CN104145943A

CN104145943A - 一种人脐带华通氏胶组织的冻存保护液及其制备与应用

Info

Publication number: CN104145943A
Application number: CN201410344918.8A
Authority: CN
Inventors: 陈林; 董伟; 张坤
Original assignee: CHONGQING HONGHUI CORD BLOOD STEM CELL CENTRE Co Ltd
Current assignee: CHONGQING HONGHUI CORD BLOOD STEM CELL CENTRE Co Ltd
Priority date: 2014-07-21
Filing date: 2014-07-21
Publication date: 2014-11-19
Anticipated expiration: 2034-07-21
Also published as: CN104145943B

Abstract

本发明涉及一种人脐带华通氏胶组织的冻存保护液，包括：渗透性冷冻保护剂5~10%、非渗透性冷冻保护剂1~5%、血清替代品10~20%和无血清基础培养基70~80%。本发明还公开了该冻存保护液的制备方法，具体为：1）将无血清基础培养基、非渗透性冷冻保护剂和血清替代品预冷，混合、摇匀；2）加入渗透性冷冻保护剂；3）在2~6℃温度条件下冷藏30min以上即可。本发明还公开了采用上述冻存保护液对人脐带华通氏胶组织的冻存方法，包括如下步骤：1）脐带预处理；2）剥取华通氏胶组织；3）人脐带华通氏胶组织冻存。本发明的冻存保护液和冻存方法处理人脐带华通氏胶组织，具有减少脐带间充质干细胞在冻存过程中的损伤，保证脐带间充质干细胞的活性和临床使用安全性的优点。

Description

一种人脐带华通氏胶组织的冻存保护液及其制备与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人脐带华通氏胶组织的冻存保护液及其制备与应用。

背景技术

脐带间充质干细胞是来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有自我更新、造血支持、免疫调控和多向分化潜能，目前临床上可用于糖尿病终末期并发症，红斑狼疮，组织器官损伤修复及造血干细胞辅助治疗等诸多方面。

目前，临床应用的干细胞种类繁多，与它们相比，脐带间充质干细胞具有免疫原性低，移植不会出现免疫排斥等副作用，采集过程简单的优点，同时脐带间充质干细胞还具有很强的增殖和分化能力，极少出现病毒和微生物感染，对产妇和新生儿无损害，因此，脐带间充质干细胞是目前理想的干细胞来源。

华通氏胶是构成脐带的凝胶状物质，其含有黏多糖、成纤维细胞和巨噬细胞，是一种粘膜组织，胶内部分细胞具有干细胞的特质，因此可以从脐带的华通氏胶中分离出脐带间充质干细胞，是目前比较理想的干细胞来源。随之而来的对脐带华通氏胶组织进行冻存成为了现今的研究热点，现有技术中主要采用传统的细胞冷冻方法对人脐带华通氏胶组织进行冻存。如申请号为201210159916.2名称为《脐带组织冻存、复苏以及分离和扩增干细胞的方法》公开了脐带组织的冻存方法，主要步骤是对脐带组织进行消毒和清洗，将组织剪成块状；然后将组织块和冻存液加入冻存管中，在4℃的温度条件下低温冷藏0.5h，再在-80℃的温度条件下冷冻1天，然后再液氮中冷冻备用即可，虽然其达到了冻存人脐带组织的目的，但是这样的临床冻存方法需要花费较多的时间和成本，而还存在有如下缺点： 1、降温过程中，冷冻保护液在固液相变点处释放的热量无法及时抵消，导致脐带组织温度反而上升，影响冷冻效果；2、无法准确知道冷冻过程中样品温度变化情况，不利于质量控制；3、所用培养基中含有动物血清成分，异种血清的使用存在着很多不确定因素，比如，血清批次之间的差别，异种蛋白的免疫原性，潜在的病原体等，可能对将来临床应用构成威胁。

发明内容

针对现有技术存在的上述技术问题，本发明的目的是提供一种对细胞损伤小，毒副作用低，冻存效果好的人脐带冻存保护液，并提供一种易于制备，保存简单的人脐带冻存保护液的制备方法。

本发明的另一目的是提供一种采用上述人脐带冻存保护液的应用，也就是采用上述人脐带冻存保护液对人脐带华通氏胶组织进行冻存方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种人脐带华通氏胶组织的冻存保存液，包括如下体积百分比的组分：

