WO2023164799A1

WO2023164799A1 - 可促进骨质新生的瓦顿氏凝胶制品

Info

Publication number: WO2023164799A1
Application number: PCT/CN2022/078588
Authority: WO
Inventors: 傅毓秀
Original assignee: 傅毓秀
Priority date: 2022-03-01
Filing date: 2022-03-01
Publication date: 2023-09-07

Abstract

一种脐带瓦顿氏凝胶制品，是由以下两种方法制得：(1)取脐带的瓦顿氏凝胶，以抗冻剂处理后冷冻保存，使用前解冻；或(2)取脐带的瓦顿氏凝胶，直接冷冻干燥，使用前保存于常温、干燥条件中。脐带瓦顿氏凝胶制品用于制备促进骨质新生的药剂，能够使骨母细胞内碱性磷酸酶的表现增加、增加骨母细胞内骨分化基因的表现量、促进骨母细胞分化、加强钙沉积的表现，能有效提升骨质的产量、能使骨缺损处的骨质新生、提升骨缺损处骨母细胞的活性表现、或促使新生骨质的发育。

Description

可促进骨质新生的瓦顿氏凝胶制品

技术领域

本发明关于一种本发明涉及脐带瓦顿氏凝胶制品，其具有促进骨质新生的功效。

背景技术

骨骼因外伤、骨折、感染、与肿瘤转移等因素，导致大量的骨骼被破坏、或移除。当缺损范围超过长骨骨干直径的2倍以上，尽管采用植骨等修复骨质的方法，缺损处仍不会自然愈合时，此现象即称为临界骨缺损(critical-sized bone defect)，骨折部位过大，导致后续骨折的风险也会大增。并且，致密骨骨缺损的再生难度相对高。因此，如何修复致密骨的骨缺损是现今临床骨科相当棘手的难题与困境。

目前临床常见医材治疗的方向分为三种，第一种是自体骨质，自体骨质，需手术取出身体其他部位的骨组织去补缺损处的骨质。缺点是，再次手术的恢复期长、无法取出面积相符的骨组织等缺点。第二种则是异体骨质，即是使用他人因手术取下多余骨组织，经后加工处理的异体骨移植。异体骨移植除了有免疫感染风险外，也存有道德争议。因此，本领域的研究人员们希望研发合适的医材，试图克服临床治疗的困境。

发明内容

本发明提供一种可用于促进骨质新生的脐带瓦顿氏凝胶制品，具有促进骨质新生的功效，其中该制品是由以下两种方法制得：(1)取产妇脐带的瓦顿氏凝胶，以抗冻剂处理后冷冻保存，使用前解冻；或(2)取产妇脐带的瓦顿氏凝胶，直接冷冻干燥，使用前可保存于常温、干燥条件中。

根据本发明，以第(1)种方法制得的瓦顿氏凝胶制品，经抗冻剂处理后冷冻保存，以WJF(Wharton’s Jelly Frozen)表示，仍然保有细胞体。

根据本发明实施例，其中抗冻剂为10％二甲基亚砜(DMSO)溶液。

根据本发明实施例，其中冷冻保存于液态氮中保存。

在本发明的一具体实施例，该瓦顿氏凝胶制品是先以抗冻剂(例如，10％DMSO溶液) 保护，再冷冻保存制成，使用前解冻。

根据本发明，以第(2)种方法制得的瓦顿氏凝胶制品，取产妇脐带的瓦顿氏凝胶直接冷冻干燥制成，使用前可保存于常温、干燥条件中，以WJD(Wharton’s Jelly Dried)表示，不含有细胞形体。

根据本发明实施例，其中冷冻保存保存于-80℃下。

在本发明的另一具体实施例，该瓦顿氏凝胶制品是取下新鲜的瓦顿氏凝胶，直接于-80℃冷冻保存，再施以冷冻干燥，抽干组织间的水分制成。

根据本发明，该两种瓦顿氏凝胶制品能使骨母细胞内碱性磷酸酶的表现增加、增加骨母细胞内骨分化基因的表现量、促进骨母细胞分化、加强钙沉积的表现、有效提升骨质的产量、能使骨缺损处的骨质新生、提升骨缺损处骨母细胞的活性表现、或促使新生骨质的发育。

另一方面，本发明提供该两种瓦顿氏凝胶制品用于制备促进骨质新生药剂的用途。

在下面的描述中阐述了本发明的一个或多个实施例的细节。从以下几个实施例的详细描述以及从所附的权利要求中，本发明的其它特征或优点将是显而易见的。

附图说明

当结合附图阅读时，将更好地理解前面的概述以及以下对本发明的详细描述。为了说明本发明，在附图中示出了目前较佳的实施例。然而，应该理解的是，本发明不限于所示的精确布置和手段。

