冷凍切片以醋酸(Acetate)浸潤後，加入阿利新藍(Alcian blue)染色後，以二次水潤洗數次後，加入預先製備好的Nuclear fast red染劑染色，再以二次水潤洗數次除去多餘的染劑，以封片膠(Entellan)封片後以光學顯微鏡放大四十倍觀察。
如第九B圖所示，為臍帶衍生細胞誘導分化成軟骨細胞的冷凍切片並以阿利新藍(Alcian blue)染色之照相圖，染色顯示加入軟骨誘導培養液之細胞，其可被阿利新藍(Alcian blue)染上，產生正結果，顯示該細胞被分化為軟骨細胞。故由此可證實本發明之臍帶衍生細胞具多能性，且可以分化成軟骨細胞。
實施例十二 將臍帶組織衍生細胞分化成血管內皮細胞
自臍帶碎塊培養臍帶衍生細胞，為了將其分化成血管內皮細胞，將細胞培養液質，例如MATRIGELTM或是膠原蛋白質均勻的覆蓋於細胞培養皿的表面，再將收取下來自臍帶碎塊所培養的臍帶衍生細胞，以適當的細胞密度將細胞培養於培養基上，並加入血管內皮細胞誘導培養液(EGM-2)培養數天後，觀察細胞生長的情形。
第九C圖是說明將臍帶衍生細胞誘導分化成血管內皮細胞後，以光學顯微鏡放大四十倍觀察的結果；由細胞的型態中可以觀察到，細胞延伸後，細胞與細胞之間產生了連結，並產生網狀脈絡之型態，顯示其細胞已具有血管內皮細胞之特性。
第十A至十F圖是說明以流式細胞儀觀察臍帶衍生細胞誘導分化前後的細胞大小、顆粒性變化以及細胞表面抗原表現的變化；由第十A及十D圖的結果中可以觀察到細胞經過誘導分化後期顆粒性與大小已有明顯的變化；而從第十B、十C、十E及十F圖可以觀察到，在表面抗原表現的部分，將臍帶衍生細胞誘導分化前後的細胞分別以VEGF-R2和VE-Cad的抗體進行染色，結果顯示皆有正向的表現，顯示其已具有血管內皮細胞之特性。故由此可證實本發明之臍帶衍生細胞具多能性，且可以分化成血管內皮細胞。
上述實施例僅係為了方便說明而舉例而已，本發明所主張之權利範圍自應以申請專利範圍所述為準，而非僅限於上述實施例。
第一(A)圖至第一(E)圖分別顯示先僅以酵素處理、超低溫凍存前以酵素處理、無超低溫凍存且無酵素處理、超低溫凍存後以酵素處理、以及僅超低溫凍存處理衍生自經切碎的臍帶組織碎塊之細胞顯微照片。
第二(A)圖至第二(C)圖分別顯示螢光活化細胞分類(FACS)或流式細胞法分析超低溫凍存前先以酵素處理、超低溫凍存後以酵素處理、以及僅超低溫凍存處理衍生自經切碎的臍帶組織碎塊之細胞結果。
第三圖顯示超低溫凍存前後未經或經酵素處理衍生自經切碎的臍帶組織碎塊之細胞數。
第四圖顯示超低溫凍存前後衍生自經切碎的臍帶組織碎塊之細胞的倍增時間。
第五圖顯示經切碎的臍帶組織碎塊(左圖)與其濾液(右圖)之培養結果的顯微照片。
第六A圖至第六B圖顯示衍生自經切碎的臍帶組織碎塊與未經切碎的臍帶組織段塊之細胞數及細胞群落數。
第七圖為幹細胞標幟基因之RT-PCR分析結果。
第八A圖為經切碎的臍帶組織碎塊與造血幹細胞混合培養中所形成之圓石(cobble stone)顯微照片。
第八B圖為細胞增殖相關之訊息傳導途徑的RT-PCR結果。
第九A圖至第九C圖顯示分別分化自經切碎的臍帶組織所衍生的幹細胞之脂肪細胞、軟骨細胞與血管內皮細胞顯微照片。
第十A圖至第十F圖顯示螢光活化細胞分類(FACS)或流式細胞法分析經血管發生(vasculogensis)誘導前(第十A圖至第十C圖)後(第十D圖至第十F圖)之細胞結果。

Claims (12)

  1. 一種臍帶組織的儲存方法，該方法包含下列步驟：(a)將一離體的臍帶細碎化，獲得臍帶碎塊；(b)加入酵素處理該臍帶碎塊；(c)將經過酵素處理的該臍帶碎塊加入含抗凍劑與蛋白質的抗凍溶液予以混合20至40分鐘，獲得一含該臍帶碎塊的混合物；以及(d)將該混合物進行溫度緩降後儲存於超低溫儲存狀態中。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該臍帶碎塊係不大於2mm的尺寸。
  3. 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，其中該臍帶碎塊與該抗凍溶液混合的時間介於25至35分鐘。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該酵素為胰蛋白酶(Trypsin)、膠原蛋白酶(Collagenase)、中性蛋白酶(Dispase)、膠酶(Gelatase)、玻尿酸酶(Hyaluronidase)或其混合組成物。
  5. 如申請專利範圍第1或2項所述之方法，其中該臍帶碎塊與該抗凍溶液混合的時間介於28至32分鐘。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該臍帶碎塊與該抗凍溶液係在不大於15℃之溫度下進行混合。
  7. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該臍帶碎塊與該抗凍溶液係在0℃~10℃之溫度下進行混合。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該抗凍溶液係包含二甲基亞碸(Dimethyl sulfoxide,DMSO)、甘油(glycerol)、乙二醇(ethylene glycol)或丙二醇(propylene glycol)。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該臍帶碎塊與該抗凍溶液係在不大於4℃之溫度下進行混合。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該蛋白質係白蛋白(Albumin)、人類血清(human serum)或血漿蛋白質(Plasma protein Fraction,PPF)。
  11. 如申請專利範圍第1項所述之方法，更包括：以酵素抑制劑抑制該酵素分解。
  12. 一種自臍帶取得臍帶組織衍生幹細胞的方法，該方法包含下列步驟：(a)將一離體的臍帶細碎化，獲得臍帶碎塊；(b)加入酵素處理該臍帶碎塊；(c)將經過酵素處理的該臍帶碎塊加入含抗凍劑與蛋白質的抗凍溶液予以混合20至40分鐘，獲得一含該臍帶碎塊的混合物；(d)將該混合物進行溫度緩降後儲存於超低溫儲存狀態中；(e)對該含臍帶碎塊的混合物解凍；以及(f)於一培養液中培養該臍帶碎塊，以獲得一臍帶組織衍生幹細胞。
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