渗透性冷冻保护剂5~10%、非渗透性冷冻保护剂1~5%、血清替代品10~20%和无血清基础培养基70~80%。

本方案中，渗透性冷冻保护剂是可以透过细胞膜渗透到细胞内的小分子物质，用于人脐带华通氏胶的冻存时，在人脐带华通氏胶冷冻悬液完全凝固之前，可以渗透到细胞内，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，使人脐带华通氏胶组织不会被高浓度电解质损伤，组织内水分不会过分外渗，避免组织过分脱水而伤害细胞。非渗透性冷冻保护剂一般是些大分子物质，不能渗透到细胞内，通过优先同溶液中的水分子相结合，降低溶液中自由水的含量，使冰点降低，减少冰晶的形成；同时，由于其分子量大，使溶液中电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤。血清替代品为人工合成，组分明确，安全，批次间差异小，能够替代血清提供细胞生长所需的营养、激素和生长因子，同时在冻存过程中对细胞提供一定程度的保护。无血清基础培养基是指用人工方法配制而成的，未添加血清，含各种氨基酸和葡萄糖等细胞生长基本营养物质的营养液。

本方案中，渗透性冷冻保护剂通过与非渗透性冷冻保护剂、血清替代品和无血清基础培养基协同增效作用，在冻存过程中对细胞损伤小，毒副作用低，其冻存效果好。

作为优化，所述人脐带华通氏胶组织的冻存保护液包括如下体积百分比的组分：渗透性冷冻保护剂10%、非渗透性冷冻保护剂5%、血清替代品10%和无血清基础培养基75%。

本方案中，采用渗透性冷冻保护剂10%、非渗透性冷冻保护剂5%、血清替代品10%和无血清基础培养基75%制备人脐带华通氏胶组织的冻存保护剂，在保证冻存保护液性能最好的同时，避免了异种血清的使用（例如常用的胎牛血清），消除了将来临床使用障碍，同时与其他的无血清配方冻存保护液相比（如201210159916.2《脐带组织冻存、复苏以及分离和扩增干细胞的方法》），使用大量无血清基础培养基替代人血白蛋白，有效节约了成本。

作为优化，所述渗透性冷冻保护剂为二甲基亚枫或者甘油。

本方案中，采用二甲基亚枫或者甘油作为渗透性冷冻保护剂。二甲基亚枫和甘油作为生物细胞冷冻保护剂，其具有价格低廉、来源广泛、冷冻效果好的优点。作为对本方案的进一步优化，所述渗透性保护剂为二甲基亚砜，其分子量为2万，其具有较好的溶解性，易于与其他组分互溶从而形成均一稳定的体系，同时具有良好的渗透性，极易渗透入组织内部，从而达到保护组织的目的。

作为优化，所述非渗透性冷冻保护剂为羟乙基淀粉或者人血白蛋白。

本方案中，采用人血白蛋白作为非渗透性冷冻保护剂，主要因为：一方面，二甲基亚砜可以引起轻微的蛋白质变性、破坏，融冻后出现小凝块；另一方面，人脐带华通氏胶组织的冻存保护剂配制后会2~6℃预冷使用，毒性有所降低但不能避免；所以本方案以人血白蛋白作为非渗透性保护剂，与其他组份配合使用，在冷冻过程中可以保护蛋白质，使其不发生变形、破坏，同时降低冻存保护液中二甲基亚砜的毒性。

作为优化，所述血清替代品为FetalClone III或者Ultroser G。

作为优化，所述无血清基础培养基为DMEM/F12或者RPMI1640。

作为优化，所述人脐带华通氏胶组织的冻存保护液包括如下体积百分比的组分：二甲基亚砜10%，人血白蛋白5%，FetalClone III 10%和DMEM/F12 75%。

本方案中，人脐带华通氏胶组织的冻存保护液的组分为：二甲基亚砜10%，人血白蛋白5%，FetalClone III 10%和DMEM/F12 75%，这样配制的冻存保护液在保证各组分完全发挥功能，冻存效果佳的基础上，减少了蛋白和血清类制品的用量，大量使用了相对便宜的DMEM/F12培养基，有效降低了成本。

本发明还提供一种上述人脐带华通氏胶组织的冻存保护液的制备方法，包括如下制备步骤：

1）将无血清基础培养基、非渗透性冷冻保护剂和血清替代品置于2-6℃下预冷，然后将其混合、摇匀；

2）向步骤1）得到的混合物中加入渗透性冷冻保护剂，并摇匀；

3）将步骤2）得到的混合物在2-6℃下预冷30min以上，即得人脐带华通氏胶组织的冻存保护液。

本方案中，首先将无血清基础培养基、非渗透性冷冻保护剂和血清替代品混合并摇匀，然后再加入渗透性冷冻保护剂，这样可以使各种组分充分混匀，并形成均一稳定的体系，有利于避免人脐带华通氏胶组织损伤。