在附图中：

图1显示本发明新鲜冷冻、或冷冻干燥的瓦顿氏凝胶制品的组织型态分析。其中：(A)为自脐带取下的新鲜冷冻瓦顿氏凝胶制品(WJF)、与(B)经过冷冻干燥处理后的瓦顿氏凝胶制品(WJD)，进行石蜡包埋、切片。(A1、B1)为以H&E染色显示，新鲜冷冻的瓦顿氏凝胶制品呈现致密结构，组织内富含间质干细胞的细胞体；冷冻干燥的瓦顿氏凝胶制品呈现疏散多孔洞结构。(A2、B2)为以天狼星红(Sirius Red)染色显示，新鲜冷冻的瓦顿氏凝胶的胶原蛋白成束而致密地排列，冷冻干燥的瓦顿氏凝胶的胶原蛋白则围绕在空隙外围。(A3、B3)为以PAS染色显示，多醣体充满在瓦顿氏凝胶的组织中。(C、 D)为将冷冻干燥处理的瓦顿氏凝胶制品(WJD)经扫描式电子显微镜下观察组织型态，呈现大小不一的多孔洞结构。(E)冷冻干燥处理的瓦顿氏凝胶，不论是经石蜡包埋切片，再以HE染色定量、或经扫描式电子显微镜影像分析，均呈现大小不一的多孔洞结构；而且，孔洞直径分布大多落在10～70微米范围内。

图2显示大白鼠骨母细胞与两种瓦顿氏凝胶制品共同培养，能提升骨母细胞内骨分化基因的表现量。其中：(A)单独体外培养大白鼠骨母细胞、与冷冻干燥瓦顿氏凝胶制品(WJD)、或新鲜冷冻的瓦顿氏凝胶制品(WJF)非直接共同培养14天后，进行大白鼠RUNX2的RT-PCR检测，结果显示，各组均有大白鼠RUNX2的表现。(B)以及时(real time)RT-PCR定量大白鼠骨母细胞内大白鼠RUNX2的表现量。结果显示，ROB/WJD组、与ROB/WJF组的骨母细胞内大白鼠RUNX2的表现量相比于ROB组，有显着增加(p<0.05)。*：与ROB组相比，有显着差异，p<0.05。

图3显示以碱性磷酸酶定量显示，与冷冻干燥瓦顿氏凝胶细胞制品(WJD)、或新鲜冷冻的瓦顿氏凝胶制品(WJF)共同培养下，均会提升大白鼠骨母细胞内碱性磷酸酶的表现量。其中：(A)为大白鼠骨母细胞，与冷冻干燥瓦顿氏凝胶细胞制品(WJD)、或新鲜冷冻的瓦顿氏凝胶细胞制品(WJF)非直接、或直接的共同培养模式图。(B)为培养14天后，进行碱性磷酸酶的细胞染色。(C)为定量细胞内碱性磷酸酶的浓度，以OD 595吸光值显示，ROB/WJD组、ROB+WJD组、ROB/WJF组、或ROB+WJF组大白鼠骨母细胞内碱性磷酸酶的表现量相比于单独ROB组，有显着增加(p<0.05)。*：与ROB组相比，有显着差异，p<0.05。

图4显示大白鼠骨母细胞与两种瓦顿氏凝胶制品共同培养，能促进骨母细胞钙沉积的表现。其中：(A)为单独体外培养大白鼠骨母细胞、与冷冻干燥瓦顿氏凝胶细胞制品(WJD)或新鲜冷冻的瓦顿氏凝胶细胞制品(WJF)非直接的共同培养21天，以茜素红S(alizarin red S)染色，逐渐放大影像显示，各组骨母细胞于骨分化培养液处理后，均有钙沉积的表现。(B)为定量各组钙离子的浓度，以OD 540吸光值显示，ROB/WJD组、与ROB/WJF组的钙沉积含量都较于ROB组、与ROB+BMP2组为高(p<0.05)。*：与ROB组相比，有显着差异，p<0.05。

图5显示由微电脑断层扫描观察，分别植入两种瓦顿氏凝胶制品治疗组，有效促进大白鼠颅骨缺损的骨质新生。颅骨缺损大白鼠于术后第一、二、三、四、五个月，均以 micro-CT追踪骨愈合情形。其中：(A)Injury+Saline组仅有少量骨质沿缺损处周边生长，Injury+WJD、或Injury+WJF组，除了缺损处周边，缺损范围内亦有游离新生骨质。(B)以红色虚线标示出缺损范围，定量缺损范围内新生骨质的面积百分比。结果显示，Injury+WJD、或Injury+WJF单独治疗组新生骨百分比相比于Injury+Saline组，有显着增加(p<0.05)。*：与同一个月龄的Injury+Saline组相比，有显着差异，p<0.05。

图6显示由H&E染色观察，分别植入两种瓦顿氏凝胶制品治疗组，有效增加颅骨缺损大白鼠新生骨质的面积百分比。其中：(A)各组颅骨水平面组织切片，以H&E染色的低倍全景图，以白色虚线标示出骨缺损范围。再分别由低倍逐渐放大骨缺损的边界区域(B)、或骨缺损的内部区域(C，scale bar分别是1mm与200μm)。(D)由H&E染色来定量新生骨质的面积百分比，结果显示，Injury+WJD组、与Injury+WJF组，新生骨质面积百分比，较Injury+Saline组，有显着增加(p<0.05，n＝5)。*：与Injury+Saline组相比，有显着差异，p<0.05。

