CN101848718A - 用于组织再生的细胞组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种从人脐带的血管周组织提取人祖细胞的方法。所提取的细胞随后与造血干细胞共培养并且可用于生长和修复包括骨在内的人的组织。本发明还包括相关方法和与其相关的组合物。

Description

用于组织再生的细胞组合物

发明领域

本发明集中于从脐带的连接组织收获迅速增殖的人细胞群，涉及这些细胞与造血干细胞的共培养的方法，与其相关的组合物，以及可用于各种细胞类治疗的组合物。

背景技术

从脐带胶质获得治疗性细胞混合物是众所周知的。然而，在各种情况中，确保消除任何脐带血的痕迹被认为是重要的，这是一个昂贵和耗时的程序。本发明不会受困于该问题。本发明将衍生自脐带胶质的细胞与造血干细胞共培养。

脐带是形成后来的原肠胚形成(三层胚层的形成)的最初结构之一。当开始折叠时，胚盘通过原中肠(胚胎起源)与原卵黄囊(胚外起源)经由卵黄和尿囊血管(其随后发育形成脐血管)开始连接(Haynesworth等，1998；Pereda and Motta，2002；Tuchmann-Duplessis等，1972)。这些血管被支撑在通常被认为是名为脐带胶质(Wharton’s Jelly，WJ)的主要是胚外衍生物的原间充质细胞组织中并被其所环绕(Weiss，1983)。从该早期阶段开始，脐带在妊娠期间生长成为在分娩时所见的30～50cm。因此可预期的是WJ不仅含有已在文献(见下文)中描述的纤维母细胞样或肌纤维母细胞样的细胞，而且还含有祖细胞群(populations of progenitor cells)，后者能产生在胚胎和胎儿发育期间支持脐带生长所必需的WJ的扩增体积的细胞。

WJ最初由Thomas Wharton描述，他在1656年公开了其专题论文(treatise)Adenographia。(Wharton T W.Adenographia.Freer S.译(1996).Oxford，U.K.；Oxford University Press，1656；242-248)。随后其被定义为包括透明质酸(Schoenberg等，1960)和不同类型胶原质(Nanaev等，1997)的分散在由蛋白糖苷组成的无定形基质(ground substance)中的由细胞组成的凝胶状松散粘液状连接组织。分散在基质中的细胞已被描述为“纤维母细胞样的(fibrobalast-like)”，其在萎陷脐带中为星形的且在膨大脐带中为长条的(Parry，1970)。最初在基质中观察到平滑肌细胞(Chacko and Reynolds，1954)，尽管这被Parry所质疑(1970)，后者将其描述为可算是表面上类似于平滑肌细胞的“异常纤维母细胞”。此后，几乎没有进行有关表征这些细胞的工作，直到1993年，Takechi等(1993)对这些细胞进行了免疫组织化学调查。他们将该细胞描述为“纤维母细胞样的”，其是“形状为纺锤形或星形的，带有长胞突和在无定形基质中的波浪形胶原质网络”(Takechi等，1993)。对于免疫组织化学染色，其使用对抗肌动蛋白和肌球蛋白(胞质内收缩蛋白)、波形蛋白(vimentin)(胚间充质起源的纤维母细胞的特征)和肌间线蛋白(desmin)(对肌原起源细胞具有特异性)的第一抗体以确定何种类型的肌球蛋白与WJ纤维母细胞(fibroblast)有关。他们观察到高水平的可化学提取的肌动球蛋白；并且尽管纤维母细胞含有胞浆肌动球蛋白，但它们不会对肌动蛋白或肌球蛋白染色，而WJ纤维母细胞主动地为这二者染色。另外，观察到对波形蛋白和肌间线蛋白二者主动染色导致以下结论：即，WJ中经修饰的纤维母细胞来自原间充质细胞组织(Takechi等，1993)。由Nanaev等(1997)进行的随后的较近期研究证实了终端脐带(pre-term cord)中增殖形间充质祖细胞分化的五个步骤。他们的发现支持了以下建议：即，肌纤母细胞(myofibroblast)存在于WJ基质中。WJ细胞的免疫组织化学表征显示了与周细胞(pericyte)的很高的相似性，后者已知为骨形态形成中成骨细胞的主要来源，并且还可在培养中形成被称为骨母细胞集落形成单元(colony formingunit-osteoblast，CFU-O)(Aubin，1998)的骨结节(bone nodule)(Canfield，2000)。

近来的公开出版物已报道了从UC而不是UC血中收获细胞的方法。Mitchell等(Mitchell等，2003)描述了一种方法，其中他们首次去除和丢弃了脐血管以收获其余组织。后者将包括其余的WJ(WJ的一部分已与血管一起被丢弃，因为脐血管完全被包封在WJ中)和羊膜上皮组织，其随后被切块以生产小的组织碎片，所述小的组织碎片被转移到组织培养皿中。这些组织碎片随后用作初步外植体(primaryexplant)，细胞从该初步外植体迁移到培养基基底上。

在另一篇公开出版物中，Romanov等(2003)表明他们成功地从脐带维管结构分离了间充质细胞干细胞样的细胞，尽管他们还表明他们的培养基不含来自WJ的细胞。特别是，他们采用了由脐静脉进行的单个的、15min胶原酶消化，这得到了血管内皮细胞和内皮下细胞的混合群落。Romanov等显示，由7天后的该细胞收获得到了稀少数目的纤维母细胞样细胞(fibroblast-like cell)。

本发明的目的是提供一种包括与造血干细胞共培养的人祖细胞的细胞群落。本发明的另一个目的是提供能在治疗上使用的人细胞混合物。

发明内容

已发明了一种用于从人脐带的脐带胶质提取细胞的方法，该方法得到如下的独特细胞群落，所述细胞群落的特征在于迅速分化、存在骨祖细胞和其它人祖细胞，包括不显示任一主要组织相容性标记(人白细胞免疫抗原(HLA)双重阴性)的无免疫能力的细胞(immuno-incompetent cell)。该细胞群落当与造血干细胞共培养时是可从其中生长骨和包括软骨、脂肪和肌肉在内的其它连接组织的可用的细胞来源，其可用于将祖细胞自体和异体转移给患者以用于治疗目的。

