KR20100084620A - 조직 재생을 위한 세포 조성물 - Google Patents

Abstract

인간 텟줄의 혈관 주위 조직으로부터 인간 전구 세포를 추출하는 방법이 제공된다. 상기 추출된 세포는 그 후 백혈구 줄기 세포와 함께 공-배양되고 뼈를 포함한 인간 조직의 성장 및 회복에 유용한다. 또한 이와 관련된 조성물 및 방법이 포함된다.

Description

조직 재생을 위한 세포 조성물 {CELL COMPOSITION FOR TISSUE REGENERATION}

본 발명은 탯줄의 연결 조직으로부터 급격히 증식되는 인간 세포의 개체군의 수확에 초점이 맞춰진 것으로, 백혈구 줄기 세포와 함께 이러한 세포들을 함께 공-배양하고 다양한 세포 기반의 치료에 유용한 방법, 이와 관련된 조성물에 관한 것이다.

와튼 (Wharton)의 젤리로부터의 치료 세포 혼합물의 획득은 잘 알려져 있다. 하지만, 각각의 경우에 제대혈의 어떠한 흔적이라도 제거되는 것을 보증하는 것은 매우 많은 비용 및 매우 많은 시간을 요하는 과정이다. 본 발명은 이러한 문제점에 대한 부담이 없다. 본 발명은 백혈구 줄기 세포와 함께 와튼의 젤리로부터 유래된 세포를 함께 배양한다.

탯줄은 다음의 장배형성 (gastrulation, 세가지 배아 배종층의 형태)을 형성하는 제 1 구조 중 하나이다. 폴딩 (folding)이 시작되면서, 배아 디스크는 상기 배꼽 혈관 (umbilical vessel)을 형성하도록 차례로 성장하는 난황 (vitelline) 및 요막 혈관 (allantoic vessel)을 통해 초기의 난황난 (york sac, 배외 기원(extra-embryonic origin))으로 초기의 중장 (midgut, 배아 기원) 까지 연결되게 된다 (Haynesworth et al., 1998; Pereda and Motta, 2002; Tuchmann-Duplesis et al., 1972). 이러한 혈관은 일반적으로 와튼의 젤리 (WJ)로 불려지는 주요 배외 유도체의 초기의 간엽 (mesenchymal) 조직으로 여겨지는 것에 의해 지지되고 둘러 싸여진다 (Weiss, 1983). 이러한 초기 단계에서, 상기 탯줄은 출생시 볼 수 있는 30-50 cm의 줄이 되도록 임신 중에 성장한다. 그러므로, WJ는 문헌으로 기술되는 (이하 참조) 섬유 아세포 같은 것 또는 근섬유 아세포 같은 것들 뿐만 아니라, 배아 및 태아 성장 중에 상기 줄의 성장을 지지하는데 필요한 WJ의 증식 부피의 세포로 성장을 부여할 수 있는 전구 세포 (progenitor cell) 개체군 또한 포함하는 것으로 기대될 수 있다.

WJ는 1656년에 그의 논문 Adenographia에 게재된 토마스 와튼에 의해 먼저 개시되었다. (Wharton T W. Adenographia. Translated by Freer S. (1996). Oxford, U.K.: Oxford University Press, 1656; 242-248). 이는 순차적으로 히알루론 산 (hyaluronic acid)(Schoenberg et al., 1960) 및 콜라겐의 다른 타입 (Nanaev et al., 1997)을 포함하는 프로테오글리칸 (proteoglycan)을 구성하는 비정질 기반 물질에서 분산되는 세포로 구성된 젤리같은, 성긴 점액질의 연관 조직으로서 정의되어 왔다. 매트릭스에서 분산된 세포들은 붕괴된 줄에서 방사상 형태이고 증식된 줄에서 길어지는 "섬유 아세포와 같은 것 (fibroblast-like)"으로 정의되어 왔다 (Parry, 1970). 부드러운 근육 세포는 표면적으로 부드러운 근육 세포와 비슷한 어느정도 "특이한 섬유 아세포 (unusual fibroblast)"로서 그것을 기술한 패리 (Parry, 1970)에 의해 이의 제기되었지만 초기에 매트릭스 내에서 관찰되었다 (Chacko and Reynolds, 1954). 그 후에, Takechi et al. (1993)이 이러한 세포들에 대한 면역 조직 화학적 연구를 수행했을때 인 1993년 까지 이러한 세포들을 특징화하는 연구가 별로 수행되지 않아 왔었다. 그들은 세포들을 "비정질 기반 물질에서 콜라겐 섬유의 물결 네트워크 및 긴 세포질의 공정과 함께 방추 또는 방사상 형태"였던 "섬유 아세포와 같은 것"으로서 기술하였다 (Takechi et al. 1993). 면역 조직 화학적 염색을 위해, 그들은 어떠한 타입의 미오신 (myosin)이 WJ 섬유 아세포와 관련되는 것인지를 결정하기 위해서 액틴 (actin) 및 미오신 (세포질의 수축성 단백질), 비멘틴 (vimentin, 배아 간엽 기원의 섬유 아세포의 특징) 및 데스민 (desmin, 근원성 (myogenic) 기원의 세포로 특정되는)에 대한 항체를 최초로 사용하였다. 그들은 화학적으로 추출 가능한 액토미오신의 높은 레벨을 관찰하였다; 그리고 비록 섬유 아세포가 세포질의 액토미오신을 포함하지만 그들은 액틴 또는 미오신에 대해 염색되지 않는 반면에 WJ 섬유 아세포는 둘 다에 대해 분명히 염색되었다. 또한, 비멘틴 및 데스민 둘 다에 대한 분명한 염색은 WJ에서 이러한 수정된 섬유 아세포가 간엽 조직으로부터 유래된다는 결론에 이르도록 관찰되었다 (Takechi et al. 1993). 다음으로, Nanaev et al. (1997)에 의한 더 근래의 연구는 조산 줄 (pre-term cord)에서 증식하는 간엽 전구 세포의 구별의 다섯 단계를 증명하였다. 그들의 발견은 근섬유 아세포가 WJ 매트릭스 내에 존재한다는 제안을 지지했다. WJ의 세포의 면역 조직 화학적 특성은 뼈 형태 형성에서 골원성 세포의 주요 소스로 알려진 페리사이트 (pericyte)의 특징과 주목할만한 유사성을 보여주고, 또한 배양에서 단위 골 아세포 (CFU-O)(Aubin, 1998)를 형성하는 콜로니로서 언급되는 뼈 결절을 형성할 수 있다 (Canfeild et al., 2000).

최근의 간행물은 UC 혈액 보다는 UC로부터 세포를 수확하는 방법을 보고해오고 있다. Mitchell et al. (Mitchell et al. 2003)은 남은 조직을 수확하기 위해 배꼽 혈관을 먼저 제거하고 버리는 방법을 개시한다. 마지막에는, 남은 WJ (배꼽 혈관은 전체적으로 WJ에서 감싸지기 때문에 상기 혈관과 함께 버려질 수 있는 것의 부분) 및 양막 상피 둘 다를 포함할 것인 그 후 조직 배양 판으로 이동되는 작은 조직 조각을 생성하도록 조각난다. 이러한 조직 조각은 그 후 세포를 배양 기층 상으로 이송하는 주요한 외식 (explant)으로서 사용된다.

또 다른 간행물에서, Romanov et al. (2003)은 비록 그들이 또한 그들의 배양이 WJ로부터 세포를 포함하지 않는다는 것을 명시하였지만, 줄 혈관계로부터 간엽 줄기 세포와 같은 세포들을 고립시키는데 성공적이었음을 보여준다. 특별히, 그들은 혈관 내피세포 (vascular endothelial cell) 및 내피밑 세포(sub-endothelial cell)의 혼합된 개체수를 생산하는 배꼽 정맥 내에서부터 단일, 15분의 교원질 분해 효소 소화를 채용한다. Romanov et al.은 7일 후에 수확된 이러한 세포로부터 희박한 수의 섬유 아세포와 같은 세포가 나타나는 것을 보여준다.

본 발명은 백혈구 줄기 세포와 함께 혼합 배양되는 인간 전구 세포를 포함하는 세포 개체군을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 치료에 유용될 수 있는 인간 세포 혼합물을 제공함을 목적으로 한다.

여기서 인간 탯줄의 와튼 젤리에서 세포를 추출하기 위한 공정이 개발되었는데, 이 공정은 신속한 증식과 어떠한 주 조직 적합성 마커(인간 백혈구 항원(HLA) 이중 음성)도 발현하지 않는 면역 부적합 세포를 포함하는 골 모세포 및 다른 인간 전구 세포의 존재로 특징지어지는 독특한 세포군을 제공한다. 조혈 모세포와 함께 공-배양될 때 세포군은 뼈 및 연골조직, 지방, 및 근육을 포함하는 다른 결합조직으로 성장하고, 치료목적으로 환자에게 전구 세포를 자발적 및 동종 전달하기 위한 세포의 유용한 공급원이다.

보다 구체적으로, 본 발명의 한 면에 따르면, 와튼 젤리 추출물이 제공되는데, 이 추출물은 인간 전구 세포를 포함하고, 와튼 젤리의 혈관 주위 영역을 유용하게 경계짓는 영역에서 인간 탯줄의 맥관 조직 주위의 와튼 젤리의 효소적 소화에 의하여 얻어진다. 이 혈관 주위 영역 내 조직과 이로부터 추출되는 전구 세포가 또한 혈관 주위 조직으로 지칭될 수 있다. 추출 공정은 제대혈 세포, UC(탯줄)의 상피 세포 또는 내피 세포, 및 탯줄의 혈관 구조에서 유래된 세포가 본질적으로 없는 추출물을 생성하는데, 여기서 혈관 구조는 동맥 또는 정맥 혈관의 내막, 중막, 외막으로 정의된다. 생성된 추출물은 혈관 구조로부터 분리되었던 벌크 와튼 젤리 조직으로부터 분리된 다른 와튼 젤리 추출물과 또한 구별된다. 그 다음 이들 세포는 조혈 모세포와 함께 공-배양되어 조직 재생 혼합물을 생성해낸다.