图7显示由ALP染色观察，分别植入两种瓦顿氏凝胶制品，有效提升颅骨缺损大白鼠成熟成骨细胞(mature osteoblast)的分布情形。其中：(A)为各组颅骨水平面组织切片，以ALP染色的低倍全景图，再分别由低倍逐渐放大骨缺损的边界区域(B)、或骨缺损的内部区域(C)。(D)为由ALP染色来定量成熟成骨细胞(mature osteoblast)的面积百分比，结果显示，Injury+WJD组、Injury+WJF组，成熟成骨细胞(mature osteoblast)分布面积百分比，较Injury+Saline组，有显着增加(p<0.05，n＝5)。*：与Injury+Saline组相比，有显着差异，p<0.05。

图8显示由抗骨钙素(anti-osteocalcin)免疫组织染色观察，分别植入两种瓦顿氏凝胶制品，有效促进颅骨缺损大白鼠未成熟成骨细胞(immature osteoblast)的分布情形。(A)为各组颅骨水平面组织切片，以抗骨钙素(anti-osteocalcin)染色的低倍全景图，再分别由低倍逐渐放大骨缺损的边界区域(B)、或骨缺损的内部区域(C)。(D)为由抗骨钙素(anti-osteocalcin)染色来定量未成熟成骨细胞(immature osteoblast)的面积百分比，结果显示，Injury+WJD组、Injury+WJF组，未成熟成骨细胞(immature osteoblast)分布面积百分比，较Injury+Saline组，有显着增加(p<0.05，n＝5)。*：与Injury+Saline组相比，有显着差异，p<0.05。

图9显示新生颅骨骨质发展的趋势图。分别以抗骨钙素(anti-osteocalcin)免疫组织染色用以标识出未成熟骨母细胞、以ALP组织染色标识成熟骨母细胞、以H&E染色标识成熟骨质，将三种染色的定量数据加总，可以代表不同阶段的骨质发育，综合评估大白鼠颅骨缺损的骨质新生的趋势。结果显示，不论是植入新鲜冷冻、或冷冻干燥的瓦顿氏凝胶制品于新生骨质的发展都明显较高。

具体实施方式

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的技术人员一般理解的相同的含义。

本文所使用的单数形“一”及“该”包括复数的参照物，除非上下文另有明确说明。因此，举例来说，提及“一样品”包括复数个该样品及其为本发明所属技术领域的技术人员所熟知的等同物。

术语“包括”或“包含”通常以包括/包括允许存在一个或多个特征，成分或组分的意义来使用。术语“包括”或“包含”涵盖术语“由...组成”或“由......组成”。

在此使用的术语“个体”或“主体”包括人类和非人类动物，如伴侣动物(如狗，猫等)，农场动物(如牛，绵羊，猪，马等)，或实验动物(如大鼠，小鼠，豚鼠等)。

如本文所用瓦顿氏凝胶(Wharton's jelly)一词，是指哺乳动物脐带中的瓦顿氏凝胶，其也被称为层间冻(inter-laminar jelly)，即脐带中发现的粘液结缔组织物质，由大量的细胞外基质(extracellular matrix)构成三维架构的胶体，其中富含细胞外基质、胶原蛋白、醣蛋白、与玻尿酸等。在脐带内含两条脐动脉、与一条脐静脉；而包裹血管的结缔组织，即为瓦顿氏凝胶(Wharton’s jelly)。

适用于制备本发明的制品的来源，是来自产妇脐带的“瓦顿氏凝胶(Wharton's jelly)”，可以例如通过解剖，切碎，洗涤，酶促消化，抗冻、冷冻、干燥、烘烤、或其任何组合进行处理。

本文所用的术语“临界骨缺损”是指骨骼因外伤、骨折、细菌感染、与肿瘤转移侵蚀等因素，导致的骨骼被破坏、或移除。当缺损范围超过长骨骨干直径的2倍以上，尽管采用植骨等修复骨质的方法，缺损处仍不会自然愈合时，此现象即称为临界骨缺损 (critical-sized bone defect)。

提供以下的实施例来说明本发明，而且以下的实施例不会被以任何方式解读为限制本发明的范围。

通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例仅用于说明而不是限制。根据本公开内容，本领域技术人员应该理解，可以在所公开的具体实施方式中做出许多改变，并且仍然获得相似或相似的结果，而不偏离本发明的精神和范围。

实施例

1.材料与方法

1.1瓦顿氏凝胶制品的取得

本实验采分娩后的脐带，以无菌方式收集并保存于4℃的汉克平衡盐溶液(Hanker’s balanced salt solution(简称HBSS，Gibco 14185-052)缓冲溶液中，24小时内取下瓦顿氏凝胶，实验器械皆经由高温高压灭菌处理后，于实验中以75％酒精消毒，并于使用前过火。于无菌操作台内将脐带取出，以75％酒精浸泡消毒，置于HBSS缓冲溶液。接着，用已灭菌的器械将脐带纵切开，挑离血管后，其乳白色间质组织即为瓦顿氏凝胶(Wharton’s Jelly)。

取下的瓦顿氏凝胶分成两种处理方式；

(1)第一组为新鲜冷冻的瓦顿氏凝胶制品，以WJF称之。将新鲜的瓦顿氏凝胶，先以抗冻剂(10％DMSO)保护，再冷冻保存，解冻即可使用。

(2)第二组为冷冻干燥后的瓦顿氏凝胶制品，以WJD称之。将新鲜的瓦顿氏凝胶，直接存放-80℃冰箱冷冻后，再使用冷冻干燥机，以抽干组织间水分，密封存放于干燥箱，随时可直接取用。

