CN111602652A - 一种脐带间充质干细胞冻存保护液 - Google Patents

一种脐带间充质干细胞冻存保护液 Download PDF

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Abstract

本发明涉及哺乳动物细胞工程技术领域，具体的讲是一种脐带间充质干细胞冻存保护液，包括7.5vol％～12.5vol％的甘油、5vol％～7.5vol％的透明质酸、5vol％～7.5vol％的人血白蛋白，余量的MEM培养基，本发明与现有技术相比，甘油和透明质酸相互配合使用，使冻存保护液的液态体系保持稳定，防止脐带间充质干细胞在冻存过程中沉淀至容器底部堆积成团，并在保存过程中受到保护，减少其损伤，从而提高脐带间充质干细胞的保存存活率，另外，透明质酸提高细胞的通透性，降低细胞沉降速度，避免细胞损伤；其次，人血白蛋白可维持溶液胶体渗透压，还可维持细胞营养，防止细胞聚集成团。

Description

一种脐带间充质干细胞冻存保护液
技术领域
本发明涉及哺乳动物细胞工程技术领域，具体的讲是一种脐带间充质干细胞冻存保护液。
背景技术
脐带间充质干细胞(MSCs)是指存新生儿脐带组织中分离获得的一种多功能干细胞，它可以分化成许多种功能细胞，具有易于获取、高度自我更新、多项分化潜能、弱免疫原性和不易衰老等特点。人体脐带间充质干细胞是目前广泛应用于组织工程及再生医学领域的一种成体干细胞，与骨髓间充质干细胞一样具有多向分化潜能。
脐带间充质干细胞呈成纤维细胞样生长，胞浆和核仁丰富，呈平行或漩涡样排列。
在人脐带间充质干细胞连续培养过程中细胞会逐渐发生衰老和功能丧失，同时存在发生自发分化、交叉污染和污染的风险。为保证实验生产的连续性、稳定性和安全性，应合理有效备份足够量的多级细胞库。细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而冻存保护液的选择尤为关键。
目前，常用的冻存保护液主要含有二甲基亚砜(DMSO)、胎牛血清(FBS)和基础培养基。
DMSO是细胞保存中最常用的冷冻剂，但它存在对细胞也存在一定的毒性，引起细胞分化，常温下能使胞内蛋白变性等问题，从而降低了人脐带间充质干细胞存活率和生物活性，影响细胞复苏率和复苏后增殖能力。
FBS是冻存保护液中主要组分之一，主要作用是为细胞提供充足的营养成分及保护因子，从而保证复苏后细胞活性和增殖能力。然而FBS存在感染病毒病菌等病原体的风险，并且脐带间充质干细胞在接触FBS时会内吞血清物质，当使用FBS保存的间充质干细胞回输人体后，其中的一些动物源性蛋白质可能会引起的免疫排斥反应，严重的可能引起过敏性休克。除此之外，血清存在批次之间差异和不稳定性等问题。
因此，现有的脐带间充质干细胞的冻存保护液存在长时间保存复苏率差、增殖能力下降和安全性差的缺陷。
发明内容
本发明突破了现有技术的难题，设计了一种脐带间充质干细胞的冻存保护液，该冻存保护液可使细胞长时间保存后依然具有较好的复苏率，且细胞具有较好的增殖能力。
本发明为了达到上述目的，本发明设计了一种脐带间充质干细胞冻存保护液，其特征在于：该冻存保护液包括甘油、人血白蛋白、透明质酸和MEM培养基。
进一步，所述冻存保护液包括7.5vol％～12.5vol％的甘油、5vol％～7.5vol％的透明质酸、5vol％～7.5vol％的人血白蛋白。
进一步，所述甘油的含量为6.5vol％～8.8vol％。
进一步，透明质酸为D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的双糖单位玻尿酸。
本发明还设计了一种脐带间充质干细胞的冻存方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1脐带预处理；
S2传代培养：加入MEM培养基，进行传代培养；
S3收集细胞：吸除培养皿中的组织块或培养基，进行润洗，收集细胞悬液，用MEM培养基重悬细胞，调整细胞密度后接种细胞进行培养，最后收集细胞；
S4冻存细胞：使用上述脐带间充质干细胞冻存保护液对细胞进行冻存。
进一步，S1脐带预处理的具体方法为：在生物安全柜中，将新鲜脐带放置于培养皿中，进行冲洗，后润洗，之后将洗净的脐带剪成小段，将脐带小段外层的羊膜剥净，撕开华通氏胶，剔除动脉和经脉，将血迹清洗干净，将洗净的脐带小段剪成组织块，并将组织块均匀散布在培养皿中。