관련된 다른 점에 있어서, 본 발명은 와튼 젤리 추출물에 존재하는 세포를 배양하여 이들을 조혈 모세포와 공-배양하여 얻어진 세포군을 제공한다. 이 공-배양은 t-플라스크와 같은 이차원 시스템 또는 바람직하기는 회전 벽 생체 반응기와 같은 삼차원 시스템에서 이루어질 수 있다.

한 구체예에서, 추출된 전구 세포군은 부착 조건 하에서 추출된 세포들을 연속 배양하여 얻어진 부착된 세포군으로 특징지어진다. 다른 구체예에서, 추출된 전구 세포군은 부착 조건 하에서 성장된 추출된 세포의 상층 분획 내에 존재하는 비-부착성(또는 "후-부착성")(PA) 세포군으로 특징지어진다. 이 PA 분획은 아직은 비-부착된 세포가 배양 표면에 부착될 수 있도록 하기 위하여 초기에 평판 배양된 HUCPV 세포의 상층액을 새로운 T-75 플라스크로 전달함으로써 유도된다. 이 공정은 새로운 T-75 플라스크로 반복되는데, 매질을 다른 새로운 T-75 플라스크로 전달하여 모든 남아있는 PA 세포를 수확하도록 한다. 본 발명에 따르면, 이 PA 세포군은 부착 조건 하에서 배양되고 그 다음 조혈 모세포와 함께 공-배양될 때 빠르게 증식하고 뼈 결절과 지방 세포를 자발적으로 형성하는 전구 세포의 서브-군을 포함한다. 이 구체예는 효소적 소화 세포군으로부터 분리된 부착 세포의 생산량을 증가시키는 수단을 제공한다.

다른 관점에서, 본 발명은 뼈 조직, 연골 조직, 지방 조직, 및 근육 조직을 포함하는 결합조직을 제조하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 이들 세포가 원하는 결합 조직 표현형으로 분화하도록 도움이 되는 조건으로 공-배양된 혼합물을 두는 단계를 포함한다. 이 점에서 본 발명은 또한 의학적 증상, 질병, 및 이상의 세포 이식-매개 치료를 포함하는 세포-기저 요법에서의 이러한 세포들의 용도를 제공한다.

보다 구체적으로, 본 발명의 다른 관점에 따르면 본 발명에 따른 세포 혼합물 또는 이들의 분화된 후손, 및 선택된 조직 부위에 이러한 세포들을 전달하기에 적절한 단체를 포함하는 조성물 및 조직 엔지니어링에서의 이의 용도를 제공한다.

본 발명의 이러한 면과 다른 면은 첨부된 도면과 관련하여 보다 구체적으로 설명될 것이다.

본 발명은 인간 전구 세포를 포함하는 신속하게 증식하는 세포군의 공급원으로서 와튼 젤리(WJ) 추출물을 제공한다.

도 1은 인간 UC에서 나타나는 세가지 분리 구역을 보여주는 광학 현미경 사진,
도 2는 콜라게나아제 용액 내의 고리 혈관을 대표적으로 보여주는 도면,
도 3은 폴리스티렌 조직 배양 표면으로 부착되었던 WJ로부터 고립된 세포의 광학 현미경 사진,
도 4는 CFU-O의 초기 형태를 보여주는 광학 현미경 사진,
도 5는 원숙한 CFU-O를 보여주는 광학 현미경 사진,
도 6은 35mm의 폴리스티렌 조직 배양 디쉬 상에서 UV 형광 하에 테트라시클린 라벨링된 CFU-O를 보여주는 도면,
도 7은 테트라시클린 라벨링된 CFU-O의 위상차 광 현미경 사진 및 형광 현미경 사진을 나란히 보여주는 도면,
도 8은 조직 배양 폴리스티렌 표면 상의 원숙한 CFU-O의 주사 전자 현미경 사진,
도 9는 근본적인 매트릭스를 드러내는 CFU-O의 단면의 주사 전자 현미경 사진,
도 10은 CFU-O의 앞쪽 에지에 위치되는 빛으로 광물화된 콜라겐 섬유의 주사 전자 현미경 사진,
도 11은 골원성 세포를 구별함으로써 폴리스티렌 계면에 누운 비-교원질 매트릭스(소구체로 보임)의 주사 전자 현미경 사진,
도 12는 원숙한 CFU-O의 중앙부를 포함하는 무겁게 광물화된 콜라겐의 주사 전자 현미경 사진,
도 13은 WJ-유도된 세포가 77.4% MCH I 및 MHC II 음성인 것을 증명하는 혈구계산 데이터의 흐름을 보여주는 도면,
도 14는 상세한 세포 밖의 매트릭스에 의해 둘러싸여지는 주변 세포의 다층의 일부 및 세포가 유래되어지는 (골세포) 콜라겐의 분포를 보여주는 뼈 결절의 마손의 트라이콤 염색된 (Masson's trichome-stained) 단면의 흑백 재생,
도 15는 승인된 골 전구 세포 모 집단 및 총 골 전구 세포 모 집단 의 증식과 관계되는 부착 혈관 주위 WJ 개체군의 잠재적 증식을 보여주는 도면,
도 16은 0-24시간으로부터의 유도기 (lag phase), 24-72시간으로부터의 대수기 (log phase) 및 72-120시간으로부터의 고조기 (plateau phase)를 갖는 정상 성장 곡선을 보여주는 0-144시간으로부터의 혈관 주위 WJ 세포의 증식을 보여준다. 전체 배양 주기 동안의 이배수 시간은 24시간이고, 반면 대수기 동안은 16시간이다,
도 17은 5개의 통과 수 이상을 나타낸 WJ 세포의 주 조직 적합성 집합체 (MHC) 수식, 자유 해동에 기한 그들의 수식의 변화 및 재배양에 기한 차후의 수식을 보여준다.
도 18은 HUCPV 세포의 CFU-F 빈도를 보여주는 도면,
도 19는 P0로부터 P9를 통해 HUPVC 세포의 이배수 시간을 보여준다. HUCPV 세포는 P2로부터 P8까지 상대적으로 안정하고 20 시간의 빠른 이배수 시간을 보여준다,
도 20은 10¹⁴ 을 초과하는 세포가 배양 30일 이내에 유래될 수 있는 것을 보여주는 HUPCV 세포의 증식을 보여준다. 이러한 빠른 증식은, 1000의 치료 용량 (TDs)이 배양 24일 이내에 생성될 수 있다,
도 21은 세포 수확에서 콜라게나아제 농도의 효과와 소화 시간을 보여주는 도면,
도 22은 본 발명의 바이오재생기의 전체적인 구조를 보여주는 사시도,
도 23은 본 발명의 적용을 보여주는 수평으로 회전하는 세포 배양 용기를 통해 부분적인 단면을 보여주는 도면,
도 24는 도 23의 23--23 라인을 따라 얻어진 단면도,
도 25는 도 24의 24--24 라인을 따라 얻어진 단면도이다.

본 발명은 인간 전구 세포를 포함하는 신속하게 증식하는 세포군의 공급원으로서 와튼 젤리(WJ) 추출물을 제공한다.

본 명세서의 목적을 위하여, 추출된 세포군 부분은 인간 탯줄 혈관 주위(HUCPV) 세포로 지칭될 수 있다. HUCPV 세포군은 표현형, 구체적으로 그 내부에 함유된 세포 서브군의 다양성에 의해 나타나는 표현형이 독특한 다능성 전구 세포의 농축 공급원을 구성한다. 또한, 본 명세서의 목적을 위하여, 본 발명에 따른 세포가 추출되는 와튼 젤리의 혈관 주위 영역이 혈관 주위 조직으로 지칭될 수 있다.

본 명세서에서, "전구 세포(progenitor cell)"라는 용어는 제어된 및/또는 정해진 조건 하에서 주어진 표현형을 갖는 세포로 분화될 세포를 지칭한다. "전구세포"는 또한 분화에 추가하여 자가-재생 능력으로 특징지어진다. 이 자가 재생의 특징은 "증식"으로 지칭된다. 따라서, 골 모세포는 골 아세포 혈통으로 진행되어, 이러한 진행과 분화를 위하여 수립된 조건 하에서 배양될 때 궁극적으로 뼈 조직을 형성할 전구 세포이다. "면역 부적합" 또는 "비면역원성"인 전구 세포는 클래스 I 및 클래스 II 주 조직 적합성 복합체(MHC)와 연관된 표면 항원에 음성인 표현형을 갖는 세포이다. 이러한 전구 세포는 본 명세서에서 또한 HLA 이중 음성으로 지칭될 수 있다.

WJ로부터 추출된 HUCPV 세포군은 또한 "빠른 증식"에 의하여 특징지어지는데, 이는 전구 세포 증식을 위한 기준인 조건 하에서 다른 알려진 전구 세포군에 비례하여 추출된 세포들이 성장하는 속도를 말한다. 본 명세서에 기재된 실험 결과 로부터 이해되고, 도 16에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 전구 세포군은 늦어도 약 25시간 내, 그리고 7-15시간에는 두 배가 될 수 있고, 따라서 다른 공지의 골 모세포군 및 WJ로부터 추출된 다른 전구 세포군보다 훨씬 더 빠르게 증식한다.