两组的瓦顿氏凝胶制品，皆进行体外细胞实验、与动物实验。另外，将新鲜、或冷冻干燥瓦顿氏凝胶制品进行石蜡包埋，以组织化学染色观察瓦顿氏凝胶制品的组织型态。

1.2组织纤维染色

将新鲜冷冻、或冷冻干燥后的瓦顿氏凝胶制品进行石蜡包埋，组织切片脱蜡复水后，置于0.1％天狼星红染色(Sirius Red Stain)(Sigma 2610-10-8)染色，随即，将组织片浸泡于二次水清洗。接着，将组织片浸泡至浓度递增的酒精内进行脱水、再浸泡至二甲苯(xylene)，最后封片，进行光学显微镜观察、拍照。

1.3组织醣蛋白染色

瓦顿氏凝胶组织片脱蜡复水后，以高碘酸-希夫染色套组(Periodic acid-Schiff Stain kit)(Sigma 395B-1KT)进行染色高碘酸-希夫染色(Periodic acid-Schiff Stain，简称PAS Stain)。组织片于高碘酸溶液(periodic acid solution)染5分钟，以二次水清洗三次，每次两分钟。接着，将组织片于希夫试剂(Schiff’s regent)染15分钟，以流动的水清洗5分钟。完成染色后，组织间的醣蛋白呈现粉紫色。接着，将组织片浸泡至浓度递增的酒精内进行脱水、再浸泡至二甲苯(xylene)，最后封片进行光学显微镜观察、拍照。

1.4大白鼠骨母细胞(osteoblast)的体外培养

本实验采用出生一天大的出生大白鼠，以过量麻醉致死后，于无菌操作台内，使用灭菌的器械将大白鼠的颅骨取下，切成约1mm大小，并以无菌HBSS缓冲溶液清洗，除去红血球。再与0.1％胰蛋白酶(trypsin)、0.1％胶原酶(collagenase)作用，于37℃烘箱摇晃反应2小时。之后，加入适量10％FBS DMEM以终止胰蛋白酶(trypsin)的效用，再以1500rpm转速，离心5分钟。取下层细胞，加入10％FBS DMEM打散细胞，种在10cm培养皿中，每四天更换一次培养液，约10-14天即可长满，接着，进行细胞继代培养。本实验是以使用第2代的骨母细胞进行实验。

1.5体外培养骨母细胞的分组

体外培养中的骨母细胞(osteoblast)分成五组，第一组，osteoblast组，即2*10 ⁴骨母细胞单独培养在24孔皿中。第二组，osteoblast/WJD组，即2*10 ⁴骨母细胞培养在24孔皿下层，冷冻干燥瓦顿氏凝胶制品培养在上层的迁移皿孔(transwell)内。第三组，osteoblast+WJD组，即2*10 ⁴骨母细胞培养在24孔皿里，同时置入冷冻干燥瓦顿氏凝胶制品(WJD)共同培养。第四组，osteoblast/WJF组，即2*10 ⁴骨母细胞培养在24孔皿(24well plate)下层，新鲜冷冻的瓦顿氏凝胶制品(WJF)培养在上层的迁移皿孔内。第五组，Osteoblast+WJF组，即2*10 ⁴骨母细胞培养在24孔皿里，同时置入新鲜冷冻的瓦顿氏凝胶制品(WJF)共同培养。每三天更换含10％FBS的DMEM培养液，培养14天后，进行碱性磷酸酶细胞染色实验。

1.6转录-聚合酶连锁反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，简称RT-PCR)

经0.05％胰蛋白酶(Trypsin)处理后取得的细胞，与新鲜的颅骨组织，以苯酚(Trizol)(Sigma T9424)反应萃取总RNA，于4℃下离心12000g 15分钟。取上清液与异丙醇等体积混和后，于4℃下离心12000g 10分钟。再以酒精清洗RNA后，以55℃ DEPC水回溶。使用前测量RNA浓度。纯化后RNA，经进行逆转录反应转录合成互补核糖核酸(complementary DNA，简称cDNA)。将cDNA，与Primer、Master Mix进行聚合酶连锁反应。使用下述引子：

Rat-RUNX2

212bp

Forward：5’-GCTTCTCCAACCCACGAATG-3’，

Reverse：5’-GAACTGATAGGACGCTGACGA-3’。

Rat-GAPDH

160bp

Forward：5’-CTCTACCCACGGCAAGTTCAAC-3’，

Reverse：5’-GGTGAAGACGCCAGTAGACTCCA-3’。

完成后PCR产物，以2％琼脂糖凝胶(Agarose gel)进行DNA电泳(Electrophoresis)，完成后放到UV灯显像与照相。

1.7碱性磷酸酶细胞染色实验

以生理实验水清洗细胞，用2.5％戊二醛(glutardialdehyde)固定细胞15分钟；再以5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐/四唑氮蓝(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate/Nitro Blue Tetrazolium，简称BCIP/NBT，Sigma B5655)锭剂溶解在10mL的二次水中，加入24孔皿。在37℃烘箱，避光反应1小时；接着加入10％SDS于盐酸(HCl)中(Ocarino et al.,2008)，在37℃烘箱，避光反应12小时。以吸光值595nm测量数值，定量每组碱性磷酸酶的表现量。碱性磷酸酶的表现越高，代表分化为骨母细胞的数量越多。