进一步，S2传代培养的具体方法为：在放置有脐带组织块的培养皿中加入含有血清的MEM培养基，之后放入温度为37℃、CO2体积分数为5％的培养箱中进行培养，24小时后加液，3天换液1次，培养7天左右有MSCs爬出，14天左右细胞达80％融合度，进行传代培养。
进一步，S3收集细胞的具体方法为：吸除培养皿中的组织块或培养基，进行润洗，弃上清，加入TrypLE消化，再用与TrypLE等量的相对应培养基终止，收集细胞悬液，用滤网过滤至离心瓶中，离心去上清，加入生理盐水，计数，离心去上清，用MEM培养基重悬细胞，并调整细胞密度为1×105cells/ml，按照4×105cells/皿接种于细胞瓶中，于37℃、体积分数5％CO2培养箱中培养，细胞达80％融合度，进行收集。
本发明与现有技术相比，减少了细胞的损伤，提高其保存存活率，从而保证复苏后细胞活性和繁殖能力。
附图说明
图1为本发明具体实施例中实施例1～3与对照组1～3复苏后的脐带间充质干细胞的生长天数曲线图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步描述，但不作为对本发明的限定。
需要说明的是，本发明中所用的试剂均为现有技术，可以为市售产品。
针对现有技术采用二甲基亚砜和FBS作为脐带间充质干细胞的冻存保护液，使细胞复苏率下降与增殖能力下降的问题。本发明设计了一种脐带间充质干细胞的冻存保护液，包括：甘油、人血白蛋白、透明质酸和MEM培养基，具有长时间保存后依然具有较高的复苏率，细胞增殖能力。
优选的，冻存保护液包括7.5vol％～12.5vol％的甘油、5vol％～7.5vol％的透明质酸、5vol％～7.5vol％的人血白蛋白，余量为MEM培养基。
优选的，甘油的含量为6.5vol％～8.8vol％，本发明中甘油是脂肪醇的一种，具有脂肪醇的化学活性，同时又是多元醇，是简单的三元醇，因此，甘油的化学性质除了脂肪醇的通性外，还有多元醇的性质。
优选的，透明质酸为D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的双糖单位玻尿酸，又称糖醛酸，基本结构是由两个双糖单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的大型多糖类。与其它多糖不同，它不含硫。它的透明质分子能携带500倍以上的水分，为当今所公认的最佳保湿成分，透明质酸提高细胞的通透性，降低细胞沉降速度，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持细胞的活性和生物特征。自然界中的蔗糖、葡萄糖等其它糖类均不具备这一功能。
本发明中采用人血白蛋白可以为细胞提供充足的营养成分及保护因子，从而保证复苏后细胞活性和增殖能力。
本发明中甘油和透明质酸相互配合使用，使冻存保护液的液态体系保持稳定，通过该稳定体系的承载和包覆，可以防止脐带间充质干细胞在冻存过程中沉淀至容器底部堆积成团，使脐带间充质干细胞分散且受到周围冻存保护液的侵蚀，并在保存过程中受到保护，减少其损伤，从而提高脐带间充质干细胞的保存存活率。
另外，透明质酸提高细胞的通透性，降低细胞沉降速度，避免细胞损伤；其次，人血白蛋白可维持溶液胶体渗透压，还可维持细胞营养，防止细胞聚集成团。
在具体实施例中，本发明所述冻存保护液的制备方法按照本领域技术人员熟知的方式制备即可，对此本发明没有特别的限制，为了保证冻存保护液的无菌性，本发明所述冻存保护液的制备方法具体为：依次加入MEM培养基、人血白蛋白、透明质酸和甘油，即得到本发明所述的冻存保护液。
在具体实施例中，本发明还设计了一种脐带间充质干细胞的冻存方法，包括如下步骤：
S1脐带预处理；
S2传代培养：加入MEM培养基，进行传代培养；
S3收集细胞：吸除培养皿中的组织块或培养基，进行润洗，收集细胞悬液，用MEM培养基重悬细胞，调整细胞密度后接种细胞进行培养，最后收集细胞；
S4冻存细胞：使用上述脐带间充质干细胞冻存保护液对细胞进行冻存。
优选的，S1脐带预处理的具体方法为：在生物安全柜中，将新鲜脐带放置于培养皿中，进行冲洗，后润洗，之后将洗净的脐带剪成小段，将脐带小段外层的羊膜剥净，撕开华通氏胶，剔除动脉和经脉，将血迹清洗干净，将洗净的脐带小段剪成组织块，并将组织块均匀散布在培养皿中。