본 발명의 세포 및 세포군은 인간 탯줄의 WJ 유래 추출물에서 얻어질 수 있고 그 다음 제대혈 또는 말초혈 유래의 조혈 모세포와 함께 공-배양된다. 선행 기술과 달리, 본 발명에 따르면, 이러한 세포의 제1 그룹이 탯줄 맥관 구조의 외부 벽과 연관된, 즉 인접한 WJ로부터 추출된다. 예를 들면 탯줄 유래 와튼 젤리를 추출하거나 또는 탯줄 및 연관된 와튼 젤리 유래 혈관조직을 추출하기 위하여 행해지는 것처럼, 탯줄 맥관 구조의 외부 표면에 연관되거나 매우 가까운 와튼 젤리는 혈관 주위 영역을 한정하는 영역 내에 있고, 전형적으로는 탯줄로부터 혈관이 절단될 때 맥관 구조와 연관되어 남아 있다. 놀랍게도, 일반적으로 선행 기술에서의 실험시 폐기되어왔던, 이 혈관 주위 영역 내 와튼 젤리가 본 명세서에 기재된 특징들을 갖는 전구 세포의 농축된 공급원이라는 것이 발견되었다. 따라서, 본 발명은 HUCPV 세포라고 명명된 유용한 인간 전구 세포의 공급원으로서 와튼 젤리의 이 혈관 주위 영역 유래의 조직을 활용한다.

한 구체예에서, HUCPV 세포군은 기능성 간엽(비-조혈성) 표현형의 많은 마커 지표 갖는 전구 세포의 존재에 의하여 특징지어지며, 바람직하기는 다음 마커는 CD45-, CD34-, SH2+, SH3+, Thy-1+, 및 CD44+를 포함하는 이들 전구 세포에 존재한다. 다른 바람직한 마커들 또한 기능성 간엽 표현형을 동정하는데 사용될 수 있다. 바람직하기는 세포군은 혈관 주위 세포의 마커 지표인 3G5 항체에 양성인 세포를 갖는 것으로 특징지어진다. 추출된 세포군은 일반적으로 형태적으로 상동한 섬유 아세포군으로 이는 바람직하기는 알파-액틴, 데스민, 및 비멘틴을 발현하고, 예를 들면 세포 분류 원리와 기술에 기초하여, 이로부터 원하는 세포 서브군들이 배양 조건과 선별의 조작을 통하여 얻어질 수 있는 매우 유용한 공급원을 제공한다.

인간 탯줄로부터 이러한 혈관 주위 세포를 추출하기 위하여, 바람직한 구체예에서는 제대혈 세포, 탯줄의 상피 세포 또는 내피 세포, 및 탯줄의 혈관 구조 유래 세포-여기서 혈관 구조는 동맥 또는 정맥의 내막, 중막, 및 외막으로 정의된다-의 추출을 피하기 위하여 추출 공정 동안 주의가 기울여진다. 이들 원하지않는 세포가 본질적으로 없는 추출물을 얻는 바람직한 방법은 절개 전 탯줄의 세심한 수세(flushing) 및 세척, 이어서 탯줄 내로부터 혈관의 세심한 절개로 이루어질 수 있다. 다른 바람주위의 탯줄 조직으로부터 조심스럽게 혈관을 잡아당기는 것으로, 이 경우 혈관 주위 조직은 혈관과 함께 절제된다.이들 원하지 않는 세포들의 추출을 피하기 위하여 주의를 기울이지만 이들이 얻어진 추출물에 여전히 소량 존재할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 이들의 빈도가 너무 낮아서 여기 제시된 관찰된 결과들, 즉, 간엽 및 특히 중배엽 기원 유래 세포 콜로니의 관찰, CFU-F, CFU-O, 및 CFU-A의 형성 빈도 및 신속성, 및 배양된 세포군에서 관찰된 HLA 표현형의 특징을 방하지 않을 정도로 나타난다면 수용할만하다. HUCPV 세포군이 준비된 후에서야 조혈 모세포군과 함께 공-배양된다.

혈관 주위 영역 내에 있는 조직은 탯줄 맥관 구조의 외부 벽에 인접한 와튼 젤리이고, 전형적으로 혈관의 외부 벽으로부터 약 3mm까지 연장된 영역 내에 존재한다. 바람직하기는, 표적 추출 영역은 세 혈관 중 어느 하나의 외부 벽으로부터 약 2mm 내, 더 바람직하기는 약 1mm 내에 있을 수 있다. 이 영역에서 유래된 WJ 추출은 바람직하기는 실시예에 개시된 기술을 이용하여 쉽게 이루어질 수 있다. 실시예에 개시된 바람직한 구체예에서, 혈관은 WJ를 위한 담체로 사용되고, 혈관 그 자체가 전구 세포가 추출되는 기질로 사용된다. 따라서, 본 발명의 구체예에서 혈관 주위 조직의 얇은 코팅을 갖는 탯줄 혈관은 본질적으로 모든 제대혈 오염물을 완전히 제거하기 위하여 세척된 신선한 탯줄로부터 바람직하기는 외과적으로 또는 더 바람직하기는 손으로 절개된다. 그 다음 인접 혈관 주위 조직 함유 혈관 또는 이 구획이 바람직하기는 원하는 세포가 있는 혈관 주위 조직의 콜라겐 매트릭스를 소화하기에 적합한 효소를 함유하는 인산 완충염수(PBS)와 같은 추출 매질 내에서 약 37℃에서 배양된다. 이러한 목적을 위하여, 바람직하기는 약 0.1㎎/㎖ 내지 약 10.0㎎/㎖ 또는 그 이상의 범위, 더 바람직하기는 0.5㎎/㎖의 바람직한 농도에서의 콜라게나아제로의 소화가 적합하다. 효소 형태, 농도, 및 배양 시간은 다를 수 있고, 대안적 추출 조건이 선택된 조건 하에서 세포 표현형 및 세포군의 생산을 모니터하여 매우 간단하게 결정될 수 있다. 예를 들면, 바람직한 구체예에서, 또한 4㎎/㎖(예: 1-4㎎/㎖)의 더 높은 콜라게나아제 농도는 약 3시간(예: 1-5시간)의 더 짧은 소화 기간에 거쳐 적합하다. 추출 동안, 혈관 단부는 묶여지고, 바람직하게는 끈으로 묶여지거나 클립으로 고정되고, 혈관내에 함유된 제제에 의한 오염을 방지하기 위하여 추출 매질을 상류에서 현탁될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 와튼 젤리 추출물은 본질적으로 제대혈 세포, 탯줄 상피 세포, 혈관 내피 세포 및 혈관 평활근 세포가 없다는 것이 이해될 것이다.

분리 공정에서 사용될 수 있는 다른 바람직한 소화 효소 및 바람직한 농도는 예를 들면, 히알루로니다제 약 0.1 내지 10㎎/㎖, EDTA 및 트립신 약 0.05 내지 10㎎/㎖이다. 비록 덜 비싼 바람직한 대체물이 약 18-24시간 동안 약 0.5㎎/㎖ 사용될 수 있지만, 바람직한 콜라게나아제 농도는 약 3시간의 소화 기간 동안 약 4㎎/㎖이다. 콜라게나아제 농도에 대한 또 다른 바람직한 대안들이 도 21에 도시되어 있다. 바람직하기는, 도 21에 도시된 바와 같이 콜라게나아제 농도에 따라 다른 시점에서 일어나는, 혈관이 분해되기 시작하는 시점 또는 시작하기 전에 소화가 중단된다.

콜라게나아제 추출 매질 약 0.5㎎/㎖의 바람직한 구체예에서 약 24시간 후, 바람직하기는 12-36 시간 , 그리고 더 바람직하기는 18-24 시간, 또는 콜라게나아제 추출 매질 약 4.0㎎/㎖의 바람직한 구체예에서 약 3시간 후, 혈관이 제거되고, 인간 전구 세포를 함유하는 혈관 주위 조직 추출물이 남게된다. 이들 세포는 전구 세포 증식을 위한 기준조건 하에서 증식된다. 예를 들면 세포들은 폴리스티렌 디쉬나 플라스크와 같은 곳에서 부착된 세포를 선별하기 위하여 폴리스티렌 상에서 선별된 다음 적절한 배양 배지에서 유지될 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서는, 예를 들면 본 명세서에 참고문헌으로 삽입된 Baksh 등의 공지문헌, WO 02/086104에 기재된 바와 같이 교반되는 현탁액 조건 하에서 부착된 세포의 사전 선별 과정과 함께 또는 이 과정 없이 추출된 세포가 증식을 위하여 배양된다.

본 발명의 특정 구체예에서는, 추출된 HUCPV 세포군이 부착 조건 하에서 배양되고 그리고 상층액 내 비부착된 세포들이 추가 배양을 위하여 회수된다. 이들 "후-부착된(post-adherent)" 세포는 뼈 결절과 지방 세포를 자발적으로 형성하는 경향에 의한 서브군에 의하여 특징지어지고 본 발명의 유용한 구체예를 구성한다. 따라서, 이러한 점에서 본 발명은 혈관 주위 조직으로부터 추출된 단리된 전구 세포군을 추가로 제공하는데, 이 세포들은 뼈 세포, 연골 세포, 지방 세포, 및 근육 세포를 포함하는 여러 분화된 세포 형태 중 적어도 하나를 형성하는 경향을 가지고, 여기서 이러한 전구 세포는 부착 조건 하에서 배양된 HUCPV 세포의 비-부착성 분획을 구성한다. 예를 들면, 부착 조건 하에서 혈관 주위 조직-추출된 HUCPV 세포를 배양하고, 비-부착된 세포군을 선별하고, 그 다음 (1) 상기 군을 증식하거나 (2) 원하는 세포 표현형으로의 분화를 유발하기 위하여 유용한 조건 하에서 비-점착성 세포군을 배양하는 바람직한 방법에 의하여 이러한 세포들이 얻어진다. 유용한 배양 조건은 본 명세서에 예시된 바와 같이 증식과 분화를 위하여 이미 확립된 것들이다.

본 발명은 표준 부착 배양 조건 하에서 배양되고 증식된 HUCPV 서브군을 포함한다는 것이 또한 이해될 것이다. 이후 이들은 조혈 모세포와 함께 공-배양된다.