1.8茜素红S(alizarin red S)染色

将osteoblast组、osteoblast/WJD组、与osteoblast/WJF组以骨分化培养液(osteogenic medium，R&D CCM007)，培养21天后，每三天更换一次培养液，最后进行茜素红S(alizarin red S)染色实验。以生理实验水清洗细胞，用2.5％戊二醛(glutardialdehyde)固定细胞15分钟；再以2％茜素红S(alizarin red S，简称ARS，Sigma A5533)，加入6孔皿。在37℃烘箱，避光反应1小时；接着加入10％西吡氯铵(cetylpyridinium chloride，简称CPC，Sigma C-0732)(Qiao et al.,2016)，在37℃烘箱，避光反应1小时。以吸光值540nm测量数值，定量每组红色面积，即代表钙的表现量。

1.9实验动物

本实验所使用的实验动物来源是阳明大学实验动物中心提供八周龄大的雄性Sprague Dawley(S.D.)品系大白鼠，体重约为250～280g。饲养方式为45x24x20cm的透明PC笼子饲养，每日照光12小时(上午七点半至下午七点半)，环境温度恒温空调(22±2℃)并且充分供应饲料(Laboratory Animal Diets MF18)与饮用水，每星期更换垫料一次。

1.10临界颅骨缺损(critical-sized cranial bone defect)的大白鼠模式建立

将大白鼠以舒泰50(Zoletil 50)、及盐酸甲苯噻嗪(xylazine hydrochloride,Sigma23076359)腹腔注射麻醉后，以立体定位仪固定头部。使用剃毛刀将毛剃除干净，并以棉花沾取碘酒溶液消毒大白鼠皮肤后，以手术刀将皮肤划开，再以手术剪撑开皮下组织，且分离外骨膜。接着，使用直径8mm的环型钻，在大白鼠顶骨上钻孔，将颅骨与下层脑膜剥离，作为临界骨缺损(critical-sized bone defect)的动物模式。最后缝合皮下组织与皮肤。

1.11动物实验分组

大白鼠共分成三组：

第一组为Injury+Saline组，即颅骨缺损后，不给予任何治疗，仅给予生理食盐水(Saline)。

第二组为Injury+WJD组，即颅骨缺损后，立即在缺损处给予冷冻干燥瓦顿氏凝胶制品(WJD)的治疗组。

第三组为Injury+WJF组，即颅骨缺损后，立即在缺损处给予新鲜冷冻的瓦顿氏凝胶制品(WJF)的治疗组。

1.12微电脑断层扫描(micro-Computerized Tomography Scan，简称micro-CT)

计算机断层扫描影像，经由Amide软件(SOURCEFORGE)利用数字几何处理后，重建三维放射线医学影像。本实验使用小动物光学暨计算机断层仪(U-CT ^UHR，MILabs)，进行活体颅骨扫描，于术后第一天，之后的第一、二、三、四、第五个月，每个月一次，追踪缺损颅骨的愈合程度。

1.13实验动物牺牲、灌流固定、脱钙与石蜡切片

大白鼠以腹腔注射舒泰50(Zoletil 50)、及盐酸甲苯噻嗪(xylazine hydrochloride)麻醉大白鼠，再以4％多聚甲醛(paraformaldehyde)、7.5％苦味酸(picric acid)于0.01M PB灌流固定。将颅骨取出放入固定液24小时候，换入20％EDTA进行脱钙；20％EDTA in 9％NaOH水溶液，脱钙时间的9天内，共更换两次脱钙液。脱钙完成的组织，以流动的水冲洗8小时。接着，以浓度递增的酒精溶液脱水，再以二甲苯(xylene)和纯石蜡(pure paraffin)进行石蜡包埋，使用石蜡切片机进行切片，将颅骨以水平切面切成7μm的组织片。

1.14苏木紫-伊红染色(Hematoxylin & Eosin Stain，简称H&E Stain)

将组织片脱蜡复水后，置于苏木紫(hematoxylin)(武藤化学No.3008-1)中染5分钟，以流动的水清洗30分钟。接着，置入70％酒精3分钟后，于通风环境等待残留酒精挥发。将组织片浸泡伊红(eosin)(武藤化学No.3200-2)1分钟，以流动的水清洗15分钟后，组织片浸泡至浓度递增的酒精内进行脱水、再浸泡至二甲苯(xylene)两次。最后以封片胶封片，进行光学显微镜观察、拍照。取完整且最大面的颅骨切片，以原生骨与新生骨之间的交界，作为颅骨缺损的边界，标定出颅骨缺损面积。接着，定量缺损面积内新生骨质的百分比。

1.15碱性磷酸酶染色(Alkaline Phosphatase Stain，简称ALP Stain)