更特别地，并且根据本发明地一个方面，提供了一种脐带胶质提取物，其中所述提取物包括人祖细胞(human progenitor cells)，并且通过对在使用上名为脐带胶质血管周区域(perivascular zone of Wharton’jelly)的区域中与人脐带的维管结构邻近的脐带胶质的酶促消化(enzymatic digestion)而得到。从中提取了本发明的祖细胞的该血管周区域内的组织也可称为血管周组织。提取步骤得到了基本上不含脐带血细胞、UC的上皮细胞或内皮细胞以及来自脐带血管结构的细胞的提取物，其中脐带血管结构被定义为小动脉或静脉的内膜、中膜或外膜。所得提取物也不同于从已与血管结构分离的主体脐带胶质组织分离的其它脐带胶质提取物。这些细胞随后与造血干细胞共培养以得到组织再生混合物(tissue regenerating mixture)。

在相关方面，本发明提供了一种通过以下方式得到的细胞群落：培养脐带胶质提取物中存在的细胞，随后将其与造血干细胞共培养。所述共培养在二维系统如细胞培养瓶(T-flask)或优选三维系统如旋壁式生物反应器中实现。

在一个实施方式中，所提取的祖细胞群落的特征在于在粘着条件下培养所提取的细胞之后得到的粘着性细胞群落。在另一个实施方式中，所提取的祖细胞群落的特征在于在粘着条件下生长的所提取细胞的上清成分中存在的非粘着性(或“粘着后”)(PA)细胞群落。该PA成分通过以下方式得到：将初始沉积(initially plated)的HUCPV细胞的上清液转移到新的T-75培养瓶中以使至今尚未粘着的细胞附着到培养基表面。用该新的T-75培养瓶重复此过程，将其培养基转移到另外的新T-75培养瓶中以收获任何剩余的PA细胞。根据本发明的另一方面，该PA细胞群落包括祖细胞的子群，所述祖细胞的子群当在粘着条件下培养并随后与造血干细胞共培养时迅速分化并自发地形成骨结节和脂肪细胞。该实施方式提供了一种提高从酶促消化细胞群落分离粘着细胞的产率的方法。

在其另一方面，本发明提供了一种生产包括骨组织、软骨组织、脂肪组织和肌肉组织的连接组织的方法，其包括以下步骤：将共培养的组合物经历诱导那些细胞分化为所需连接组织表型的条件。在该方面中，本发明还提供了上述细胞在细胞类治疗中的用途，所述细胞类治疗包括医学不良状态、疾病和病症的细胞移植介导的治疗。

更特别地和根据本发明的另一方面，提供了一种组合物及其在组织工程中用途，所述组合物包括根据本发明的细胞混合物或其分化后裔以及适用于将这种细胞递送到所选组织位置的载体。

本发明的这些和其它方面现将参考附图在下文中更详细地描述，其中：

附图说明

图1是代表人UC中存在的组织的三维区域的光学显微照片；

图2是胶原酶溶液中环形血管的代表性图解；

图3是已附着到聚苯乙烯组织培养表面的从WJ分离的细胞的光学显微照片；

图4是图解CFU-O最初形成的光学显微照片；

图5是图解成熟CFU-D的光学显微照片；

图6图示了在35mm聚苯乙烯组织培养皿上在UV荧光下四环素标记的CFU-O；

图7并排地图解了同样的四环素标记的CFU-O的相差光学显微照片和荧光显微照片；

图8是在组织培养聚苯乙烯表面上的成熟CFU-O的扫描电子纤维照片；

图9是暴露了下层基质的CFU-O的横截面的扫描电子显微照片；

图10是位于CFU-O前缘的浅度矿物化的胶原纤维的扫描电子显微照片；

图11是通过分化成骨细胞而铺在聚乙烯界面上的非胶原基质(看起来象小球)的扫描电子显微照片；

图12是含有成熟CFU-O中心的重度矿物化的胶原质；

图13图解了流式细胞计数数据，其证实了得自WJ的细胞是77.4％MHC I和MHC II阴性的；

图14是马森氏三色染色(Masson’s trichome-stained)的骨结节横截面的黑白重现，其显示了胶原质分布(其中细胞已被俘获(骨细胞))和外周细胞的多层化(所述外周细胞中的一些已被精制成的胞外基质所围绕)；

图15显示了与定型的骨祖细胞子群和总骨祖细胞子群的扩增相比，粘着的血管周WJ群落的潜在扩增；

图16显示了0-144小时的血管周WJ细胞的分化，其图解了具有0-24小时的停滞期、24-72小时的对数期和72-120小时的平稳期的正常生长曲线。整个培养期过程中的倍增时间(doubling time)为24小时，而在对数期期间其为16小时；

图17显示了经五次传代(over 5 passages)后显示的WJ细胞的主要组织相容性复合体(MHC)表达，由于自由解冻(free-thawing)而在其表达中发生的改变，以及由于再培养而导致的后续表达；

图18显示了HUCPV细胞的CFU-F频率；

图19显示了HUCPV细胞从P0到P9的倍增时间。HUCPV细胞证实了从P2到P8的20小时的相对稳定和迅速的倍增时间；且

图20显示了HUCPV细胞的分化，其证实了＞10⁴细胞可在30天培养中得到。通过这种迅速扩增(expansion)，1,000治疗剂量(TD)可在24天培养中生成；且

图21显示了胶原酶浓度和消化时间对细胞收获的效果；

图22显示了本发明的生物反应器的大体构造的透视图；

图23显示了通过水平旋转的细胞培养容器的部分截面图，期图解了本发明的一项应用；

图24是沿图23的23--23线截取的截面图；

图25是沿图23的24-24线截取的截面图。

具体实施方式

本发明提供了一种作为包含人祖细胞的迅速增殖的细胞群落来源的脐带胶质(WJ)提取物。

为本说明书的目的，所提取的细胞群落成分可被称为人脐带血管周(human umbilical cord perivascular，HUCPV)细胞。HUCPV细胞群落构成多能祖细胞的富含来源(rich sourcr)，所述多能祖细胞在其表型方面是独特的，特别是在通过其中所含细胞子群的种类展现时。同样为本说明书的目的，从中提取本发明的细胞的脐带胶质的血管周区域可被称为血管周组织。

如本文所用的，术语“祖细胞(progenitor cell)”是指以下细胞：其在受控和/或限定条件下分化成指定表型的细胞。“祖细胞”的特征还在于除分化之外自我更新(self-renew)能力。这种自我更新的特征被称为“增殖”。因此，骨祖细胞是当在为其定型和分化建立的条件下培养时将定型为骨母细胞谱系并最终形成骨组织的祖细胞。作为“无免疫能力的(immuno-incompetent)”或“非免疫原的(non-immunogenic”的祖细胞是以下细胞：该细胞具有对与第I类和第II类主要组织相容性复合体(MHC)相关的表面抗原为阴性的表型。这样的祖细胞在本文中也称为HLA双重阴性。