추출물 내에 존재하는 세포는, 바로 또는 증식 후에, 주어진 표현형의 세포가 농축된한 증식가능한 서브군을 제공하는 확립된 기술을 사용하여 분류될 수 있다. 따라서, 본 발명은 다능성 간엽 전구 세포, 골 모세포가 농축된 혈관 주위 조직 추출된 세포군, 전구 세포가 농축된 세포군, 및 다능 및 골 모세포가 농축된 세포군을 추가로 제공한다. 바람직하기는 상기 세포는 이에 대한 항체를 사용하여 혈관 주위 세포 마커인 3G5 항체에 양성인 세포만을 선별하고, 주 조직 적합성 복합체("MHC") 클래스 I 및 클래스 II 마커 중 하나 또는 양자 모두에 음성인 세포만을 선별하기 위하여 추가로 증식될 수 있다.

도 17에 나타난 바와 같이, 냉동-해동에 의하여 전구 세포군 내의 MHC 마커의 분포가 수정된다는 것을 발견하였다. 신선한 세포의 통과시, MHC 이중 음성 세포의 빈도는 상대적으로 일정하거나/근소하게 증가한다. 그러나, 본 명세서의 실시예에서 알 수 있는 바와 같이 전구 세포군 내 MHC 이중 음성 세포의 빈도는 세포 플레이트 후 냉동시 현저하게 증가한다. 따라서, 본 발명에 따른 전구 세포군은 MHC 이중 음성 표현형의 세포의 빈도는 이어지는 냉동시 증가하는 경향으로 추가로 특징지어진다. 이러한 냉동은 당해 기술분야에서 공지된 통상적인 방식으로 실시되는데, 예를 들면 세포 소분(aliquat)을 우선 제조하고 그 다음 원하는 기간 동안 세포 제제를 보관하는 것이다. 이러한 세포는 원한다면 수년 동안 보관될 수 있다는 것이 이해될 것이다.

한 구체예에서, 본 발명은 추가로 본 명세서에 기재된 바와 같이 혈관 주위 조직 추출물을 얻고, 이 추출물 또는 이의 분획을 냉동시키고, 그 다음 냉동된 세포를 공-배양하여 MHC 이중 음성 전구 세포 또는 이의 MHC 이중 음성-농축된 분획을 생산하는 방법을 제공한다. 명시된 바와 같이, 생산된 세포는 조직 형성을 유도하거나 인간 개체 회복에 잠재적으로 유용하다.

공-배양된 추출물 또는 적절하게 농축된 공-배양된 이의 분획으로부터 얻어진 세포군은 바로 또는 증식 후 분화된 세포군을 제공하는 데 유용하다. 분획화와 농축 및 증식에 적합한 모든 공정은 당 기술 분야에 잘 확립되어 있고 본 명세서에 예시되어 있다. 예를 들어 증식은 IL-3 및 모세포 인자(Stem Cell Factor)와 같은 인자 및 당 기술 분야에서 공지된 유사한 제제의 존재 하에서 진행될 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명에 따른 세포군 및 특히 이 중 골 모세포는 뼈 조직 성장을 위하여 확립된 조건을 사용하여 분화된다. 바람직한 구체예에서, 승인된 골 모세포라고 지칭되는, 본 발명에 따른 전구 세포군의 공-배양으로부터 얻은 골 모세포의 서브군은 뼈 발생 보충재 부재시 분화하는 능력을 갖는다. 대안으로서, 다른 바람직한 구체예에서, 골 모세포는 덱사메타손과 같은 뼈 발생을 자극하는 하나 이상의 제제로 보충된 배지에서 배양된다. 또한, 또 다른 바람직한 구체예에서, 당 기술분야의 표준 실행방법에 따르면, 공-배양된 세포는 연조직, 근육, 텐돈, 지방 조직 등을 포함하는 다른 간엽-유래 결합 조직으로의 분화를 촉진하기에 적합한 보충재(Caplan, 1991)와 함께 배양될 수도 있다.

본 발명에 따른 세포군의 세포의 인 비트로 배양에 대한 실용적인 대안으로서, 다른 바람직한 구체예에서는 이들 세포가 인 비보로 이식되어 환자내에서 직접 원하는 조직을 형성하도록 유도할 수 있다는 것이 이해될 것이다.

이식에서 사용하기 위하여, 본 발명에 따른 세포는, 엔지니어링을 위하여, 선택된 조직 부위에 전달하기 유용한 담체를 추가로 포함하는 조성물로 제공될 수 있다. 세포는 의도된 효과에 유용한 투여량으로 존재한다. 바람직한 세포 투여량은 투여량당 약 10³ 내지 10⁷개 세포, 더 바람직하기는 10⁴-10⁶ 세포, 그리고 가장 바람직하기는 2X10⁵ 세포일 것임이 예상된다. 생존가능한 세포의 전달을 위하여 확립된 치료적으로 허용가능하고 약리학적으로 허용가능한 공정에 따르면, 이들 세포의 전달에 적합한 담체는 조성물 내에서 다양할 수 있다. 이들 구체예에서, 세포는 뼈 조직 엔지니어링 목적으로 이용된다. 한 구체예에서, 세포는 불완전하거나 골절된 뼈 부위에 임플란트로서 세포를 배치하도록 제공하거나 임플란트를 수용하도록 외과적으로 준비된 뼈대 재료의 형태인 담체와 함께 존재한다. 다양한 재료가 이러한 목적용 담체로 적합하다. 특정한 구체예에서, 담체는 인산 칼슘, PLGA 또는 이의 혼합물과 같은 흡수성 재료로 형성된다. 조성물의 형성 또는 전달 동안 세포들이 생존가능하게 하고, 그렇지 않다면 이식 부위에서 생리적으로 상용가능하다면 등가 재료들이 사용될 수 있다.

전구 세포의 전달을 위하여 적합한 또 다른 바람직한 담체는 PBS 및 히알루론산, 젤라틴 등을 포함하는 겔과 같은 매개체를 포함하고, 등가물은 세포 생존성에 요구되는 pH 및 다른 특성을 가진다면 유용할 것이다.

본 발명에 따른 세포는 원하는 조직 부위로 유전자 발현 산물을 전달하기 위한 숙주로서 유용하다는 것이 또한 이해될 수 있다. 즉, 본 발명의 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 공-배양된 세포는, 발현시 뼈 조직의 바람직한 구체예에서 PTH, BMPs, 칼시토닌 등을 유용하게 포함할 수 있는 다양한 성장 인자와 같이 조직 회복 공정에 유용한 생산물을 제공하는 유전자를 수용하고 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 세포는 또한 보다 강하게 만들거나 주어진 최종 용도에 보다 더 적절하게 하기 위하여 세포 표현형을 수정하는 유전자를 도입하는 등의 방법과 같이 다른 목적을 위하여 이식 유전자로 개발될 수도 있다.

본 발명의 구체예들은 다음의 실시예에서 설명된다. 본 발명의 실시예는 본 발명의 구체예를 설명하기 위한 목적으로 사용되며, 발명의 범위를 청구된 발명보다 한정하는 것으로 해석되는 것은 아니다.

실시예

인간 와튼 젤리 유래 전구 세포의 수확

만삭 제왕 절개 영아의 분만 즉시 탯줄을 회수한다. 그 다음 외과 의사에 의하여 탯줄을 배지(80% 알파-MEM, 20% 항생제) 함유 멸균 용기로 전달한다.

이 시점으로부터 모든 과정은 생리적 안전 캐비닛에서 무균적으로 실행된다. 탯줄을 인산염 완충염수(PBS)(--Mg²⁺, --Ca²⁺)에서 3회 세정하여 가능한한 많은 제대혈을 제거하고 배지를 갖는 용기로 되돌려둔다. 탯줄 약 6cm를 멸균 가위로 절단하여 멸균 코크 절개판 상에 둔다. 남아있는 탯줄(30-45cm)을 배지-충진 용기로 회수하고 37℃ 항온기 내에 둔다. 6cm 탯줄 조각을 나선 방향과 반대로 '꼬으고(twist)', 양 단부를 핀으로 고정하여 탯줄 상피의 연하고 곧은 표면을 드러낸다. 날카로운 가위를 사용하여 탯줄을 그 길이를 따라 약 1-2mm 깊이로 절단하여 MJ를 드러낸다. 절단 상피의 각 '플랩(flap)'에서 출발하여, WJ를 외과용 메스의 뭉툭한 가장자리를 사용하여 내부 표면으로부터 얇게 떠내고, 떠내어진 상피(약 0.5mm 두께)를 핀으로 고정시킨다. 이 과정은 WJ가 노출되게 하고, 그 안에 파묻힌 세 혈관이 세로축을 따라 나선형이라기보다는 단부에서 단부로 곧게 연장된 채 있다. 37℃ PBS로 이 조각을 일정하게 적시도록 주의를 기울인다. 포셉으로 혈관의 단부 중 하나를 분리하여 대부분의 WJ 매트릭스가 없을 때까지 길이를 따라 WJ로부터 얇게 떠낸다. 대안으로는, 혈관 가운데가 매트릭스로부터 절개되어 족집게로 잡고, 단부를 향해 각 방향으로 매트릭스로부터 얇게 떠낼 수 있다. 어느 쪽 방법으로든 일단 분리되면, 혈관은 세포-함유 WJ 매트릭스의 약 1-2mm로 둘러싸인다. 그 다음 절개된 혈관을 외과용 클램프, 모기 클립 중 하나로 양 단부를 클립으로 고정하거나, 또는 혈관 내 또는 밖으로 유체의 흐름을 막는 '루프(loop)'를 형성하도록 봉합한다. '루프'는 바로 PBS(--Mg²⁺, --Ca²⁺)를 갖는 0.5㎎/㎖ 콜라게나아제 용액을 함유하는 50㎖ 튜브로 가위와 함께 두고 37℃에서 항온기에 둔다. 남아있는 두 혈관을 비슷한 방식으로 절개하고, 루프화하고 또한 항온기에서 콜라게나아제 용액 내에 둔다. 혈관 제거에 이어 혈관 주위 조직을 함유하는 WJ 스트립을 상피로부터 쉽게 절개할 수 있고, 콜라게나아제 용액을 갖는 50㎖ 튜브 내에 둔다. 그 다음 남아있는 상피층을 바이오해저드(생물학적 위험) 폐기물 용기에 처리한다. 남아있는 30-45cm의 탯줄을 가지고 동일한 프로토콜이 사용되어, '루프'나 혈관 주위 조직 스트립을 갖는 15 내지 25 튜브를 생산한다.