将组织片脱蜡复水后，将组织片以碱性磷酸酶套组(Alkaline Phosphatase kit)(Sigma 85L2-1KT)于37℃烘箱反应1小时，接着，浸泡ddH ₂O 2分钟。最后以封片胶封片，进行光学显微镜观察、拍照并定量。染色完成的切片可以观察到染上蓝紫色为含有碱性磷酸酶的细胞，即代表成熟骨母细胞。取完整且最大面的颅骨切片，以原生骨与新生骨之间的交界，作为颅骨缺损的边界，标定出颅骨缺损面积。接着，定量缺损面积内的蓝紫色面积百分比，作为存在的骨母细胞的区域面积比例。

1.16抗骨钙素抗体(anti-osteocalcin antibody)组织免疫染色

将组织片脱蜡后，加入初级抗体-小鼠抗骨钙素抗体(mouse anti-osteocalcin antibody)(Abcam ab13740；1:200)，于4℃下反应16～18小时。接着，与次级抗体-山羊抗小鼠IgG-共轭生物素(goat anti-mouse-IgG-conjugated biotin)(Millipore AP124B，1:250)，于室温下反应1小时。再以

ABC-conjugated HRP Kit(Vector Laboratoris PK-4000)，于室温下反应1小时。以0.01M PBS清洗5分钟，共三次；最后以DAB(5mg DAB，35％H ₂O ₂ 3.5μL in 10mL Tris-HCl，pH 7.4)进行呈色。染色完成后，将组织片于室温风干，并进行脱水。将组织片浸泡至浓度递增的酒精内进行脱水、再浸泡至二甲苯(xylene)。最后以封片胶封片，进行光学显微镜观察、拍照。

取所有颅骨切片，定量缺损面积内以深褐色标识的骨钙蛋白(Osteocalcin)的百分比，标识骨化作用的活性表现。

1.17统计分析

所有实验数据以平均SEM(Standard error of the mean)表示。各平均值间的比较以单因子变异系数分析(One-Way ANOVA)、或双因子变异系数分析(Two-Way ANOVA)，再以费雪最小显着差异性测验(Fisher’s Least Significant Difference(LSD)test)进行多重比较。实验数据皆以p<0.05作为具有显着差异的最低起始标准。

2.结果

2.1新鲜与冷冻干燥的瓦顿氏凝胶制品的组织分析

将脐带取下的新鲜冷冻的瓦顿氏凝胶制品(图1A)，与经过冷冻干燥处理后的瓦顿氏凝胶制品(图1B)石蜡包埋进行组织连续切片。经H&E染色，观察瓦顿氏凝胶制品的细胞与组织结构。结果显示，新鲜冷冻的瓦顿氏凝胶制品内存在大量的细胞核，结构也呈现致密且排列整齐(图1A1)。经过冷冻干燥处理后的瓦顿氏凝胶制品，已经观察不到任何细胞核的存在，结构从致密转变成疏松、并且出现大大小小的孔洞(图1B1)。瓦顿氏凝胶制品主要成分是胶原蛋白与醣蛋白构成。分别以天狼星红(Sirius red)与PAS染色，观察胶原蛋白与醣蛋白的分布情形。结果显示，存在于瓦顿氏凝胶的胶原蛋白与醣蛋白，不会因冷冻干燥而被破坏，仍作为支撑瓦顿氏凝胶的结构骨架(图1A2～A3，B2～B3)。将冷冻干燥瓦顿氏凝胶制品以扫描式电子显微镜观察型态(图1C)。扫描影像显示冷冻干燥瓦顿氏凝胶制品剖面呈现高密度的孔洞(图1D)。随机取多处视野，框选孔洞进行大小定量，计算出孔洞平均直径的分布。分析显示，冷冻干燥处理的瓦顿氏凝胶，不论是经石蜡包埋切片，再以HE染色定量、或经扫描式电子显微镜影像分析，均呈现大小不一的多孔洞结构；而且，孔洞直径分布大多落在10～70微米范围内(图1E)。

2.2与瓦顿氏凝胶制品进行共同培养的骨母细胞，增加细胞内骨分化基因的表现量上升

体外单独培养的大白鼠骨母细胞、或与冷冻干燥瓦顿氏凝胶制品、新鲜冷冻的瓦顿氏凝胶制品进行共同培养14天后，经trypsin处理后，取下层细胞，进行RNA的萃取。利用大白鼠Runt相关转译因子2(Runt-related transcription factor 2,简称RUNX2)，进行RT-PCR，探讨大白鼠骨母细胞骨分化的情形。结果显示，ROB组、ROB/WJD组、或ROB/WJF组有侦测到大白鼠GAPDH的表现；并且，也都有大白鼠RUNX2表现(图2A)。进一步，利用实时定量聚合酶连锁反应仪分析各组别的间基因表现量的差异。定量结果显示，ROB/WJD组、或ROB/WJF组内的骨母细胞表现rat RUNX2的含量与ROB组相比，都有显着的增加(图2B)。

2.3与瓦顿氏凝胶制品进行共同培养的大白鼠骨母细胞，其碱性磷酸酶的表现增加

大白鼠骨母细胞进行单独体外培养、或分别与冷冻干燥瓦顿氏凝胶制品、新鲜冷冻的瓦顿氏凝胶制品进行非直接、或直接的体外共同培养，以10％FBS的DMEM培养液，处理14天，再以BICP/NBT进行细胞染色，以OD595测量吸光值，观察大白鼠骨母细胞内碱性磷酸酶的表现量(图3A、图3B)。结果显示，大白鼠骨母细胞与冷冻干燥瓦顿氏凝胶制品、或新鲜冷冻的瓦顿氏凝胶制品进行非直接、或直接的共同培养下，其细胞内碱性磷酸酶的表现量均较单独培养的骨母细胞，有显着增加的情形(p<0.05，图3C)。