从WJ提取的HUCPV细胞的特征还在于“迅速增殖”，其是指相对于其它已知祖细胞群落，所提取的细胞将在祖细胞扩增的标准条件下生长的速度。如可从本文所述实验结果中意识到和如图16所示的，本发明的祖细胞群落可在至少约25小时内倍增，且可快至7-15小时，因此其扩增远快于其它已知骨祖细胞群落和从WJ提取的其它祖细胞群落。

本发明的细胞和细胞群落可通过从人脐带的WJ提取并随后与来自脐带血或外周血的造血干细胞共培养而得到。不同于现有技术，根据本发明，这种细胞的第一组从与脐带维管结构外壁相连(即，邻近)的WJ提取。与脐带维管结构外表面相连或非常接近的脐带胶质位于名为血管周区域的区域内，并且典型地在将血管从脐带切除时保持与维管结构相连，正如例如从脐带提取脐带胶质或从脐带及相连的西代胶质提取血管时所作的那样。已明显发现在现有技术实践中通常已被丢弃的该血管周区域内的脐带胶质是具有本文所述特征的祖细胞的富含来源。因此，本发明使用了来自脐带胶质的这种血管周区域的组织作为可用的人祖细胞(名为HUCPV细胞)的来源。

在具体实施方式中，HUCPV细胞群落的特征在于以下祖细胞的存在：所述祖细胞具有许多指示功能性间充质细胞(非造血的)表型的标记物，优选地，以下标记物存在于这些祖细胞上：包括CD45-、CD34-、SH2+、SH3+、Thy-1和CD44+。其它优选标记物也可用于鉴定功能性间充质细胞表型(mesenchymal phenotype)。优选地，该群落的特征在于藏匿(harboring)对3G5抗体呈阳性的细胞，所述3G5抗体是指示周细胞的标记物。所提取的细胞群落通常是形态上均一的纤维母细胞群落，其优选表达α-肌动蛋白、肌球蛋白和波形蛋白，并且提供可通过根据例如细胞分类原理和技术进行的培养条件和选择的操作而由其获得所需的细胞子群的非常有用的来源。

为从人脐带提取这种血管周细胞，在一个优选实施方式中，在提取过程中应注意以避免提取到脐带血细胞、脐带的上皮细胞或内皮细胞、以及来自脐带血管结构的细胞，其中血管结构定义为小动脉或静脉血管的内膜、中膜或外膜。获得基本不含这些不想要的细胞的提取物的优选方法可通过以下方式实现：在切开之前小心地冲洗和清洗脐带，然后将血管小心地从脐带内切除。另一种优选方法通过以下方式实现：小心地将血管拉离周围的脐带组织，在这种情况中血管周组织与血管一起被切除。应理解的是，当注意以避免提取到这些不想要的细胞时，它们可能仍少量存在于所得提取物中。这是可接受的，制药其发生频率低至不会妨碍本文所述的观察结果，即，得自间充质、特别是中胚层来源的细胞群落的观察结果，CFU-F、CFU-O和CFU-A形成的频率和速度，以及在所培养的群落中观察到的HLA表型的表征。仅在制备了HUCPV细胞群落之后，其才与造血干细胞群落共培养。

位于血管周区域内的组织是邻近脐带维管结构外壁的脐带胶质，并且典型地位于由血管外壁延伸至约3mm处的区域内。优选，目标提取区域可位于从三根血管中任一种的外壁延伸至约2mm、更优选约1mm处。从该区域提取WJ可容易地实现，优选使用实施例中所述的技术。在实施例中披露的优选实施方式中，血管可用作WJ的载体，且血管自身可用作从其中提取祖细胞的基质。因此，在本发明的实施方式中，带有血管周组织的薄覆层脐血管可优选通过外科手术方式或更优选手动地从新鲜脐带切除，所述新鲜脐带已被彻底清洗以基本去除所有脐带血污染物。带有邻近的血管周组织的血管或其成分随后在提取培养基(优选例如磷酸盐缓冲的盐水(PBS)，其中含有适用于消化其中驻有所需细胞的血管周组织的胶原质基质的酶)中于约37℃进行温育。为此目的，在优选在约0.1mg/mL到约10.0mg/mL、更优选0.5mg/mL的优选浓度下用胶原酶进行消化是合适的。酶的类型、浓度和温育时间可变，且另外可选的提取条件可通过在所选条件下监控细胞表型和群落的产率而容易和简单地确定。例如，在优选实施方式中，4mg/mL的较高胶原酶浓度(例如，1-4mg/mL)对于约3小时的较短消化时间(例如，1-5小时)也是合适的。在提取过程中，封住血管的两端，优选打结或夹住，并且可被悬吊于提取培养基上方以避免受容器中所含其它溶液的污染。因此应意识到本发明的脐带胶质提取物基本不含脐带血细胞、脐带上皮细胞、脐带内皮细胞和血管平滑肌细胞。

可用于分离步骤的其它优选消化酶和优选浓度是，例如，约0.1到约10mg/ml的透明质酸酶，约0.05到约10mg/ml的胰岛素，以及EDTA。对于约3小时的消化时间，优选的胶原酶浓度为约4mg/ml，尽管较廉价的优选替代方案为使用约0.5mg/ml进行约18-24小时。胶原酶浓度的又一其它优选替代方案如图21所示。优选地，消化于血管开始破裂之时或之前停止，如图21所示，所述破裂根据胶原酶浓度而在不同时间点发生。

在约0.5mg/ml胶原酶提取培养基的优选实施方式中在约24小时之后，优选12-36小时，更优选18-24小时，或者在约4.0mg/ml胶原酶提取培养基的优选实施方式中在约3小时之后，取出血管，留下含有人祖细胞的血管周组织提取物。这些细胞在祖细胞扩增的标准条件下扩增。这些细胞可例如在聚苯乙烯(例如，在聚苯乙烯培养皿或培养瓶中)上进行选择以选择粘着细胞，并随后保持在合适的培养培养基中。在本发明的一个实施方式中，将所提取的细胞在搅拌悬浮的条件下培养以用于扩增，并且进行或不进行预先的粘着细胞选择，所述搅拌悬浮的条件如例如Baksh等在WO02/086104中所述般，该文献的公开内容在此引入作为参考。