本发明还提供一种人脐带华通氏胶组织的冻存方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）脐带预处理：在二级生物安全柜中，用医用酒精对脐带组织表面消毒，然后剪去脐带结扎两端，再用无菌PBS洗脐带3~5次去除脐带表面和血管内的血液及凝块；

2）剥取华通氏胶组织：将步骤1）处理后的脐带剪为1~3cm长的小段，再用无菌PBS溶液洗去残余血液与凝块，再剥离脐动脉组织和脐静脉组织；然后剥取华通氏胶组织，在将得到的华通氏胶组织剪为1~2mm²的小块；

3）取上述人脐带华通氏胶组织冻存保护液，备用；将步骤2）得到的华通氏胶组织重悬于所述人脐带华通氏胶组织冻存保护液中，再将其置于2~6℃下预冷20~30min，然后进行程序降温处理即可；

所述程序降温处理的具体操作为：首先，置于4℃下冷藏10min；然后以1~1.5℃/min的速率降温至-40℃，立即以10℃/min的速率降温至-90℃，迅速转移至液氮-190℃深低温环境长期储藏。

本方案中，将剥取的华通氏胶组织进行预冷处理后，再进行程序降温处理，这样可以减少人脐带华通氏胶组织冻存过程中间充质干细胞的损伤，保证了间充质干细胞的活性和临床使用的安全性。

本方案中，所述重悬就是重新悬浮，也就是采用无菌PBS溶液将人脐带华通氏胶组织重新悬浮。

作为优化，步骤3）中人脐带华通氏胶组织的冻存保护液的体积和人脐带华通氏胶组织的质量的比例为2ml:1g.。

本方案中，人脐带华通氏胶组织的冻存保护液的体积和人脐带华通氏胶组织的质量的比例为2ml:1g，这样的配比在充分保证冷冻效果的基础上，尽可能降低了冻存保护液的用量，节约成本。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、所述人脐带华通氏胶组织的保护液中各组分的体积分数为：二甲基亚砜10 %，人血白蛋白5 %，FetalClone III 10 %和DMEM/F12 75 %，通过各个组分之间的协同增效作用，使得到的冻存保护液在冻存过程中对人脐带华通氏胶组织的损伤小，毒副作用低，冻存效果好。

2、本发明的冻存方法中，在步骤3）人脐带华通氏胶组织的冻存过程中，首先在2~6℃下预冷20~30min，低温可以降低渗透性保护剂（例如二甲基亚砜）对组织细胞的毒性，同时足够的预冷时间可以让保护剂和组织充分反应达到最佳冷冻效果；然后再进行程序降温处理，在这个过程中，在4℃保持10分钟，可以让程序降温仪器内部空间和组织温度达到一致，如果有多份组织同时冷冻时，本步骤可让所有组织的温度达到一致，保证所有组织的冷冻效果都最佳；以1~1.5℃/min的速率降至-40℃min，细胞冷冻中降温速度不宜过快也不能过慢，过快会造成冰晶损伤，过慢会加重溶质损伤，1~1.5℃的降温速率是细胞冷冻的最佳速率，该速率能保证组织解冻后其内部细胞存活率最高；然后以10℃/min的速率降温至-90℃并冷藏min，在-40℃之后，组织冷冻保护剂已经度过了固液相变点，高速降温一方面可以加速抑制细胞新陈代谢，同时节约了冷冻时间；最后迅速转移至液氮-190℃环境长期储藏，-190℃相比于-80℃能够更长时间的保存组织，保持其活性和功能；而且-190℃温度下存储能维持组织活性和功能不明显降低达5-10年甚至更久，而-80摄氏度技能维持1年左右，之后组织活性和功能就会迅速下降。