2.4与瓦顿氏凝胶制品进行共同培养的大白鼠骨母细胞，其钙沉积提高

大白鼠骨母细胞进行单独体外培养、或与冷冻干燥瓦顿氏凝胶制品、新鲜冷冻的瓦顿氏凝胶制品进行非直接的体外共同培养，以骨分化培养液，处理21天，再以茜素红 S(alizarin red S)进行染色，以深红色标识大白鼠骨母细胞钙沉积的表现。从低倍影像逐渐放大显示，ROB组有群聚的骨母细胞较为疏散，并且视野下仅有极少量的钙沉积现象。ROB/WJD组除了有群聚的骨母细胞外，亦能发现正以同心圆方式生长的骨母细胞，同时，周边也有大量钙沉积表现。ROB/WJF组则可以发现成熟、具有小管的骨细胞，并且，群聚的骨母细胞围绕在旁。视野下也有大量钙结晶的分布(图4A)。接着，回溶深红色标识的钙结晶，以OD 540测量吸光值，分析钙离子的浓度。结果显示，ROB/WJD组、或ROB/WJF组内钙离子的浓度相比于ROB组，有显着的升高(p<0.05，图4B)。由茜素红S(alizarin red S)染色结果推测，与冷冻干燥瓦顿氏凝胶制品、或新鲜冷冻的瓦顿氏凝胶制品非直接的共同培养下，能够促进骨母细胞的分化，加强钙沉积的表现。

2.5以微电脑断层扫描定量颅骨缺损处新生骨质，显示给予瓦顿氏凝胶制品，有效提升骨质的产量

使用微电脑断层扫描(micro-CT)观察大白鼠经颅骨缺损手术后的第一、二、三、四、五个月，观察颅骨愈合情形。Injury+Saline组的新生骨质仅沿着骨缺损周边小幅度的向内生长。Injury+WJD组、或Injury+WJF治疗组，除了有向内生长的新生骨外，也可以在缺损范围中发现有零星新生骨组织(图5A)。定量骨缺损范围内新生骨质的面积百分比。结果显示，Injury+Saline组在术后第一个月就有12.5±3.4％的骨质新生，随着术后时间增长，颅骨愈合攀升极为缓慢，于术后第五个月仅有18.4±1.4％的颅骨回复情形。而Injury+WJD、与Injury+WJF治疗组，于术后第一个月，新生骨质百分比分别为21.2±3.9％、和23.0±4.1％，相比于Injury+Saline组，有显着增加(p<0.05)，此显着增加的现象，一直维持到第五个月，骨缺损范围内的新生骨质百分比分别达到30.6±3.6％、和35.6±3.7％(p<0.05，图5B)。由微电脑断层扫描巨观观察，发现大白鼠经颅骨缺损手术，不给予任何治疗，五个月时间，颅骨愈合能力仅能维持在12％～18％范围内。给予冷冻干燥、或新鲜冷冻的瓦顿氏凝胶制品能促进颅骨缺损大白鼠的新骨生成。

2.6以H&E染色显示，给予瓦顿氏凝胶制品，促进大白鼠颅骨缺损处的骨质新生

以H&E染色结果的低倍全景图(图6A)，从低倍逐渐放大骨缺损处周边(图6B)、与骨缺损范围内(图6C)的骨质表现。结果显示，Injury+Saline组缺损周边有少量新生骨质、与致密的结缔组织；骨缺损范围内仅有结缔组织呈现。Injury+WJD、与Injury+WJF治疗组除了在骨缺损边缘处有骨质增加的趋势，骨缺损范围内还能观察到游离且趋于成熟的新生骨质。以H&E染色结果定量手术后第五个月，骨缺损范围内新生骨质的面积百分比。Injury+Saline组缺损范围内新生骨质含量仅含有18.8±1.9％。而Injury+WJD、与Injury+WJF治疗组，骨缺损范围内新生骨质含量分别达到27.1±4.0％、和32.7±5.0％，与Injury+Saline组相比，有显着增加(p<0.05，图6D)。由H&E染色微观观察，给予冷冻干燥、或新鲜冷冻的瓦顿氏凝胶制品能促进颅骨缺损大白鼠的骨质新生。

2.7以alkaline phasphatase染色标识骨母细胞(osteoblast)，显示给予瓦顿氏凝胶制品，提升大白鼠颅骨缺损处骨母细胞的活性表现

以ALP染色结果的低倍全景图(图7A)，从低倍逐渐放大骨缺损周边(图7B)、与骨缺损范围内(图7C)的成熟骨母细胞表现区域。结果显示，Injury+Saline组骨缺损周边与范围内，有少量成熟骨母细胞表现ALP。Injury+WJD、与Injury+WJF治疗组皆有成熟骨母细胞贴附骨缺损周边向内生长的新生骨质，同时，也能在骨缺损范围内，观察游离新生骨质皆被骨母细胞包围着。以ALP染色结果定量缺损范围内ALP ⁺的面积百分比。Injury+Saline组ALP ⁺面积仅约为3.7±2.1％。Injury+WJD、与Injury+WJF治疗组，ALP ⁺面积分别达到10.0±5.9％、和8.8±2.3％，与Injury+Saline组相比，有增加的趋势(p<0.05，图7D)。以ALP染色微观观察，给予冷冻干燥、或新鲜冷冻的瓦顿氏凝胶制品能增加颅骨缺损大白鼠骨母细胞的活性。