와튼 젤리 전구 세포 배양의 개시

18-24시간 후, 부착된 현탁 클램프 또는 봉합 및 피펫의 도움으로 '루프'를 제거하고 잔존 현탁물을 PBS로 2-5배 희석하고 5분 동안 1150rpm에서 원심분리하여 튜브(들)의 바닥에 펠렛으로서 세포 분획을 얻는다. 상층액 제거 후, 모든 오염 적혈구를 용혈시키기 위하여 세포를 상온에서 5분 동안 8배 부피의 4% NH₄Cl 중에 재현탁한다. 그 다음 현탁물을 5분 동안 1150rpm에서 다시 원심분리하여 펠렛으로서 세포 분획을 분리하고 상층액을 제거한다. 혈구 계수기를 사용하여 세포수를 센 다음 바로 이들을 T-75㎠ 조직 배양 폴리스티렌 디쉬 상에 평판 배양하고, 37℃에서 24-72시간 동안 배양시켜 세포들이 폴리스티렌 표면에 부착되도록 한다. 그 다음 2일마다 배지를 교환한다.

광학 현미경으로 관찰된 바와 같이 80-90% 콘플루언시(confluency)를 나타내고, 상 현미경 하에 나타나고 광학적 특성에서 예상된 변화에 의하여 지시된 바와 같이 '광학화' 응집체 형성의 증거가 있는 시점인 7일 후 0.1% 트립신 용액을 사용하여 부착된 세포를 계대 배양한다. 계대 배양시, 보충된 배지(SM)(75% 알파-MEM 또는 D-MEM, 15% FBS, 10% 항생제) 중 4X10³ 세포/㎠에서 35mm 조직 배양 폴리스티렌 디쉬 또는 6 웰 플레이트에 세포들을 평판 배양하고, 10^-8M Dex, 5mM β-GP, 및 50 mu.g/㎖ 아스코르브산으로 처리하여 이들 세포의 골 발생 능력을 시험한다. 이들 플레이트는 CFU-O를 위하여 2, 3, 4, 및 5일째에 관찰하고, 그렇지 않으면 '뼈 결절' 형성이라 칭한다.

이들 세포의 연골 형성 능력을 시험하기 위하여, 2X10⁵ 세포를 5분 동안 1150rpm에서 원심분리하여 펠렛으로서 세포를 얻는다. 상층액이 제거되면, 세포를 10ng/㎖ 전이 성장 인자-베타(TGF-베타)(및 선택적으로 10^-7M 덱사메타손을 갖는)로 보충된 SM에 유지한다. 3-5주 동안 배양물을 유지하면서, 이들이 (10% 중성 포르말린 완충액(NFB)으로의 고정에 의한) 조직학을 위하여 수확되고, 파라핀에 삽입되고, 6.mu.m 조각으로 절단되고, 그리고 콜라겐 II 존재(항체 염색) 및 글리코사미노글리칸의 존재(알시안 블루 염색)에 대하여 염색되는 시점인 2일마다 보충 배지를 교환한다. 세포의 지방 형성 분화 능력을 평가하기 위하여, 이들을 처음에는 (D-MEM을 갖는) SM 중의 6-웰 플레이트에 배양하고, 60% 콘플루언시에 도달할 때까지 2일 마다 배지를 교환한다. 이 시점에서 배지가 지방 형성 유도 배지(AIM)(88% D-MEM, 3% FBS, 33 .mu.M 비오틴, 17 .mu.M 판토테네이트, 5 .mu.M PPAR-감마, 100nM 보바인 인슐린, 1 .mu.M 덱사메타손, 200 .mu.M 이소부틸 메틸크산틴, 및 10% 항생제)로 교체된다. 세포가 10% NFB에 고정되는 시점인 10일 동안 AIM을 2일마다 교체하고, 지방 세포의 지질 액포를 붉게 염색하는 오일 레드 O로 염색한다. 최종적으로, 세포의 근육 조직 발생능력을 평가하기 위하여, 배지가 근육 조직 발생 배지(MM)(75% D-MEM, 10% FBS, 10% 말 혈청, 50 .mu.M 하이드로콜티손, 및 10% 항생제)로 교체되는 시점인 80-90% 콘플루언시에 도달할 때까지, 이들을 처음에는 (D-MEM을 갖는) SM 중의 T-75㎠ 조직 배양 플라스크에서 배양한다. MM을 2일 마다 교체한다. 배양물 중에서 3-5주후, 세포를 배양 표면으로부터 제거하고(계대배양 프로토콜 참조), 융해시켜 이들의 mRNA를 얻고, 그리고 MyoG, MyoD1, Myf5, 미오신 중쇄, 미오게닌, 및 데스민을 포함하는 여러 개의 근육 조직 발생 유전자의 존재에 대하여 rtPCR로 평가한다.

전구세포 검사

세포 증식 검사

다음의 세포 증식 검사는 제1 세포 배양군으로부터 예상될 수 있다: 구간 계대배양 과정(매 6일마다 이루어지는) 동안, 3X10⁴ 세포의 소분을 24 6-웰 조직 배양 폴리스티렌 플레이트의 각 웰에 평판 배양한다. 배양 1, 2, 3, 4, 5, 및 6일에, 6-웰 플레이트 중 4개를 계대배양하고 세포수를 센다. 이들 세포의 지수적 증식을 플롯화하고, 이 배양물 중에서 세포의 평균 이배수 시간을 계산한다. 결과는 도 16에 도시된다. PVWJ 세포 배양에 대한 이배수 시간이 전체 배양 기간에 거쳐 약 24시간이라는 것을 주목할 수 있다. 로그 페이스 동안, 이배수 시간은 현저한 16시간이다. 이 결과는 골수 간엽 세포에 대하여 약 33-36시간(Conget and Minguell, 1999) 및 지방 조직 유래 간엽 모세포에 대하여 약 3.2일(Sen 외, 2001)의 이배수 시간이 보고된 문헌과 비교된다. 연속적 계대배양에 따른 증식의 관찰 동안, 3X10⁵ 세포를 T-75 플라스크(n=4)에서 평판 배양하고, 2일마다 교체되는 SM을 공급한다. 배양 6일 후 세포를 서브-배양하고(상기한 서브-배양 프로토콜 참조), 혈구 계수기를 사용하여 계수한다. 3X10⁵ 세포의 소분을 4개의 새 T-75 플라스크에 살포하고, 6일 동안 배양하고, 계수 공정이 반복된다. 4개의 탯줄 샘플을 위하여 이 공정을 P0로부터 P9을 거쳐 반복한다.

도 18은 HUCPV 세포의 예상된 CFU-F 빈도를 도시한다. 1:300의 빈도가 신생 BM(1:10⁴)을 포함하는 다른 간엽 전구 세포 공급원(Caplan, 1991) 및 1:2X10⁸의 빈도에서 일어나는 제대혈-유래 "비제한된 체세포 줄기세포"(USSCs)(Kogler 외, 2004)에 대하여 관찰된 것보다 현저하게 높다. 도 19는 연속적인 계대배양시 HUCPV 세포의 증식율을 도시한다. P0에서 60시간인 초기 이배수 시간은 P1에서 38시간으로 떨어지고, P2-P8으로부터 20시간으로 떨어져 그 수준으로 유지된다. 세포는 이후 노화단계로 들어가기 시작하고 이들의 증식율은 빠르게 하락하기 시작한다. 흥미롭게도, 배양 후 첫 30일 동안 관찰할 때(도 20), HUCPV 세포는 30일 내에 2X10¹⁰ 세포를 유도한다. 한 번의 치료 용량(TD)이 2X10⁵ 세포로 정의되기 때문에(Horwitz et al, 1999)(Horwitz E M, Prockop D J, Fitzpatrick L A, Koo W W, Gordon P L, Neel M 외, Transplantability and therapeutic effects of bone marrow-derived mesenchymal cells in children with osteogenesis imperfecta. Nat Med 1999; 5: 309-313.), HUCPV 세포는 배양 10일 내에 1TD를, 그리고 배양 24일 내에 1,000 TDs를 유도할 수 있다.

도 15에 도시된 바와 같이, 혈관 주위 조직-유도된 전구 세포는 전구 세포의 다른 서브-군을 포함한다.

세포의 연골 형성, 지방 형성, 및 근육 형성 분화가 관찰될 수 있다.

연속 희석 및 CFU-F 검사

1 x 10⁵, 5 x 10⁴, 2.5 x 10⁴, 1 x 10⁴, 5 x 10³, 1 x 10³의 희석, HUCPV 세포는 6-웰 배양 플레이트(Falcon# 353046) 상에 살포되고, SM이 2일마다 공급되었다. 배양 10일째에 각 웰에서 〉16 세포를 포함하는 콜로니의 수가 계수되고, 14일째에 확인된다. CFU-F 빈도, 한 콜로니를 생산하는데 요구되는 세포의 평균 수가 결과적으로 평판 배양된 1 CFU-F/300 HUCPV 세포가 되도록 결정된다.

이 빈도에 기초하여, 300 HUCPV 세포를 제공하기 위하여 요구되는 단위 부피(3개의 탯줄 각각으로부터 3회 시행됨)가 계산되고, 8개의 증가된 HUCPV 세포의 단위 부피가 6-웰 플레이트 상의 개별 웰 상으로 살포된다. 다시, 배양 10일째에 〉16 세포(CFU-Fs)를 포함하는 콜로니의 수가 계수되어 증가 살포를 갖는 CFU-F 빈도를 검사한다.