2、通过四个阶段的程序降温处理，可以减少脐带间充质干细胞在冻存过程中的损伤，保证了脐带间充质干细胞的活性，同时冷冻过程由1天缩短到不足1小时，节约了时间成本。

3、本发明在制备人脐带华通氏胶组织的冻存保护液的过程中，首先将2～6℃预冷处理后的人血白蛋白、FetalClone III和DMEM/F12进行混合、摇匀；然后将二甲基亚砜缓慢加入混合液。这是由于二甲基亚砜的凝固点低(18.4℃)，不能预冷且稀释放热，本发明中最后加入二甲基亚砜后，其浓度被迅速稀释，不会发生凝固现象，保证了冻存保护液中各组分间的充分混合和协同增效作用的发生；同时预冷的人血白蛋白、血清替代品和无血清基础培养基能中和二甲基亚砜被稀释后释放的热量，从而保证了冻存保护液内部组分不会因为温度过高而发生变化如蛋白质变性等，降低冷冻效果。

附图说明

图1是MTT法检测脐带间充质干细胞的细胞周期图。

图2是流式细胞术鉴定脐带间充质干细胞表面标志图。

图3是成骨诱导图。

图4是成脂诱导图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的详细介绍。

需要说明的是，本发明中所用的试剂均为现有技术，可以为市售产品。

一、具体实施方式

1、人脐带华通氏胶

一种人脐带华通氏胶组织的冻存保存液，其组分以及各组分的体积分数为：渗透性冷冻保护剂5~10%、非渗透性冷冻保护剂1~5%、血清替代品10~20%和无血清基础培养基70~80%。

具体实施时，各组分以及各组分的体积分数可以为：渗透性冷冻保护剂10%、非渗透性冷冻保护剂5%、血清替代品10%和无血清基础培养基75%。

更具体的说，人脐带华通氏胶组织的组分以及各组分的体积分数可以为：二甲基亚砜10%，人血白蛋白5%，FetalClone III 10%和DMEM/F12 75%。也可以为：二甲基亚砜5%，人血白蛋白1%，FetalClone III 14%和DMEM/F12 80%；也可以为：二甲基亚砜6%，人血白蛋白4%，FetalClone III 20%和DMEM/F12 70%。其中当二甲基亚砜10%，人血白蛋白5%，FetalClone III 10%和DMEM/F12 75%时，得到的冻存保护液的性能最好。因此，以下制备人脐带华通氏胶组织的冻存保护液以及冻存人脐带华通氏胶组织均采用此配方。

2、人脐带华通氏胶组织的冻存保护液的制备：

上述人脐带华通氏胶组织的冻存保护液的制备方法，包括如下步骤：

1）将无血清基础培养基、非渗透性冷冻保护剂和血清替代品置于2~6℃下预冷，然后将其混合、摇匀；

3）将步骤2）得到的混合物在2~6℃下预冷30min以上即得人脐带华通氏胶组织的冻存保护液。

3、人脐带华通氏胶组织的冻存方法

一种人脐带华通氏胶组织的冻存方法，包括如下步骤：

1）脐带预处理：在二级生物安全柜中，用医用酒精对脐带组织表面消毒，然后剪去脐带结扎两端，并用无菌PBS清洗4次，以去除脐带表面和血管内的血液及凝块；其中脐带预处理是在常温下进行，二级生物安全柜中的无菌等级符合GMP A级。

　　　2）剥取华通氏胶组织：将步骤1）处理后的脐带剪为2cm长的小段，再用无菌PBS溶液洗去残余血液与凝块，再剥离脐动脉组织和脐静脉组织；然后剥取华通氏胶组织，在将得到的华通氏胶组织剪为2mm²的小块；

　　　3）人脐带华通氏胶组织冻存：取上述人脐带华通氏胶组织冻存保护液2ml，备用；然后将步骤2）得到的华通氏胶组织重悬于所述人脐带华通氏胶组织冻存保护液中，再将其置于2~6℃下预冷20~30min，然后进行程序降温处理即可；

　　　其中，程序降温处理的具体操作为：首先，置于4℃下冷藏10min；然后以1~1.5℃/min的速率降温至-40℃，再以10℃/min的速率降温至-90℃，最后迅速转移至液氮-190℃环境储藏即可。

4、人脐带华通氏胶组织的复苏及培养

将采用本发明的冻存保护液和冻存保护方法处理的人脐带华通氏胶组织冻存3个月后，然后将人脐带华通氏胶组织放入37℃恒温水浴中解冻，离心弃上清，保留华通氏胶组织沉淀，用培养基重悬均匀，接入底面积为75cm²的细胞培养瓶中，平铺均匀。置于37℃、5%二氧化碳浓度、饱和湿度的培养箱中，每3天更换培养基，至细胞融合60~80%时，倾出培养基，向细胞培养瓶中分别加入无菌PBS洗涤2-3次，加入0.25%的胰蛋白酶-EDTA消化液，静置消化2min，加入培养基终止消化反应，将所得悬液过滤去除组织块，转入50ml离心管，离心弃去上清，沉淀即为原代脐带间充质干细胞。