2.8以抗骨钙蛋白(anti-osteocalcin)抗体免疫组织染色标识新生的骨质，显示给予瓦顿氏凝胶制品，促进大白鼠颅骨缺损处骨质新生的表现

骨钙蛋白(Osteocalcin)是在骨生成过程中，由骨母细胞分泌并释放于骨组织中，形成未钙化的骨质。以抗骨钙蛋白(anti-osteocalcin)免疫组织染色结果的低倍全景图(图8A)，从低倍逐渐放大骨缺损周边(图8B)、与骨缺损范围内(图8C)含有osteocalcin的未钙化骨质区域的表现量。结果显示，Injury+Saline组于骨缺损周边没有观察到osteocalcin的表现；骨缺损范围内，仅有少量osteocalcin被释放到组织中。Injury+WJD、与Injury+WJF单独治疗组不仅在骨缺损周边、或骨缺损范围内均有发现osteocalcin存在，也可以观察到成群的骨母细胞，代表骨母细胞正进行骨生成反应。以OCN染色结果定量骨缺损范围内OCN ⁺的面积百分比。Injury+Saline组OCN ⁺面积仅有2.4±1.6％。而Injury+WJD、与Injury+WJF单独治疗组，OCN ⁺面积百分比分别达到14.8±4.8％、和15.5±1.5％，与Injury+Saline组相比，有显着增加(p<0.05，图8D)。以抗骨钙蛋白(anti-osteocalcin)组织免疫染色微观观察，给予冷冻干燥、新鲜冷冻的瓦顿氏凝胶制品治疗组，进一步促进骨母细胞的表现osteocalcin，以促进硬骨的新生。

2.9给予瓦顿氏凝胶制品，可明显促进新生骨质的发育

分别以抗骨钙蛋白(anti-osteocalcin)免疫组织染色标识未成熟(immature)骨母细胞、以ALP组织染色标识成熟(mature)骨母细胞、再以H&E染色标识成熟骨质。将三种染色的定量数据加总，评估颅骨缺损大白鼠的骨质发育。结果显示，Injury+Saline组的骨质发育约25％。Injury+WJD、与Injury+WJF治疗组的骨质发育分别约52％、与57％，具有较高的骨质发育(图9)。

3.结论

将瓦顿氏凝胶制品移植到颅骨缺损的大白鼠。结果发现，不论是新鲜冷冻的、或冷冻干燥的瓦顿氏凝胶制品处理后，由微电脑断层扫描观察到骨质新生的情形，且经过切片染色也证明影像呈现的信号为成熟的骨质，也促进宿主骨质的发育。根据以上实验结果显示，瓦顿氏凝胶制品可做为临床医学上促进骨质新生的天然医材，让仍为骨缺损受苦的患者，提供新型的治疗方法。

据信，本发明所属技术领域的技术人员可以基于本文中的描述而将本发明利用到最宽的范围，并不需要进一步的说明。因此，所提供的描述和申请专利范围应被理解为用于演示的目的，而不是要以任何方式限制本发明的范围。

Claims

一种脐带瓦顿氏凝胶制品，具有促进骨质新生的功效，其中该制品是由以下两种方法制得：(1)取脐带的瓦顿氏凝胶，以抗冻剂处理后冷冻保存，使用前解冻；或(2)取脐带的瓦顿氏凝胶，直接冷冻干燥，使用前保存于干燥条件中。
如权利要求1其中该脐带来自人类或非人类哺乳动物。
如权利要求1的制品，其中抗冻剂为10％二甲基亚砜(DMSO)溶液。
如权利要求1的制品，其中冷冻保存是于液态氮中保存。
如权利要求1、2、3或4的制品，其中该冷冻保存的瓦顿氏凝胶含有细胞体。
如权利要求1制品，其中冷冻干燥步骤包括取下小块状的新鲜瓦顿氏凝胶，直接存放-80℃下冷冻保存，再使用冷冻干燥机，抽干组织间的水分。
如权利要求6的制品，其中该瓦顿氏凝胶不含有细胞体。
如权利要求1的制品，其能使骨母细胞内碱性磷酸酶的表现增加、增加骨母细胞内骨分化基因的表现量、促进骨母细胞分化、加强钙沉积的表现，能有效提升骨质的产量、能使骨缺损处的骨质新生、提升骨缺损处骨母细胞的活性表现、或促使新生骨质的发育。
一种如权利要求1的制品用于制备促进骨质新生药剂的用途。
如权利要求9的用途，其中该制品能使骨母细胞内碱性磷酸酶的表现增加、增加骨母细胞内骨分化基因的表现量、促进骨母细胞分化、加强钙沉积的表现，能有效提升骨质的产量、能使骨缺损处的骨质新生、提升骨缺损处骨母细胞的活性表现、或促使新生骨质的发育。