在本发明的一个具体实施方式中，所提取的HUCPV细胞群落在粘着条件下培养，且残留在上清液中的非粘着细胞被回收以用于进一步培养。这些“粘着后”细胞通过自发形成骨结节和脂肪细胞的倾向而被表征为一个子群，并且构成了本发明的一个有价值的实施方式。因此，在该方面，本发明进一步提供了从血管周细胞提取的祖细胞的分离群落，所述细胞具有形成包括骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和肌肉细胞在内的若干分化细胞类型中的至少一种的倾向，其中这种祖细胞构成了在粘着条件下培养的HUCPV细胞的非粘着成分。这种细胞通过例如下述优选方法来获得：在粘着条件下培养由血管周组织提取的HUCPV细胞，选择非粘着细胞群落，然后将非粘着细胞群落在可用于(1)扩增所述群落或(2)使其分化为所需细胞表型的条件下进行培养。这里可用的培养条件是如本文所例举的已建立用于这种扩增和分化的那些条件。

还应理解的是本发明包括在标准粘着培养条件下培养和扩增的HUCPV子群(subpopylation)。它们随后于造血干细胞共培养。

提取物中存在的细胞可直接或在其扩增后使用已确立的技术来进行分类，以便提供富含指定表型细胞的可扩增子群。因此，本发明还提供了从血管周组织提取的细胞群落，所述群落富含多能间充质祖细胞、骨祖细胞、富含祖细胞的细胞群落、以及富含多能和骨祖细胞的细胞群落。优选地，该细胞可被进一步富集以使用对周细胞标记物3G5的抗体来仅选择对其呈阴性的那些细胞，以及仅选择对主要组织相容性复合体(“MHC”)第I类和第II类标记物中的一种或两种呈阴性的细胞。

如图17所示，已发现祖细胞群落中MHC标记物的分布通过冰冻-解冻而变化。当新鲜细胞传代(passaging)时，MHC双重阴性细胞的频率相对恒定/少量升高。然而，已发现，如本文的实施例注意到的，在冰冻后沉积的细胞中，祖细胞群落中MHC双重阴性细胞的频率明显提高。因此，在本发明的祖细胞群落中，MHC双重阴性表型的细胞的特征还在于在冰冻后频率提高的倾向。这种冰冻是以本领域已知的平常方式进行的，例如通过首先制备细胞等分实验，然后将该细胞制剂存储所需时间。应理解，如果需要，这种细胞可保存许多年。

在一个实施方式中，本发明由此进一步提供了一种通过以下步骤生产MHC双重阴性的祖细胞的方法：获得如本文所述的细胞周组织提取物或者其MHC双重阴性成分，将该提取物或其成分经历冰冻，然后将所冰冻的细胞共培养。如上所述得到的细胞潜在地可用于诱导人类受试者的组织形成或修复。

由共培养的提取物或由其适当富集的共培养成分得到的细胞群落可直接或在其扩增后用于提供分化的细胞群落。适用于其分离和辅剂以及适用于其扩增的所有步骤在本领域中均已确立，并且在本文中例举。扩增可通过例如在诸如IL-3和干细胞因子及本领域已知的类似试剂的因子的存在下进行。在一个实施方式中，使用建立用于由其生长骨组织的条件，使本发明的细胞群落、特别是其中的骨祖细胞经历分化。在一个优选实施方式中，被称为定型的骨祖细胞(commitedosteoprogenitor)的来自本发明的祖细胞群落的共培养的骨祖细胞子群具有在不存在成骨添加物(osteogenic supplement)的情况下分化的能力。另外可选地，在另一个优选实施方式中，骨祖细胞在用诸如地塞米松的一种或多种刺激成骨的试剂补充的培养基中培养。另外，在又一个实施方式中，共培养的细胞也与适用于刺激分化为其它得自间充质的组织的添加物一起培养(Caplan，1991)，所述其它得自间充质的组织包括软骨、肌肉、腱、脂肪等，均根据本发明的标准实践。

作为在体外培养本发明细胞群落中细胞的另一种实际可选的方案，应意识到在另一个优选实施方式中，细胞可体内移植以便在患者体内直接诱导所需组织的形成。

为用于移植中，本发明的细胞可作为组合物提供，该组合物还包括可用于将其递送到选择进行工程的组织位置的载体。所述细胞以有效实现预期效果的剂量存在。预计优选的有效细胞剂量将为约10³至约10⁷细胞/剂，更优选10⁴-10⁷细胞/剂，最优选2x10⁵细胞/剂。选择用于递送那些细胞的载体在组合物中可根据已确立用于活细胞递送的治疗可接收可药学可接受的步骤而改变。在实施方式中，细胞被用于骨组织工程的目的。在一个实施方式中，细胞与支架材料形式的载体一起存在，所述支架材料用于将细胞作为植入体定位于骨位置，所述骨位置是有缺陷或断裂的，或者进行了外科手术准备以接收植入体。多种材料适合作为用于该目的的载体。在一个具体实施方式中，载体由诸如磷酸钙、PLGA或其混合物的可吸收材料形成。可使用等同物质，条件是其允许细胞在组合物形成和递送期间保持存活，另外在植入位置处生理可相容。

适用于递送祖细胞的仍然另外的优选载体将包括诸如PBS和包括透明质酸、明胶及其它可用等价物的胶体的媒介物，条件是它们具有细胞存活所需的pH和其它性质。

还应意识到本发明的细胞可用于向所需组织位置处递送基因表达产品。即，本发明的共培养的细胞可根据本发明的实施方式而在基因上操作以接收和表达在表达时得到可用于组织修复过程的产品的基因，诸如各种生长因子，在骨组织的优选实施方式中，其可有用地包括PTH、BMP、降血钙素等。该细胞也可发展为用于其它目的的转基因物，诸如通过引入改变细胞表型的基因使其更强壮或更适于指定最终用途。