데이타 분석

테트라사이클린 염색: 테트라사이클린(9 .mu.g/ml)을 종결 전 배양물에 첨가한다. 종결 시, 세포를 카르노브스키의 고정액(Karnovsky's fixative overnight)에 고정한 다음, 결정 영역의 광학 성분의 테트라사이클린 라벨링을 위하여 UV-여기 형광 이미지에 의하여 관찰한다.

주사 전자 현미경(SEM): CFU-O 배양물의 대표 샘플을 SEM을 위하여 준비하기 위하여, 70%, 80%, 90% 및 95% 에탄올 중에서 1시간 동안 두고, 이어서 100% 에탄올 중에 3시간 동안 함침시킨다. 그 다음 이들을 임계점으로 건조한다. 약 3nm의 금 막(gold layer)을 시료 상에 Polaron SC515 SEM 코팅 시스템으로 스퍼터 코팅한 다음, 15kV의 승압하에서 Hitachi S-2000 주사 전자 현미경으로 다양하게 확대하여 조사한다. 생성된 이미지는 형태학적으로 동정가능한 뼈 매트릭스의 존재를 입증하기 위하여 사용된다.

HUCPV 세포군의 HLA-타이핑을 위한 유세포 계수기: >1 x 10⁵ 세포의 시험 세포군을 2% FBS (StemCell Batch #: S13E40) 함유 PBS에서 세정하고, 4℃에서 30분 동안 다음의 컨쥬게이트 마우스 IgGl HLA-A,B,C-PE 및 HLA-DR,DP,DQ-FITC의 포화 농도(1: 100 희석)를 갖는 PBS+2% FBS에 재현탁한다. 세포 현탁액을 1 .mu.g/ml 7-AAD(BD Biosciences)로 염색된 PBS+2% FBS로 두 번 세정하고, ExpoADCXL4 소프트웨어(Beckman-Coulter)를 사용하여 유세포 계수기(XL, Beckman-Coulter, Miami, FIa.)에서 분석을 위하여 PBS+2% FBS에 재현탁한다. 매치된 아이소 타입 항체(FITC- 및 PE-컨쥬게이트화 마우스 IgGl,. kappa, 모노크로날 아이소 타입 표준품, BD Biosciences)로 염색된 대조군으로부터 세포 중 〉99%로 얻어진 수준을 초과하는 형광 시그널의 방출로 양성 염색을 정의한다. 각 샘플에 대하여 최소한 10,000 리스트 모드 현상이 수집된다. 모든 플롯은 EXPO 32 ADC 분석 소프트웨어에서 생성된다.

HLA 타이핑에 추가하여, HUCPV 세포군 또한 다음의 결과를 가지고 다른 마커에 대하여 측정된다:

1 마커 발현 CD 105 (SH2) + + CD73 (SH3) + + CD90 (Thyl) + + CD44 + + CD117 (c-kit) 15%+ MHC I 75%+ MHC II - CD106 (VCAMl) - STROl - CD123 (IL-3) - SSEA-4 - Oct-4 - HLA-G - CD34 - CD235a (Glycophorin A) - CD45 -

결과

뼈 결절 콜로니의 광 마이크로그래프: 도 3, 4, 및 5는 3일과 5일째 배양물 중에 존재하는 CFU-O's를 도시한다. 이들은 뼈-매트릭스를 생산하고 있는 다각형 세포의 '응집(aggregation)'에 의하여 나타나는 결절 영역을 둘러싸는 "섬유아세포-유사" 세포의 융합성 막을 설명한다. 이들 CFU-O's는 Dex(+)와 Dex(-) 배양물 모두에서 관찰되고 연속적 계대 배양에 거쳐 유사한 형태를 나타낸다.

CFU-O 배양물의 테트라사이클린 라벨화: 배양물의 테트라사이클린 라벨화는 뼈의 생리적 광물화 단계와 관련하여 새롭게 형성된 인산 칼슘을 라벨화하기 위하여 사용된다. 배양물의 테트라사이클린 라벨화는 광물화된 결절 영역과 일치하는데 이는 UV 광선에 배양물을 노출하여 가시화된다. 도 6 및 7은 전구 세포의 3일과 5일째 배양물의 테트라사이클린 라벨화된 CFU-O 배양물을 도시한다. 이들 이미지는 UV-여기된 형광 이미지에 의하여 생성되어 사진으로 찍은 것이다.

주사 전자 현미경: CFU-O's는 성숙한 CFU-O에서 콜라겐 형성의 초기 단계로부터 조밀하게 광물화된 매트릭스에 이르기까지 CFU-O's의 형성을 설명하는 광물화된 콜라겐 매트릭스의 형성을 위하여 SEM 하에서 관찰된다. 도 8, 9, 10, 11, 12 및 14는 CFU-Os의 주사 전자 현미경 사진을 나타낸다.

유세포 계수기 및 HUCPV 세포군의 HLA-타이핑: 양측 주 조직 복합체(MHCs)를 나타내는 세포-표면 항원을 동정하는 유세포 계수기는 MHC^-'-로서 단리된 세포군 중 77.4%를 나타낸다. 도 13은 음성 대조군과 관련하여 유세포 계수기의 결과를 도시한다. 도 17은 전구 세포군에서 MHC^-'-의 빈도에서 냉동-해동의 영향을 도시한다.

냉동-해동의 효과

〉1 x 10⁵ 세포를 2% FBS 함유 PBS에서 세정하고, 4℃에서 30분 동안 다음의 컨쥬게이트화 마우스 IgGl HLA-A,B,C-PE (BD Biosciences #555553, Lot M076246) (MHC T), HLA-DR,DP,DQ-FITC (BD Biosciences #555558, Lot M074842) (MHC II) 및 CD45-Cy-Cychrome (BD Biosciences # 555484, Lot 0000035746)의 포화 농도(1:100 희석)를 갖는 PBS+2% FBS에 재현탁한다. 세포 현탁액을 PBS+2% FBS로 두 번 세정하고, ExpoADCXL4 소프트웨어(Beckman-Coulter)를 사용하여 유세포 계수기(XL, Beckman-Coulter, Miami, FIa.)에서 분석을 위하여 PBS+2% FBS에 재현탁한다. 매치된 아이소 타입 항체(FITC-, PE-, 및 Cy-사이토크롬-컨쥬게이트화 마우스 IgGl,. kappa, 모노크로날 아이소 타입 표준품, BD Biosciences)로 염색된 대조군으로부터 세포 중 〉99%로 얻어진 수준을 초과하는 형광 시그널의 방출로 양성 염색을 정의하는데, 이는 인간 BM 샘플의 양성 형광에 의하여 확인된다. 각 샘플에 대하여 최소한 10,000 리스트 모드 현상이 수집되었다. 모든 플롯은 EXPO 32 ADC 분석 소프트웨어에서 생성된다.

계대-배양과 세포 살포(Sub-Culture & Cell Seeding): 부착된 세포를 광학 현미경에 의하여 관찰된 바와 같이 80-90% 콘플루언시를 나타내는 시점인 7일 후 0.1% 트립신을 사용하여 계대-배양한다. 계대 배양시, 세포를 MHC-A, B, C, MHC-DR,DP,DQ, 및 CD45의 발현에 대하여 유세포 계수기에 의하여 관찰한다. 그 다음 이들을 SM 중에서 4x10³ 세포/㎠에서 T-75 조직 배양 폴리스티렌 플라스크에 평판 배양하고 10^-8M Dex, 5 mM βGP 및 50 .mu.g/ml 아스코르브산으로 처리하여 이들 세포의 뼈 발생 능력을 시험한다. 이들 플라스크는 CFU-O 또는 뼈 결절, 형성에 대하여 배양 2, 3, 4, 5, 및 6일째에 관찰된다. 계대 배양 공정에서 남은 모든 잔존 세포를 또한 추후 사용을 위하여 저온 보존한다.

세포의 저온 보존: 1 x 10⁶ PVT 세포의 소분을 90% FBS, 10% 디메틸 술폭사이드(DMSO) (Sigma D-2650, Lot# 11K2320)로 이루어지는 총 부피 1㎖에 제조하고 1 ml 폴리프로필렌 저온-바이알에 피펫으로 넣는다. 이들 바이알을 70℃ 냉동고에 밤새 두고, 다음 날 장기간 보존을 위하여 -150℃ 냉동고로 이동시킨다. 저온 보존 1주일 후, PVT 세포들을 해동하고 MHC-A, B, C, MHC-DR,DP,DQ, 및 CD45의 발현에 대하여 세포 계수기로 관찰한다. 저온 보존 1주일 후 PVT 세포들이 해동되고, 1주일 동안 재배양되고, 계대 배양한 다음 MHC-A, B, C, MHC-DR,DP,DQ, 및 CD45의 발현에 대하여 세포 계수기로 재분석하는 제2 프로토콜이 사용된다.

결과: 결과는 도 17에 나타난다. 신선한 세포군 내의 MHC^-'-의 빈도가 여러 계대 배양을 통하여 유지된다는 것을 주목할 수 있다. 신선한 세포가 일주일 동안 -150℃에서 계대배양된 후 냉동되고 곧 바로 MHC 표현형이 분석될 때, 이 분석된 군은 MHC^-'- 표현형 세포의 현저하게 증가된 빈도를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 구체예에 따르면, MHC^-'- 표현형 세포는 냉동에 의하여 PVT 세포군으로부터 유용하게 농축될 수 있다. 미리 냉동된 세포의 배양물을 계대 배양할 때 훨씬 더 많은 농축이 확인된다. 특히, 도 17에 도시된 바와 같이 저온 보존된 세포의 1차 계대 배양은 50%를 넘도록 MHC^-'- 세포의 상대적 분포를 증가시키고, 이들 세포의 이어지는 냉동과 계대 배양은 80%, 85%, 90%, 및 95%를 넘는 MHC^-'- 세포군을 생산한다.