将所得的原代脐带间充质干细胞按6000-10000cells/cm²接入底面积为75cm²的细胞培养瓶中，置于37℃、5%二氧化碳浓度、饱和湿度的培养箱中，每3天更换培养基，至细胞融合70~80%时，倾出培养基，向细胞培养瓶中分别加入无菌PBS洗涤2~3次，加入0.25%的胰蛋白酶-EDTA消化液，静置消化2min，加入培养基终止消化反应，将此时所得悬液转入50ml离心管，离心弃去上清，沉淀即为P1代脐带间充质干细胞。

二、性能检测：

2.1 脐带间充质干细胞的检测

2.1.1 MTT法检测脐带间充质干细胞的细胞周期

将新鲜组织培养得到P1代脐带间充质干细胞，以及本发明方法冻存后复苏的组织块复苏培养得到的P1代脐带间充质干细胞，分别配制成浓度为5*10⁴cells/ml的细胞悬液；取7块96孔板，每孔接种100μl新鲜细胞制备的细胞悬液，并加入200μl培养基填充，每3天对96孔板内培养基进行换液；再取7块96孔板同上操作，但将细胞悬液中的细胞换成复苏组织培养出的细胞；

将96孔板置于37℃、5%二氧化碳浓度、饱和湿度的培养箱内培养；培养开始后每24h各取出一块96孔板，每孔加入20μl浓度为5mg/ml的MTT继续培养，4小时后小心移去培养上清，每孔加入100μl二甲基亚砜（DMSO），微量震荡5分钟，置酶标仪490nm处测量各孔的吸光值；统计吸光值绘制生长曲线，如图1所示：其中曲线1为新鲜组织培养得到的P1代脐带间充质干细胞的生长曲线，曲线2为本发明的的冻存保护液和冻存方法冻存后复苏的组织块培养得到的P1代脐带间充质干细胞的生长曲线，从图中可以看出细胞接种1-2天为缓慢生长的潜伏期，从第3天即进入对数生长期，两种细胞都从第5天进入平台期，细胞倍增时间为30小时，p＜0.05，用本发明冻存方法处理的人脐带华通氏胶组织复苏后的组织块培养的细胞在增殖能力，活性方面与未经过冻存的新鲜组织细胞无显著差异，但冻存组织块比冻存细胞储存成本更低，适合于细胞库使用。

2.1.2 流式细胞术鉴定脐带间充质干细胞表面标志

取本发明冻存方法处理的人脐带华通氏胶组织复苏后，用组织块培养的P1代脐带间充质干细胞并制成单细胞悬液，细胞浓度为2*10⁶cells/ml；取100uL细胞悬液，分别加入抗体10uL于20℃避光孵育20分钟；抗体分别为小鼠抗人CD14-FITC、CD34-PE、CD45-FITC、CD79a-PE、HLA-DR-FITC、CD73-FITC、CD90-FITC和CD105-PE；孵育结束后，洗涤细胞2遍，加入300uL流式鞘液中，用流式细胞仪检测；检测结果如图2所示，图中a、b、c、d、e、f、g和h分别表示抗体依次为小鼠抗人CD14-FITC、CD34-PE、CD45-FITC、CD79a-PE、HLA-DR-FITC、CD73-FITC、CD90-FITC和CD105-PE时，本发明方法处理的人脐带华通氏胶组织复苏后培养得到的P1代脐带间充质干细胞的特征，图中横坐标为荧光强度，纵坐标表示细胞数量；由图2中可以看出，采用本发明冻存方法处理的人脐带华通氏胶组织复苏后的组织块培养的细胞高表达黏附分子和基质细胞标记CD73、CD90、CD105，不表达造血细胞标记CD14、CD34、CD45、CD79a，不表达主要组织相容性复合物类分子HLA-DR，符合间充质干细胞特征，且纯度＞95%。