在以下实施例中描述本发明的实施方式。本文的实施例是为了说明本发明实施方式的目的，且并非意图比所要求者更严格地限制本发明。

实施例

从人脐带胶质收获祖细胞

在分娩后立即从足月的剖宫产婴儿收集脐带。然后由外科医生将脐带转移到含有培养基(80％的α-MEM，20％的抗生素)的无菌容器中。

从这点开始，所有步骤均在生物安全柜中无菌进行。脐带在磷酸盐缓冲的盐水(PBS)(--Mg²⁺，--Ca²⁺)中洗涤三次以尽可能多地去除脐带血，并且被转移回含有培养基的容器中。用无菌剪刀切下约6cm长的脐带，并将其放置到无菌的软木解剖板上。将其余的脐带(30-45cm)放回填充有培养基的容器中，并放入37℃的保温箱中。将6cm的脐带段相对于其螺旋进行“扭转(twist)”，并在两端钉住以露出脐带上皮组织的光滑和拉直表面。使用精密剪刀(fine scissor)，将该脐带沿其长度切割约1-2mm深以露出其WJ。从经切割的上皮组织的每个“皮瓣”开始，使用解剖刀的钝缘将WJ由其内表面扯下，并且把所扯下的上皮组织(约0.5mm厚)固定住。该步骤导致WJ暴露，并且使包埋在其中的三根血管从头到尾变成直的而不是沿其纵轴成螺旋。小心地用37℃的PBS不断洗涤该部位。用钳子将血管末端之一分离，将其沿其长度扯下，直到其不再含WJ基质的主体。或者，可将血管中部从基质剖下，用小钳子夹持住，并且向其每个末端的方向将其扯下。一旦通过任一方法使其自由，血管被约1-2mm的带有细胞的WJ基质所围绕。随后将剖下的血管用外科血管钳、蚊式夹子在其两端夹住或者将其缝合以产生防止液体通入或离开该血管的“环(loop)”。将该环立即与剪刀一起放入含有带有PBS(--Mg²⁺，--Ca²⁺)的0.5mg/ml胶原酶溶液的50ml管中，并放入37℃的保温箱内。将其余两根血管以类似方式剖下，成环，并且也置于保温箱内的胶原酶溶液中。在去除血管之后，构成血管周组织的WJ条带可容易地从上皮组织上剖离并放入含有胶原酶溶液的50ml管中。然后将其余的上皮层置于生物危险废品容器中。使用相同方案处理其余30-45cn的脐带，产生含有“环”或血管周组织条带的15-25根管。

脐带胶质祖细胞培养的开始

在18-274小时之后，借助其所附的悬吊夹或缝线以及吸管来取出“环”，然后用PBS将其余悬浮液稀释2-5倍并于1150rpm离心5分钟以得到作为位于管底部的小球的细胞成分。在去除上清液之后，于室温将细胞在8倍体积的4％ NH₄Cl中进行5分钟的再悬浮，以便溶解(lyse)任何污染性红血细胞。然后将悬浮液于1150rpm再次离心5分钟以分离作为小球的细胞成分，并去除上清液。在使用血细胞计数器对细胞进行计数之后，将它们直接沉积(plated)到T-75cm²的聚苯乙烯组织培养皿上，并使其于37℃温育34-72小时以使细胞附着在聚苯乙烯表面。然后每两天更换培养基。

在7天后使用0.1％胰蛋白酶溶液对附着的细胞进行传代(passaged)，此时当通过光学显微镜观察时细胞显示80-90％汇合(confluency)，并且正如在相衬显微镜下所显露的和光学性质的预期变化所表明的，存在“矿物化”聚集体形成的证据。在传代时，细胞在补充培养基(SM)(75％α-MEM或D-MEM，15％ FBS，10％抗生素)中以4x10³细胞/cm²沉积在35mm聚苯乙烯组织培养皿或6孔培养皿中，并且用10^-8M Dex、5mMβ-GP和50ug/l抗坏血酸处理以检测这些细胞的骨形成能力。在培养的第2、3、4和5天对这些板进行观察以确定其CFU-O，其也称为“骨结节”形成。

为检测这些细胞的软骨形成能力，于1150rpm将2x10⁵细胞离心5分钟以得到作为小球的细胞。一旦去除上清液后，将细胞保持在用10ng/ml转化生长因子-β(TGF-β)(以及任选地用10^-7M地塞米松)补充的SM中。经补充的培养基每两天更换一次，保持培养3-5周，此时将其收获以进行组织学研究(用10％中性福尔马林缓冲液(NFB)固定)，包埋在石蜡中，切割成6um段，并且进行染色以确定胶原质II的存在(抗体染色)和葡萄糖胺聚糖的存在(Alcian蓝染色)。为评价细胞的形成脂肪的分化能力，最初将其在SM(含有D-MEM)(其每两天更换)中于6孔培养皿中培养，直到其达到60％汇合。此时，将培养基更换为成脂肪诱导培养基(adipogenic induction medium，AIM)(8/8％ D-MEM，3％ Fbs，33uM生物素、17uM泛酸盐、5uM PPAR-γ、100nM牛胰岛素、1uM地塞米松、200uM异丁基甲基黄嘌呤和10％抗生素)。AIM每2天更换，共进行10天，此时将细胞在10％ NFB中固定并用Oil Red O染色，后者对脂肪细胞红的脂质液胞进行染色。最后，为评价细胞的肌肉形成能力，将其最初在T-75cm²组织培养瓶中于SM(含有D-MEM)中进行培养，直到其达到80-90％汇合，此时将培养基更换为肌肉形成培养基(myogenic medium，MM)(75％ D-MEM，10％ FBS，10％马血清，50uM氢化可的松和10％抗生素)。MM每2天更换。培养3-5周后，将细胞从培养表面去除(见次代培养方案)，溶解以得到其mRNA，并通过rtPCR进行评价以确定若干肌肉形成基因的存在，所述肌肉形成基因包括：MyoG，MyoD1，Myf5，肌球蛋白重链，肌球蛋白和肌间线蛋白。

母细胞试验

细胞增殖试验

以下细胞增殖试验可被期望得自第一细胞培养组：在每周一次的传代过程(每6天发生)期间，3x10⁴细胞的等分试样被沉积到34个6-孔聚苯乙烯组织培养皿的每个孔中。在培养的第1、2、3、4、5和6天，6-孔培养皿的四个进行了传代，并对细胞进行计数。这些细胞的指数扩增被绘成图表，并且计算这些培养中细胞的平均倍增时间。结果如图16所示。应注意PVWJ细胞培养的倍增时间在整个培养期间为约24小时。在对数期，倍增时间是可观的16小时。这比得上文献报道的对于骨髓间充质细胞的约33-36小时的倍增时间(Conget andMinguell，1999)和对于来自脂肪组织的间充质干细胞的约3.2天(Sen等，2001)，为观察连续传代的增殖，将3x10⁵细胞沉积到4个T-75培养瓶(n＝4)中，并且加入SM，其每2天更换一次。培养6天后，对细胞进行次代培养(见上文的次代培养方案)，并且使用血细胞计数器进行计数。将3x10⁵细胞的等分试样接种到新的T-75培养瓶中，培养6天，并重复计数的过程。该步骤从P0到P9对4个脐带样品重复。