후 응집성 HUCPV 세포 분획의 수확

혈관 주위 조직으로부터 회수된 전구 세포의 생산량은 다음의 방식으로 향상될 수 있다. HUCPV 세포의 "후 응집성(PA)" 분획을 수확하기 위해서는, 초기에 살포된 HUCPV 수확물의 상층액을 새로운 T-75 플라스크로 교체하고, 37℃, 5%의 CO₂에서 2일 동안 배양한다. 최종적으로, 제3 살포된 플라스크의 상층액을 흡인하고 이 플라스크에 신선한 SM을 공급한다. (결과적으로 각 탯줄에 대하여 3개의 플라스크가 생성된다: 초기 살포된 플라스크, 제1 PA 분획, 및 제2 PA 분획) 더 많은 세포 생산량이 이들 PA 분획들을 분리하여 얻어진다는 것을 확인하여, 초기 살포된 세포와 비교하여 이들 세포의 동일한 특성이 유사하게 나타난다.

생물반응기에서의 증식

이제 도 22를 참조하면, 본 발명의 전체적인 구조가 도시되어 있다. 프레임 수단(10)은 벨트 구동장치(15)에 의해 연결되는 모터 도르레(14) 및 하우징 도르레(14)를 지지하는 플레이트(11, 12)와 수직으로 이격되어 구비된다. 상기 모터 도르레(14)는 원하는 구동 속력을 제공하기 위해 잘 알려진 방식으로 제어될 수 있는 모터(16)와 연결된다.

상기 하우징 도르레(13)는 회전 커플링(18)을 통해 주입 엔드 캡(20)으로 연장되는 구동 샤프트(17)와 연결된다. 상기 주입 엔드 캡(20)은 중앙 어셈블리(21) 및 튜브의 외부 배양 실린더(22)로 부착된다. 상기 중앙 어셈블리(21) 및 상기 배양 실린더(22)의 다른 쪽 끝에는 배출 엔드 캡(24)이 있다.

상기 프레임 수단(10) 상의 공기 펌프(25)는 필터(27)에서 입력 배관(26)까지 연결된다. 상기 펌프(25)로부터 출력 배관(28)은 공기 입력이 정지된 고리 모양의 이음 고리로부터 상기 회전 구동 샤프트(17)에서 내부 통로까지 연결되는 상기 회전 커플링(18)과 연결된다.

이제 도 23을 참조하면, 본 발명의 상기 세포 배양 시스템의 부분적인 단면이 도시되어 있고, 상기 회전 커플링(18)은 상기 출력 배관(28)을 받고 상기 구동 샤프트(17)는 공기의 흐름을 위해 중앙 공기 주입 통로(30)를 구비한다. 상기 구동 샤프트(17)는 상기 주입 엔드 캡(20)의 중앙 개구(31)를 통해 연장되는 커플링 샤프트(17a)로 부착된다. 상기 커플링 샤프트(17a)는 원통 형태인 중앙 지지 부재(32)로 나사 부착된다. 상기 중앙 통로(30)는 상기 샤프트(17, 17a)를 통해 상기 공기 주입 통로(30)를 상기 중앙 지지 부재(32)의 외부 표면(35)과 연결하는 가로 개구(33)로 안쪽으로 연장된다. 상기 중앙 지지 부재(32)는 상기 주입 엔드 캡(20)의 카운터보어 (counterbore)로 들어가 밀봉되고, 반대쪽 끝에서, 상기 지지 부재(32)는 상기 배출 엔드 캡(24)의 카운터보어로 들어가 밀봉된다. 튜브 배출 부재(35a)는 상기 배출 엔드 캡(24)의 보어를 통해 상기 지지 부재(32)의 숨겨진 보어로 나사 부착되고 상기 배출 커플링의 공기 배출 통로(36)는 상기 중앙 지지 부재(32)의 외부 표면(35)에서 가로 개구(37)까지 연결된다. 튜브의 산소 침투 멤브레인(40)은 상기 중앙 지지 부재(32) 위에 배치되고 상기 중앙 지지 부재(32)의 상기 개구(33, 37) 위에서 연장되는 엔드를 구비하여 상기 멤브레인(40)이 오 링(O-Ring) 또는 이와 같은 것들에 의해 상기 중앙 지지 부재(32)로 부착되어 봉합될 수 있도록 한다. 그러므로, 공기 통로는 상기 통로(30)와 상기 가로 개구(33)를 통해, 그리고 상기 멤브레인(40)의 내부 벽과 상기 중앙 지지 부재(32)의 외부 벽을 통해 상기 배출 가로 개구(37) 및 상기 배출 통로(36)로의 상기 공기의 입력을 제공한다. 상기 멤브레인(40)은 공기압 하에서 산소는 상기 멤브레인의 벽을 통해 상기 멤브레인을 둘러싼 액체 매질의 고리로 침투되도록 허용하고 이산화탄소는 반대 방향으로 분산시키도록 동작하는 실리콘 고무로 이루어질 수 있다.

상기 중앙 지지 샤프트(32)에 대해 동축으로 배치되는 것은 유리일 수 있는 튜브의 외부 실린더(22)이다. 상기 실린더(22)는 상기 엔드 캡(20, 24)으로 들어가 밀봉되고 상기 실린더(22)의 내부 벽과 상기 멤브레인(40)의 외부 벽 사이에 고리 모양의 배양 챔버를 정의한다. 상기 주입 엔드 캡(20) 상에는 원주를 따라 이격된 원통형 부재(42)가 있다. 상기 커플링 샤프트(17a)가 상기 샤프트(17)로부터 떨어지면, 상기 부재(42)는 상기 실린더(22)를 샘플링, 변화 또는 상기 시스템으로 액체를 첨가하는 동안 위쪽 또는 수직으로 세우기 위한 기저를 제공한다.

상기 배출 엔드 캡(24)에서, 두 개 또는 그 이상의 접근 포트(44, 45)가 존재하고, 상기 포트(44)는 폐쇄 부재(46)를 구비하고 상기 포트(45)는 밸브(47)에 의해 닫힌다. 액체 매질과 함께 피하 주사침은 다른 포트로부터 액체를 빼낼 때 액체를 주입하기 위해 한 쪽 접근 포트를 통해 삽입될 수 있다. 이와 관련하여 샘플 또는 매질은 공기 공간을 형성함 없이 빠져나올 수 있고, 이에 의해 제로 헤드 스페이스 (zero head space)를 방지할 수 있다.

본 발명의 일 실시예는 그러므로 상기 원통형 멤브레인을 통해 산소 공급원이 되는 중앙 원통 코어를 포함하고, 상기 용기의 외부 벽 및 상기 멤브레인은 수평축에 대해 회전된다. 이는 클리노스탯 (clinostat) 원리, 즉, 수평 또는 거의 수평축에 대해 한 방향으로 360도 회전하는 액체가 중력의 효과와 독립적으로 액체에서의 입자를 효율적으로 정지시킬 수 있는 원리의 타입을 포함한다. 상기 실린더(22)의 회전 속력은 상기 액체와 상기 실린더 벽 사이의 경계 층에서 속도 변화도 (velocity gradient)를 효과적으로 제거한다. 그러므로, 상기 회전 액체 및 정지된 벽으로 인한 전단 효과 (shear effect)는 상당하데 감소되거나 제거된다. 사용될 때, 필수적으로 조용한 3차원 환경이 상기 실린더에서 생성된다.

공-배양 공정

와튼 젤리 추출 세포 혼합물을 상기한 바와 같이 제조하였다. 조혈 모세포 혼합물은 다음과 같이 제조되었다:

전혈을 말초 혈관, 제대혈, 또는 골수 흡인물의 세포성 산물로부터 회수한다. 그 다음 적혈구 성분을 층형성 또는 Ficoll® 또는 Hetastarch® 또는 면역 정제 및 적혈구 세포 용해와 같은 다른 방법에 의하여 단핵 세포 분획(MNC)를 단리하는 단계를 포함하여 밀도 구배 분리(Buffy Coat)에 의한 핵형성된 세포 분획을 단리하여 제거한다. 버피 코트층과 MNC는 모세포, 전구 세포, 및 분화 세포를 함유하지만 적혈구 성분은 제거되었다. 본 발명의 한 구체예에서, 전체 버피 코트 또는 단핵 세포 분획이 추가 조작없이 활용될 수 있다. 대안으로서, MNC는 CD 133+ 또는 CD34+ 세포와 같은 특정 세포 타입을 단리하기 위하여 면역 자기 선택에 의하여 추가로 조작될 수 있다.

3차원 공-배양은 다음의 방식으로 개시된다. 배양 장치, 저속 전환 측면 용기(STLV)가 조직 배양 세제, (마이크로.x) 로 세척되고 완전히 헹구어지고 Milli Q 울트라 고순도 수에 함침되어 준비된다. 장치는 오토클레이브로 살균되고 냉각시 배양 성장 배지와 함께 잔류물을 위하여 헹구어진다. 용기를 라미나 류 후드에 두고 똑바로 세워둔다. Cytodex 3 마이크로캐리어 비드(Pharmacia)를 수화하여 미리 살균하고 성장 배지 용액 20 mg/ml: mg 당 4000 마이크로 담체를 함유-에 현탁한다. 용기를 인슐린, 트란스페린, 셀레늄 (5 ug., 10 ug., 5 ug.), 상피 성장 인자, 피루브산 나트륨, 10% 태아 송아지 혈청, 헤페스 완충액 2 g/l, 및 페니실린과 스트렙토마이신 (100 유니트, 100 mg./ml.)으로 이루어진 성장 배지로 충진하여 본질적으로 상부 공간이 없도록 하였다.