优选的，S2传代培养的具体方法为：在放置有脐带组织块的培养皿中加入含有血清的MEM培养基，之后放入温度为37℃、CO2体积分数为5％的培养箱中进行培养，24小时后加液，3天换液1次，培养7天左右有MSCs爬出，14天左右细胞达80％融合度，进行传代培养。
优选的，S3收集细胞的具体方法为：吸除培养皿中的组织块或培养基，进行润洗，弃上清，加入TrypLE消化，再用与TrypLE等量的相对应培养基终止，收集细胞悬液，用滤网过滤至离心瓶中，离心去上清，加入生理盐水，计数，离心去上清，用MEM培养基重悬细胞，并调整细胞密度为1×105cells/ml，按照4×105cells/皿接种于细胞瓶中，于37℃、体积分数5％CO2培养箱中培养，细胞达80％融合度，进行收集。
为了说明本发明可使细胞长时间保存后依然具有较好的复苏率，且细胞具有较好的增殖能力，分别进行了下列实施例。
实施例1：
1)在生物安全柜内，将新鲜放置于培养皿中，用生理盐水冲洗一次，用酒精润洗一次，再用生理盐水润洗一次，用手术剪剪成2cm左右的小段，用有齿镊将脐带小段外层的羊膜剥净，撕开华通氏胶，先剃除2根动脉，再扯掉1根静脉，用生理盐水洗净血迹，再用眼科剪剪成1mm3组织块，将组织块均匀散布在6cm培养皿中，加入含体积分数10％血清的MEM培养基置于37℃、体积分数5％CO2培养箱中培养；24小时后加液，3天换液1次，培养7天左右有MSCs爬出，14天左右细胞达80％融合度，进行传代培养；
2)吸除培养皿中的组织块或培养基，加入2ml生理盐水润洗2次，弃上清，加入2mlTrypLE消化，再用与TrypLE等量的相对应培养基终止，收集细胞悬液，用70um滤网过滤至离心瓶中，离心去上清，加入适量生理盐水，计数，离心去上清，用MEM培养基重悬细胞，并调整细胞密度为1×105cells/ml，按照4×105cells/皿接种于T25细胞瓶中，于37℃、体积分数5％CO2培养箱中培养，3天左右细胞达80％融合度，进行收集。
3)弃培养基上清，加入生理盐水润洗，弃上清；加入3ml TrypLE消化，再用与TrypLE等量的相对应培养基终止，1800rpm，5min离心；用生理盐水重悬细胞，计数后，1800rpm，5min离心；
5)用冻存保护液将细胞重悬，并调整密度为1×106cells/ml，密封后标记细胞名称、冻存保护液种类和冻存日期，采用程序降温仪进行降温，放入液氮罐长期保存。
6)保存10～20天后把冻存管从液氮中取出来进行复苏，将保存的细胞置于37～42℃的水浴中轻微摇动1.5～2分钟，待液体都融化后，拿出来喷少量酒精放到超净工作台里，然后加入生长培养基进行悬浮，1800rpm，5min离心，收集细胞，把上清液倒掉，再加入培养基悬浮，调整细胞浓度至5×104cells/mL，使培养皿中的细胞均匀分布，培养生长至80％融合度，消化后调整细胞浓度至5×104cells/mL接种传代，得到冻存复苏后传代的第1代脐带间充质干细胞，对脐带间充质干细胞再进行培养，冻存，复苏率，细胞生长特性检测。
7)脐带间充质干细胞冻存保护液：7.5％体积的甘油+5％体积的人血白蛋白+80％体积的MEM培养基+7.5％体积的透明质酸；
8)复苏率检测：分别将冻存1个月、3个月、6个月和12个月的样品复苏，每组3个重复，取10μL细胞液与10μL AO/PI混合，取少许细胞混合液加入细胞计数板，并利于细胞计数仪进行活率和数量读值。
9)细胞生长曲线：细胞复苏洗涤后，用适量培养基重悬细胞，向6孔板中每孔加入2.5ml细胞悬液(含10000个活细胞)，放置37℃，5％CO2培养箱中培养7天，每3天换液，每隔24小时取1个6孔板进行消化计数，实验组与对照组取3孔平均值，连续监测7天，将检测结果绘制成脐带间充质干细胞生长曲线。
实施例2：
1)在生物安全柜内，将新鲜放置于培养皿中，用生理盐水冲洗一次，用酒精润洗一次，再用生理盐水润洗一次，用手术剪剪成2cm左右的小段，用有齿镊将脐带小段外层的羊膜剥净，撕开华通氏胶，先剃除2根动脉，再扯掉1根静脉，用生理盐水洗净血迹，再用眼科剪剪成1mm3组织块，将组织块均匀散布在6cm培养皿中，加入含体积分数10％血清的MEM培养基置于37℃、体积分数5％CO2培养箱中培养；24小时后加液，3天换液1次，培养7天左右有MSCs爬出，14天左右细胞达80％融合度，进行传代培养；