图18图解了HUCPV细胞的预期CFU-F频率。1∶300的频率显著高于对其它间充质祖细胞来源所观察到的，所述其它间充质祖细胞包括新生期BM(1∶10⁴)(Caplan，1991)和得自脐带血的“无限制的成体干细胞”(USSC)(Kogler等，2004)，其以1∶2x10⁸的频率发生。图19图解了连续传代的HUCPV细胞的增殖速率。P0时的60小时初始倍增时间下降到P1时的38小时，其从P2-P8下降并保持为20小时。然后细胞开始进入衰老期，且其增殖速率迅速下降。有趣的是，当在培养的最初30天中观察时(图20)，HUCPV细胞在30天之内衍生到2x10¹⁰细胞。当一个治疗剂量(TD)定义为2x10⁵细胞时(Horwitz等，1999)(Horwitz E M，Prockop D J，Fitzpatrick L A，Koo W W，GordonP L，Neel M et al.Transplantability and therapeutic effects of bonemarrow-derived mesenchymal cells in children with osteogenesisimperfecta.Nat Med 1999；5：309-313.)，HUCPV细胞可在10天的培养中得到1TD，且在24天的培养中得到1,000TD。

如图15所示，得自血管周组织的祖细胞包括不同的祖细胞子群。

可观察到细胞的成软骨、成脂肪和成肌肉分化。

连续稀释和CFU-F试验

将1x10⁵、5x10⁴、2.5x10⁴、1x10⁴、5x10³、1x10³的HUCPV细胞稀释液接种到6-孔组织培养皿上(Falcon# 353046)，并每2天进给SM。在培养10天时对每个孔中包含＞16细胞的群落数进行计数，并在14天确认。由此确定CFU-F频率，即产生一个群落所需的细胞平均数目，为1CFU-F/300沉积的HUCPV细胞。根据该频率，计算提供300HUCPV细胞所需的单位体积(对三个脐带中的每个进行三次重复)，并且将8个增量单位体积的HUCPV细胞接种到6-孔培养皿上。同样，在培养10天时对包含＞16细胞(CFU-F)的群落进行计数以测定使用增量接种的CFU-F频率。

数据分析

四环素染色：在结束之前将四环素(9ug/ml)加入到培养中。在结束时，将细胞在Karnovsky′s固定液中固定过夜，随后通过UV-激发的荧光成像观察以确定结节区域的矿物成分的四环素标记。

扫描电子显微镜(SEM)：通过以下方式制备用于SEM的代表性的样品：最初将它们在70％、80％、90％和95％乙醇中放置1小时，随后于100％乙醇中浸泡3小时。随后将它们进行临界点干燥。用PolaronSC515 SEM Coating System在试样上溅射涂布一层约3nm的金层，随后在Hitachi S-2000扫描电子显微镜中以15kv的加速电压于不同的放大倍数对其进行检测。生成的图像用于证实形态学上可鉴定的骨基质的存在。

细胞群落的HLA-分型的流式细胞计数：＞1x10⁵细胞的测试细胞群落在含有2％ FBS的PBS(StemCell Batch #：S13E40)中洗涤，并且于4℃在PBS+2％ FBS中再悬浮30分钟，所述PBS+2％ FBS含有饱和浓度(1∶100稀释)的以下轭合的小鼠IgG1 HLA-A，B，C-Pe和HLA-DR，DP，DQ-FITC。细胞悬浮液用PBS+2％ FBS洗涤两次，用1ug/ml 7-AAD(BD Biosciences)染色，并在PBS+2％ FBS中再悬浮以使用ExpoADCXL4 software(Beckman-Coulter)在流式细胞计数器上进行分析(XL，Beckman-Coulter，Miami，Fla.)。正染色(positive staining)定义为荧光信号的发射，所述荧光信号超出了由来自用匹配的同型抗体染色的对照群落的＞99％细胞所得到的水平(FITC-和PE-轭合的小鼠IgG1，.kappa，单克隆同型标准物，BD Biosciences)。对每个试样，收集了至少10,000列出模式事件。所有的点均在EXPO 32 ADC分析软件中生成。

除了HLA分型之外，HUCPV细胞群落也针对其它标记物进行了评价，得到以下结果：

1标记物表达CD 105(SH2)++CD73(SH3)++CD90(Thy1)++CD44++CD1 17(c-kit)15％+MHC 175％+MHC II-CD106(VCAM1)-STRO1-CD123(IL-3)-SSEA-4-Oct-4-HLA-G-CD34-CD235a(血型糖蛋白A)-CD45-

结果

骨结节群落的光学显微照片：图3、4和5说明了在第3天和第5天存在的CFU-O。它们证实了围绕由产生骨基质的多边形细胞的“聚集”所代表的结节区域的“纤维母细胞样”细胞的汇合层。这些CFU-O在Dex(+)和Dex(-)培养中均被观察到，且经连续传代显示相似的形态。

CFU-O培养的四环素标记：培养物的四环素标记用于标记与骨的生物矿物相有关的新形成的磷酸钙。培养物的四环素标记与矿物化的结节区域相符，后者通过将培养物曝露于UV光而直观化。图6和7描绘了祖细胞第3天培养和第5天培养的四环素标记的CFU-O培养物。这些图像通过UV-激发的荧光成像和照相生成。

扫描电子显微镜：在SEM下观察CFU-O以确定矿物化胶原质基质的形成，其证实了从成熟CFU-O中密集矿物化的基质的胶原质形成的最初阶段的CFU-O形成。图8、9、10、11、12和14代表CFU-O的扫描电子显微照片。

HUCPV细胞群落的流式细胞计数 & HLA-分型：流式细胞计数鉴定代表两种主要组织相容性复合体(MHC)的细胞表面抗原，其证实了所分离细胞群落的77.4％为MHC^-/-。图13说明了相对于阴性对照的流式细胞计数结果。图17显示了冰冻-解冻对祖细胞群落中MHC^-/-细胞频率的影响。

冰冻-解冻的影响

将＞1x10⁵细胞的测试细胞群落在含有2％ FBS的PBS中洗涤，并将其于4℃在PBS+2％ FBS中再悬浮30分钟，所述PBS+2％ FBS具有饱和浓度(1∶100稀释)的以下轭合的小鼠IgG1 HLA-A，B，C-PE(BDBiosciences #555553，Lot M076246)(MHC I)、HLA-DR，DP，DQ-FITC(BD Biosciences #555558，Lot M074842)(MHC II)和CD45-Cy-Cychrome(BD Biosciences # 555484，Lot 0000035746)。细胞悬浮液用PBS+2％ FBS洗涤两次，并在PBS+2％ FBS再悬浮以便使用ExpoADCXL4 software(Beckman-Coulter)在流式细胞计数器上进行分析(XL，Beckman-Coulter，Miami，Fla.)。正染色定义为荧光信号的发射，所述荧光信号超出了由来自用匹配的同型抗体染色的对照群落的＞99％细胞所得到的水平(FITC-、PE-和Cy-cychrome-轭合的小鼠IgG1，.kappa，单克隆同型标准物，BD Biosciences)，其通过人BM样品的正荧光来确认。对每个试样，收集了至少10,000列出模式事件。所有的点均在EXPO 32 ADC分析软件中生成。