2.2 脐带间充质干细胞分化潜能的测定

2.2.1 成骨诱导

取本发明的冻存保护液以及冻存保护方法处理人脐带华通氏胶组织，将人脐带华通氏胶组织冻存处理3个月后，将其复苏并用复苏后的组织块培养P1代脐带间充质干细胞，按5*10³/cm2接种12孔板，置于37℃、5%二氧化碳浓度、饱和湿度的培养箱中培养24h后，将培养基更换为成骨细胞诱导液（GIBCO, CAT NO:A10072-01）,每3~4天更换一次诱导液，诱导14天，碱性磷酸酶染色鉴定成骨细胞形成。如图3所示，由图中可以看出： P1代脐带间充质干细胞经诱导液诱导14天后，细胞形态发生明显改变，由梭型逐渐变为多角形，细胞质中出现结节，碱性磷酸酶染色后90%脐带间充质干细胞呈阳性反应，由此表明脐带间充质干细胞具备诱导分化为成骨细胞的能力。

2.2.2 成脂诱导

取本发明的冻存保护液以及冻存保护方法处理人脐带华通氏胶组织，将人脐带华通氏胶组织冻存处理3个月后进行复苏处理，并将复苏后的组织块培养的P1代脐带间充质干细胞，按1*10⁴/cm²接种12孔板，置于37℃、5%二氧化碳浓度、饱和湿度的培养箱中培养24h后，将培养基更换为成脂细胞诱导液（GIBCO, CAT NO:A10070-01）,每3~4天更换一次诱导液，诱导14天，油红O染色鉴定脂滴形成，如图4所示，由图中可以看出：P1代脐带间充质干细胞经诱导液诱导14天后，细胞形态发生明显改变，由成纤维细胞样收缩变短，有脂滴出现，油红O染色后脂滴被染成红色，表明脐带间充质干细胞具备诱导分化为成脂细胞的能力。

Claims

1.一种人脐带华通氏胶组织的冻存保存液，其特征在于，包括如下体积百分比的组分：渗透性冷冻保护剂5~10%、非渗透性冷冻保护剂1~5%、血清替代品10~20%和无血清基础培养基70~80%。

2.根据权利要求1所述的人脐带华通氏胶组织的冷冻保存液，其特征在于，包括如下体积百分比的组分：渗透性冷冻保护剂10%、非渗透性冷冻保护剂5%、血清替代品10%和无血清基础培养基75%。

3.根据权利要求1或者2所述的人脐带华通氏胶组织的冷冻保存液，其特征在于，所述渗透性冷冻保护剂为二甲基亚砜或者甘油。

4.根据权利要求3所述的人脐带华通氏胶组织的冷冻保存液，其特征在于，所述非渗透性冷冻保护剂为羟乙基淀粉或者人血白蛋白。

5.根据权利要求4所述的人脐带华通氏胶组织的冷冻保存液，其特征在于，所述血清替代品为FetalClone III或者Ultroser G。

6.根据权利要求5所述的人脐带华通氏胶组织的冷冻保存液，其特征在于，所述无血清基础培养基为DMEM/F12或者RPMI1640。

7.根据权利要求6所述的人脐带华通氏胶组织的冻存保护液，其特征在于，包括如下体积百分比的组分：二甲基亚砜10%，人血白蛋白5%，FetalClone III 10%和DMEM/F12 75%。

8.一种权利要求1~7任一项所述的人脐带华通氏胶组织的冻存保护液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

　　　2）向步骤1）得到的混合物中加入渗透性冷冻保护剂，摇匀；

　　　3）将步骤2）所得混合物置于2~6℃温度条件下冷藏30min以上，即得人脐带华通氏胶组织冻存保护液。

9.一种人脐带华通氏胶组织的冻存方法，其特征在于，包括如下步骤：

　　　1）脐带预处理：在二级生物安全柜中，用医用酒精对脐带组织表面消毒，然后剪去脐带结扎两端，并用无菌PBS清洗3~5次，以去除脐带表面和血管内的血液及凝块；

　　　3）人脐带华通氏胶组织冻存：取权利要求1~7任一项所述人脐带华通氏胶组织冻存保护液，备用；然后将步骤2）得到的华通氏胶组织重悬于所述人脐带华通氏胶组织冻存保护液中，再将其置于2~6℃下预冷20~30min，然后进行程序降温处理即可；

　　　所述程序降温处理的具体操作为：首先，置于4℃下冷藏10min；然后以1~1.5℃/min的速率降温至-40℃，再以10℃/min的速率降温至-90℃，最后迅速转移至液氮-190℃环境储藏即可。

10.根据权利要求9所述的人脐带华通氏胶组织的冻存方法，其特征在于，步骤3）中人脐带华通氏胶组织的冻存保护液的体积和人脐带华通氏胶组织的质量的比例为2ml:1g.。