2)吸除培养皿中的组织块或培养基，加入2ml生理盐水润洗2次，弃上清，加入2mlTrypLE消化，再用与TrypLE等量的相对应培养基终止，收集细胞悬液，用70um滤网过滤至离心瓶中，离心去上清，加入适量生理盐水，计数，离心去上清，用MEM培养基重悬细胞，并调整细胞密度为1×105cells/ml，按照4×105cells/皿接种于T25细胞瓶中，于37℃、体积分数5％CO2培养箱中培养，3天左右细胞达80％融合度，进行收集。
3)弃培养基上清，加入生理盐水润洗，弃上清；加入3ml TrypLE消化，再用与TrypLE等量的相对应培养基终止，1800rpm，5min离心；用生理盐水重悬细胞，计数后，1800rpm，5min离心；
5)用冻存保护液将细胞重悬，并调整密度为1×106cells/ml，密封后标记细胞名称、冻存保护液种类和冻存日期，采用程序降温仪进行降温，放入液氮罐长期保存。
6)保存10～20天后把冻存管从液氮中取出来进行复苏，将保存的细胞置于37～42℃的水浴中轻微摇动1.5～2分钟，待液体都融化后，拿出来喷少量酒精放到超净工作台里，然后加入生长培养基进行悬浮，1800rpm，5min离心，收集细胞，把上清液倒掉，再加入培养基悬浮，调整细胞浓度至5×104cells/mL，使培养皿中的细胞均匀分布，培养生长至80％融合度，消化后调整细胞浓度至5×104cells/mL接种传代，得到冻存复苏后传代的第1代脐带间充质干细胞，对脐带间充质干细胞再进行培养，冻存，复苏率，细胞生长特性检测。
7)脐带间充质干细胞冻存保护液：10％体积的甘油+7.5％体积的人血白蛋白+80％体积的MEM培养基+2.5％体积的透明质酸；
8)复苏率检测：分别将冻存1个月、3个月、6个月和12个月的样品复苏，每组3个重复，取10μL细胞液与10μL AO/PI混合，取少许细胞混合液加入细胞计数板，并利于细胞计数仪进行活率和数量读值。
9)细胞生长曲线：细胞复苏洗涤后，用适量培养基重悬细胞，向6孔板中每孔加入2.5ml细胞悬液(含10000个活细胞)，放置37℃，5％CO2培养箱中培养7天，每3天换液，每隔24小时取1个6孔板进行消化计数，实验组与对照组取3孔平均值，连续监测7天，将检测结果绘制成脐带间充质干细胞生长曲线。
实施例3：
1)在生物安全柜内，将新鲜放置于培养皿中，用生理盐水冲洗一次，用酒精润洗一次，再用生理盐水润洗一次，用手术剪剪成2cm左右的小段，用有齿镊将脐带小段外层的羊膜剥净，撕开华通氏胶，先剃除2根动脉，再扯掉1根静脉，用生理盐水洗净血迹，再用眼科剪剪成1mm3组织块，将组织块均匀散布在6cm培养皿中，加入含体积分数10％血清的MEM培养基置于37℃、体积分数5％CO2培养箱中培养；24小时后加液，3天换液1次，培养7天左右有MSCs爬出，14天左右细胞达80％融合度，进行传代培养；
2)吸除培养皿中的组织块或培养基，加入2ml生理盐水润洗2次，弃上清，加入2mlTrypLE消化，再用与TrypLE等量的相对应培养基终止，收集细胞悬液，用70um滤网过滤至离心瓶中，离心去上清，加入适量生理盐水，计数，离心去上清，用MEM培养基重悬细胞，并调整细胞密度为1×105cells/ml，按照4×105cells/皿接种于T25细胞瓶中，于37℃、体积分数5％CO2培养箱中培养，3天左右细胞达80％融合度，进行收集。
3)弃培养基上清，加入生理盐水润洗，弃上清；加入3ml TrypLE消化，再用与TrypLE等量的相对应培养基终止，1800rpm，5min离心；用生理盐水重悬细胞，计数后，1800rpm，5min离心；
5)用冻存保护液将细胞重悬，并调整密度为1×106cells/ml，密封后标记细胞名称、冻存保护液种类和冻存日期，采用程序降温仪进行降温，放入液氮罐长期保存。
6)保存10～20天后把冻存管从液氮中取出来进行复苏，将保存的细胞置于37～42℃的水浴中轻微摇动1.5～2分钟，待液体都融化后，拿出来喷少量酒精放到超净工作台里，然后加入生长培养基进行悬浮，1800rpm，5min离心，收集细胞，把上清液倒掉，再加入培养基悬浮，调整细胞浓度至5×104cells/mL，使培养皿中的细胞均匀分布，培养生长至80％融合度，消化后调整细胞浓度至5×104cells/mL接种传代，得到冻存复苏后传代的第1代脐带间充质干细胞，对脐带间充质干细胞再进行培养，冻存，复苏率，细胞生长特性检测。