传代培养&细胞接种：在7天后使用0.1％的胰蛋白酶溶液进行次代培养(传代)，此时当通过光学显微镜观察时其显示80-90％的汇合。当传代时，通过流式细胞计数来观察细胞的MHC-A₅B，C、MHC-DR，DP，DQ和CD45表达。然后将其以4x10³细胞/cm²于SM中沉积在T-75聚苯乙烯组织培养瓶中，并且用10^-8M Dex、5mM BGP和50ug/ml抗坏血酸处理以测试这些细胞的骨形成能力。在第2、3、4、5和6天观察这些培养瓶的CFU-O或骨结节形成。来自传代过程的任何残余细胞也被冷沉淀以备将来使用。

细胞的冷沉淀：在1ml的总体积中制备1x10⁶PVT细胞的等分试样，所述1ml总体积由以下组成：90％ FBS，10％二甲亚砜(DMSO)(Sigma D-2650，Lot# 11K2320)，滴入到1ml聚丙烯低温小瓶(cryo-vials)中。将小瓶放入到-70℃冷冻器中过夜，并于次日转移到-150℃冷冻器中长期存储。低温保存1周后，将PVT细胞解冻并通过流式细胞计数器观察其MHC-A₅B，C、MHC-DR，DP，DQ和CD45的表达。使用第二方案，其中PVT细胞在低温保存1周后解冻，再培养1周，次代培养，随后通过流式细胞计数器分析其MHC-A，B，C、MHC-DR，DP，DQ和CD45的表达。

结果：结果如图17所示。应注意新鲜细胞群落中的MHC^-/-频率通过若干次传代后得以保持。当新鲜细胞在传代后于-150℃冰冻一周随后立即分析其MHC表型时，该被分析的群落显示明显提高的MHC^-/-表型细胞的频率。因此，且根据本发明的实施方式，MHC^-/-+表型细胞可有用地通过冰冻从PVT细胞群落富集。更进一步的富集通过对先前冰冻的细胞的培养物进行传代来实现。特别是，且如图17中所见的，低温保存的细胞的第一次传代将MHC^-/-细胞的相对群落提高到多于50％，且那些细胞的后续冰冻和传代得到了大于80％、85％、90％和95％的MHC^-/-群落。

粘着后HUCPV细胞成分的收获

从血管周组织回收祖细胞的产率可通过以下方式得到提高。为收获HUCPV细胞的“粘着后”(PA)成分，将最初接种(initially seeded)的HUCPV收获的上清液再沉积到新的T-75培养瓶上，并于37℃、5％CO₂温育2天。然后用新鲜的SM供养(fed)最初接种的HUCPV培养瓶。2天后，将上清液再次转移到新的T-75培养瓶中，并用新鲜的SM供养附着的细胞。最后，将第三次接种的培养瓶的上清液抽出，然后将该培养瓶用新鲜的SM供养。(因此，对于每个脐带，产生3个培养瓶：最初接种的培养瓶，第一PA成分和第二PA成分。)与最初接种的细胞相比，可看到这些细胞具有类似的相同特性，证实了通过分离这些PA成分可得到较高的细胞产率。

在生物反应器中扩增

现在参考图22，描述了本发明的一般结构。框架装置10具有垂直和隔开的单独板11，12，它们支撑电动机皮带轮14和箱体皮带轮13，其中皮带轮13，14通过皮带传动相连。电动机皮带轮14与电动机16配合，后者可通过公知方式控制以提供所需的传动速率。

箱体皮带轮13与传动轴17配合，后者延伸穿过转动联轴器18到达入口端盖20。入口端盖20连接在中心组件21和管状外培养筒22上。在中心组件21和培养筒22的另一端是出口端盖24。

框架装置10上的空气泵25通过输入管26连接到过滤器27。来自泵25的输出管28与转到联轴器18相连，在这里空气输入从固定式环形套圈连接到转动传动轴17的内部通路。

现在参考图23，本发明的细胞培养系统在部分截面图中描述，其中转动联轴器18接收输出管28且传动轴17具有中心空气输入通路30以用于空气通过。传动轴17连接到联结轴17a，其延伸通过入口端盖20中的中心开口31。联结轴17a线状地(threadedly)连接到圆筒形的中心支承组件32。中心通路30向内延伸通过轴17，17a到达横向开口33，该横向开口33将空气输入通路30与中心支承组件32的外表面35相连。中心支承组件32被密封地收纳在入口端盖20的沉孔中，且在其另一端，支承组件32被密封地收纳在出口端盖24的沉孔中。管状的输出组件35a线状地通过出口端盖24中的孔连接到支承组件32的盲孔，且出口联轴器的空气输出通路36通过横向开口37连接到中心支承组件32的外表面35。管状的氧气可渗透膜40设置在中心支承组件32上方，并且其端部延伸超出中心支承组件32的开口33和37，由此使得膜40能通过O型圈或类似物而密封地连接到中心支承组件32。由此通过到输出横向开口37和到输出通路36的膜40内壁和中心支承组件32外壁之间的环形空间提供了用于通过通路30和横向开口33来输入空气的空气通路。膜40可由硅橡胶制成，其可在气压下工作以允许氧气通过膜壁渗透入围绕该膜的液体培养基的环面和允许二氧化碳反向扩散。

与中心支承轴32同轴地设置的是管状的外筒22，其可为玻璃。筒22密封地收纳到端盖20，24中，并在筒22的内壁和膜40的外壁之间界定了环形培养室。在入口端盖20上是圆周地隔开的圆筒组件42。当联结轴17a从轴17上脱离时，组件42提供了用于使筒22竖直站立或在垂直位置取样、向系统更换或添加液体的底座。

在出口端盖24中，有两个或更多串口44，45，具有闭合装置46的串口44和被阀47所闭合的串口45。带有流体培养基的皮下注射针可通过一个串口插入以便在从其它串口抽取液体时注入液体。在这点上，样品或培养基可被抽出而不形成空气间隙，由此防止形成零顶空(zero head space)。