마이크로 담체 20 mg/ml 용액 62.5㎖를 용기에 첨가하여 용기내의 마이크로 담체의 최종 농도가 5㎎/㎖가 되도록 한다. 그 다음 최종 부피의 10% 이내에서 용기를 성장 배지로 충진한다. 용기를 밀봉하고 37℃, 95% 습도의 95% 공기, 5% CO₂를 갖는 라미나 류 CO₂ 배양기에 두어 한 시간 동안 평형이 되도록 한다. 한 시간 후 용기를 배양기로부터 제거하고, WJ 혼합물과 조혈 세포 혼합물의 동일 분획 약 5 x 10⁷ 세포를 접종한다. 세포는 (9:1)의 비로 혼합되었다. 접종 후, 용기가 밀폐되고 남아있는 공기 버블을 제거하고 배양기에 둔다. 용기는 컴플라이언트 부피로 작용하는 20㎖ 시린지와 함께 장착된다. 용기 내 성장을 DCO2, DO2, 포도당, mOsm 및 PH 분석에 의하여 매일 모니터링한다. 48시간에 성장 배지를 처음으로 교체하고 그 후 매 24시간마다 배지 교환이 요구된다. 이들 교환은 용기 내의 독성 대사 부산물을 제거하고 영양분 수준을 보충하기 위하여 요구된다. 배지 교환 또한 다수 세포 오가노이드 배양의 상호작용으로부터 생성된 희귀한 성장 산물을 수확하기 위하여 필요하다. 2일 째 회전 속도가 12에서 15rpm으로 증가된다. 168 시간 째, 증가된 소비 결과로 추가로 100㎎/dl의 포도당을 포함하도록 배지 조성물이 변경된다. 216시간 째, 포도당 농도는 높은 소비율로 인하여 다시 300㎎/dl로 증가된다. 배양 후 138시간 부터 세포 대 세포 조직화가 나타난다. 배양은 288시간째 종료되어 용기내에 함유된 잘 개발된 공-배양의 분석을 시작한다. 용기로부터 얻은 배양 배지를 수확하고 추후 분석을 위하여 -80℃에 둔다.

이하의 참조 문헌은 참조로서 본 발명에 통합된다:

Aubin, J E, 1998, Bone stem cells: J Cell Biochem Suppl, v. 30-31, p. 73-82. Canfield, A E, M J Doherty, B A Ashton, 2000, Osteogenic potential of vascular pericytes, in J E Davies (ed), Bone Engineering: Toronto, EM Squared, Inc., p. 143-151. Caplan, A I, 1991, Mesenchymal stem cells: J Orthop. Res, v. 9, p. 641-650. Chacko, A W, S R M Reynolds, 1954, Architecture of deistended and nondistended human umbilical cord tissues, with special reference to the arteries and veins.: Carnegie Institution of Washington, Contributions to Embryology, v. 35, p. 135-150.

Conget, P, J J Minguell, 1999, Phenotypical and functional properties of human bone marrow mesenchymal progenitor cells: J. Cell Physiol, v. 181, p. 67-73.

Haynesworth, S E, D Reuben, A I Caplan, 1998, Cell-based tissue engineering therapies: the influence of whole body physiology.: Adv Drug Deliv Rev, v. 33, p. 3-14.

Kogler, G, S Sensken, J A Airey, T Trapp, M Muschen, N Feldhahn, S Liedtke, R V Sorg, J Fischer, C Rosenbaum, S Greschat, A Knipper, J Bender, O Degistirici, J Gao, AI Caplan, E J Colletti, G Almeida-Porada, H W Muller, E Zanjani, P Wernet, 2004, A new human somatic stem cell from placental cord blood with intrinsic pluripotent differentiation potential: J. Exp. Med., v. 200, p. 123-135.

Mitchell, K E, M L Weiss, B M Mitchell, P Martin, D Davis, L Morales, B Helwig, M Beerenstrauch, K Abou-Easa, T Hildreth, D Troyer, 2003, Matrix cells from Wharton's jelly form neurons and glia: Stem Cells, v. 21, p. 50-60.

Parry, E W, 1970, Some electron microscope observations on the mesenchymal structures of full-term umbilical cord: Journal of Anatomy, v. 107, p. 505-518.

Pereda, J, P M Motta, 2002, New advances in human embryology: morphofunctional relationship between the embryo and the yolk sac: Medical Electron Microscopy, v. 32, p. 67-78.

Romanov, Y A, V A Svintsitskaya, V N Smimov, 2003, Searching for alternative sources of postnatal human mesenchymal stem cells: Candidate MSC-like cells from umbilical cord: Stem Cells, v. 21, p. 105-110.

Schoenberg, M D, A Hinman, R D Moore, 1960, Studies on connective tissue V, Feber formation in Wharton's Jelly.: Laboratory Investigation, v. 9, p. 350-355.

Sen, A, Y R Lea-Currie, D Sujkowska, D M Franklin, W O Wilkison, Y D Halvorsen, JM Gimble, 2001, Adipogenic potential of human adipose derived stromal cells from multiple donors is heterogeneous: J. Cell Biochem., v. 81, p. 312-319.

Takechi, K, Y Kuwabara, M Mizuno, 1993, Ultrastructural and immunohistochemical studies of Wharton's jelly umbilical cord cells: Placenta, v. 14, p. 235-245.

Tuchmann-Duplessis, H, G David, P Haegel, 1972, Illustrated Human Embryology, New York, Springer- Verlag, p. 54-61.

Weiss, L, 1983, Histology: cell and tissue biology, New York, Elseiver Biomedical, p.997-998.

Wharton, T W, 1656, Adenographia, Translated by Freer S. (1996). Oxford, U.K., Oxford University Press, p. 242-248.

Claims (10)

1. - 맥관 구조를 갖는 인간 탯줄을 제공하고;
   - 맥관 구조에 인접한 혈관 주위 조직을 분리하고;
   - 상기 혈관 주위 조직을 소화하여 분획을 생성하고; 그리고
   - 조혈 모세포와 함께 적어도 소화된 조직의 분획을 공-배양하여 전구세포를 포함하는 와튼 젤리 추출 조성물을 제조하는:
   단계를 포함하는 와튼 젤리 추출 조성물을 제조하는 방법.
2. 제1항에 따른 방법으로 제조된 와튼 젤리 추출 조성물.
3. 와튼 젤리 추출 조성물로서, 추출물은 인간 전구 세포들을 포함하고, 인간 탯줄의 맥관 구조에 인접한 혈관 주위 조직의 효소적 소화에 의하여 얻어진 다음 조혈 모세포와 함께 공-배양되는 것인 와튼 젤리 추출 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 추출물은 적절한 세포 추출 매질에서 탯줄 맥관 조직 함유 인접 와튼 젤리를 효소적 소화시켜 얻어지는 것인 와튼 젤리 추출 조성물.
5. 인간 전구 세포를 얻고, 제1항 또는 제3항에 따른 와튼 추출물로부터 상기 세포를 분리하고, 그리고 조혈 모세포와 함께 공-배양하는 단계를 포함하는 조직 재생 세포들의 조성물을 제조하는 방법.
6. 제1항 또는 제3항에 있어서, 공-배양은 이차원 시스템에서 이루어지는 것인 방법.
7. 제1항 또는 제3항에 있어서, 공-배양은 회전 용기 생체 반응기에서 이루어지는 것인 방법.
8. 와튼 젤리 추출 조성물과 조혈 모세포의 팽창된 혼합물을 포함하는 재료의 조성물.
9. - 연장된 튜브형 배양 용기; 상기 배양 용기의 앤드를 포함하는 엔드 캡들; 상기 배양 용기에 동축으로 배치되고, 상기 엔드 캡들 사이에 연장된 샤프트; 및 상기 엔드 캡들 사이의 상기 샤프트 위에 배치되고, 멤브레인과 상기 샤프트 사이의 고리 모양의 통로를 정의하기 위해 상기 샤프트에 대하여 밀봉되고, 그리고 상기 멤브레인과 상기 배양 용기의 내부 벽 사이의 고리 모양의 배양 챔버를 정의하기 위한 상기 튜브형 멤브레인을 포함하고, 상기 멤브레인은 상기 배양 챔버와 함께 성분 가스의 교환을 위하여 산소가 침투가능한 생체 반응기를 제공하고;
   - 별도의 현탁 재료와 와튼 젤리 유래 세포들 및 조혈 모세포들의 세포 혼합물을 함유하는 유체 영양 매질로 상기 배양 챔버를 완전히 채우고, 상기 현탁 재료는 유체 영양 매질의 밀도와 다른 밀도를 가짐;
   - 한 방향으로 상기 배양 용기의 세로축 주위로 상기 배양 용기, 샤프트, 및 멤브레인을 회전시키고, 상기 세로축은 수평으로 배치됨;
   - 상기 배양 용기 회전을 조절하여 회전에 의하여 서로와의 간섭관계로부터 벗어나 유체 영양 매질 내 공간적인 위치에서 현탁물에 별도의 현탁 재료와 세포 혼합물을 두고; 그리고
   - 상기 회전 동안 상기 고리 모양의 통로의 한 쪽 끝에 압력 하에 산소 함유 가스를 지속적으로 도입하고 상기 고리모양의 통로의 다른 끝에서 상기 가스를 배출하는:
   단계를 포함하는 세포 배양물을 성장시키는 방법.
10. - 맥관 구조를 갖는 인간 탯줄을 제공하고;
    - 맥관 구조에 인접한 혈관 주위 조직을 분리하고; 그리고
    - 상기 혈관 주위 조직을 소화하여 분획을 생성하는:
    단계를 포함하는 내부에 상당수의 제대혈 모세포를 갖는 것이 방지된 와튼 젤리 추출 조성물을 제조하는 방법으로서, 개선점은 조혈 모세포와 함께 적어도 소화된 조직의 분획을 공-배양하여 전구세포를 포함하는 와튼 젤리 추출 조성물을 제조하는 것인 와튼 젤리 추출 조성물을 제조하는 방법.

Images