因此，本发明的一个实施方式包括中心圆筒芯部，其是透过筒状膜的氧化来源，且膜和容器的外壁绕水平轴旋转。这涉及回转器原理的类型，即，液体沿一个方向水平地或近乎水平地360°旋转的原理可有效地将颗粒悬浮在液体中而无视重力的影响。筒22的旋转速度有效地消除了液体和筒壁之间边界层的粘度梯度。因此，旋转液体和固定壁所引起的剪切效应被明显地减少或消除了。在使用中，在圆筒中产生了基本静止的三维环境。

共培养方法

如上所述制备脐带胶质提取细胞混合物。如下制备造血干细胞混合物：

由外周循环、脐带血或由骨髓抽出物的细胞制品收集全血。然后通过以下方式去除红血细胞成分：通过密度梯度分离(白细胞层(BuffyCoat))来分离有核细胞成分，包括通过分层或Ficoll

或Hetastarch

或其它方法(如免疫提纯和红血细胞溶解)来分离单核细胞成分(MNC)。白细胞层和MNC含有干细胞、祖细胞和分化细胞，但红血细胞成分已被去除。在本发明的一个实施方式中，整个白细胞层或单核细胞成分可被利用而无需进一步处理。或者，MNC通过免疫磁选择来进一步处理以分离诸如CD 133+或CD34+的特定细胞类型。

三维共培养以下述方式起始。通过下述方式来准备培养设备，一个缓慢旋转的横向容器(a slow turning lateral vessel(STLV))：用组织培养洗涤剂洗涤，随后彻底冲洗并在Milli Q超高纯水中浸泡。通过高压釜对该设备灭菌，并且当冷却后用生长培养基冲洗以去除残余物。将该容器放置在层流净化罩柜中并使其竖直站立。将Cytodex 3微载体珠(Pharmacia)预先水化并灭菌，并且悬浮在20mg/ml生长培养基溶液中；每mg含有4000微载体。将该容器用生长培养基充满，以使其基本上没有顶部空隙，所述生长培养基由以下成分组成：最少的基本培养基α(MEM)，补充以胰岛素、转铁蛋白、硒(5ug、10ug、5ug.)、上皮生长因子、丙酮酸钠、10％胎牛血清、hepes缓冲液2g/l、以及青霉素和链霉素(100单位，100mg./ml.)。

62.5ml的20mg/ml微载体溶液加入到容器中以便在容器中得到5mg/ml的最终微载体浓度。随后将该容器最终体积的10％用生长培养基填充。将该容器密封并放置在37℃的含有95％空气、5％CO₂且湿度为95％的层流式CO₂保温箱中以进行1小时的平衡。在1小时末尾，将该容器从保温箱中取出，并用约5x10⁷细胞的等分的WJ混合物和造血干细胞混合物接种。细胞以(9∶1)的比率混和。接种后，将该容器封闭，保持空气鼓泡净化(purge)，并重新放置在保温箱中。该容器配有20ml注射器，其用作依从体积(compliant volume)。容器中生长的每日监控通过DSO2、DO2、葡萄糖、mOsm和pH的分析来实现。在48小时，生长培养基第一层更换，且其后每24小时需要更换培养基。需要进行这些更换以去除有毒的代谢副产品和补充容器中的营养物水平。也必须进行培养基更换以瘦弱由多细胞的类器官培养的相互作用得到的稀有生长产品。在第2天，旋转速度由12rpm升高到15rpm。在168小时，由于消耗提高的结果，培养基组合物被更改为包括额外的100mg./dl.葡萄糖。在216小时，由于高消耗速率，葡萄糖浓度被再次提高到300mg/dl。从138小时开始，培养显示出细胞与细胞的组合。培养于288小时终止，开始分析容器中所含的良好发展的共培养物。从容器中收获生长培养基并将其置于-80℃以用于未来的分析。

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Claims (10)

1.一种制备脐带胶质提取物组合物的方法，包括以下步骤：

-提供带有维管结构的人脐带；

-分离与所述维管结构邻近的血管周组织；

-消化所述血管周组织，由此产生多个碎片；

-将所消化组织的至少一个碎片与造血干细胞共培养以制备包括祖细胞的脐带胶质提取物组合物。

2.通过权利要求1所述的方法制备的脐带胶质提取物组合物。

3.一种脐带胶质提取物组合物，其中所述提取物包括人祖细胞并且通过以下方式得到：将与人脐带的维管结构邻近的血管周组织酶促消化，随后与造血干细胞共培养。

4.如权利要求3所述的脐带胶质提取物，其中所述提取物通过以下方式得到：将带有邻近的脐带胶质的脐带维管结构在合适的细胞提取培养基中经历酶促消化。

5.一种制备组织再生细胞组合物的方法，包括：获得人祖细胞，将所述细胞从如权利要求1或3所述的脐带胶质提取物分离，并将所述细胞与造血干细胞共培养。

6.如权利要求1或3所述的方法，其中所述共培养在二维系统中实现。

7.如权利要求1或3所述的方法，其中所述共培养在旋转容器式生物反应器中实现。

8.一种物质组合物，包括脐带胶质提取物组合物和造血干细胞的扩增混合物。

9.一种生长细胞培养物的方法，包括以下步骤：

-提供生物反应器，所述生物反应器包括：长管形培养容器；封闭所述培养容器两端的端盖；共轴地设置在所述培养容器中并在所述端盖之间延伸的轴；和设置在所述端盖之间的所述轴上方并相对于所述轴密封以用于在所述膜和所述轴之间限定环状通道并在所述膜和所述培养容器内壁之间限定环状培养室的管状膜，所述膜是氧能渗透的以便进行成分气体与所述培养室的交换；

-将所述培养室用流体培养基彻底充满，所述流体培养基含有离散的悬浮物质和脐带胶质衍生细胞与造血干细胞的细胞混合物，所述悬浮物质与所述流体培养基具有不同的密度；

-使所述培养容器、所述轴和所述膜沿一个方向围绕所述培养容器的纵轴旋转，所述纵轴水平设置；

-控制所述培养容器的旋转以便使悬浮液中的离散悬浮物质和细胞组合物因旋转而在流体培养基中的空间位置上处于彼此不干涉的关系；和

-在所述旋转过程中，在压力下于所述环状通道的一端连续引入含氧气体并于所述环状通道的另一端排出该气体。

10.一种防止在脐带胶质提取物组合物中包含大量脐带血干细胞的制备脐带胶质提取物组合物的方法，包括以下步骤：

-提供具有维管结构的人脐带；

-分离于所述维管结构邻近的血管周组织；和

-消化所述血管周组织，由此产生多个碎片；

改进之处包括：

-将所消化的组织的至少一个碎片与造血干细胞共培养以制备包括祖细胞的脐带胶质提取物组合物。

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