7)脐带间充质干细胞冻存保护液：12.5％体积的甘油+5％体积的人血白蛋白+80％体积的MEM培养基+2.5％体积的透明质酸；
8)复苏率检测：分别将冻存1个月、3个月、6个月和12个月的样品复苏，每组3个重复，取10μL细胞液与10μL AO/PI混合，取少许细胞混合液加入细胞计数板，并利于细胞计数仪进行活率和数量读值。
9)细胞生长曲线：细胞复苏洗涤后，用适量培养基重悬细胞，向6孔板中每孔加入2.5ml细胞悬液(含10000个活细胞)，放置37℃，5％CO2培养箱中培养7天，每3天换液，每隔24小时取1个6孔板进行消化计数，实验组与对照组取3孔平均值，连续监测7天，将检测结果绘制成脐带间充质干细胞生长曲线。
将上述3个实施例与现有技术提供的冻存保护液进行对比，其中现有技术提供的冻存保护液称为对照组，其配方分别如下：
对照组一：10％体积的FBS+80％体积的MEM培养基+10％体积的DMSO；
对照组二：10％体积的FBS+80％体积的MEM培养基+10％体积的甘油；
对照组三：10％体积的人血白蛋白+80％体积的MEM培养基+10％体积的甘油。
将对照组进行与实验组相同的培养，获得复苏后的脐带间充质干细胞的生长天数曲线图。
复苏后细胞7天的生长曲线分为3个阶段，第一阶段为适应期，细胞增殖较慢；第二阶段为生长期，细胞增殖较快，呈对数增长；第三阶段为平台期，细胞增长变慢。
将实施例1～3、对照组1～3复苏后细胞7天的生长数据绘制表1，根据表1绘制出图1。
表1 实施例1～3、对照组1～3复苏后细胞7天的生长数据表
Figure BDA0002569274560000131
将实施例1～3、对照组1～3复苏后细胞存活率结果数据绘制表2。
表2 实施例1～3、对照组1～3复苏后细胞存活率结果
Figure BDA0002569274560000132
从表1、表2、图1中可以看出，分离培养的人脐带间充质干细胞传至第1代后使用制备实施例1～3得到的保护液进行冻存，在复苏后进行培养，冻存，复苏，细胞活率与细胞增殖检测，结果显示实验组细胞活率显著高于对照组，细胞增殖结果显示，实验组的细胞生长速度与状态明显优于对照组。由以上结果可以看出，本发明的冻存保护液特别适合于人脐带干细胞的冻存培养，具有较好的细胞保护活性。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想及本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (8)

1.一种脐带间充质干细胞冻存保护液，其特征在于：该冻存保护液包括甘油、人血白蛋白、透明质酸和MEM培养基。
2.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞冻存保护液，其特征在于：所述冻存保护液包括7.5vol％～12.5vol％的甘油、5vol％～7.5vol％的透明质酸、5vol％～7.5vol％的人血白蛋白。
3.根据权利要求2所述的一种脐带间充质干细胞冻存保护液，其特征在于：所述甘油的含量为6.5vol％～8.8vol％。
4.根据权利要求2所述的一种脐带间充质干细胞冻存保护液，其特征在于：所述透明质酸为D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的双糖单位玻尿酸。
5.一种脐带间充质干细胞的冻存方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1脐带预处理；
S2传代培养：加入MEM培养基，进行传代培养；
S3收集细胞：吸除培养皿中的组织块或培养基，进行润洗，收集细胞悬液，用MEM培养基重悬细胞，调整细胞密度后接种细胞进行培养，最后收集细胞；
S4冻存细胞：使用权利要求1-4任一项所述的脐带间充质干细胞冻存保护液对细胞进行冻存。
6.根据权利要求5所述的一种脐带间充质干细胞的冻存方法，其特征在于：S1脐带预处理的具体方法为：在生物安全柜中，将新鲜脐带放置于培养皿中，进行冲洗，后润洗，之后将洗净的脐带剪成小段，将脐带小段外层的羊膜剥净，撕开华通氏胶，剔除动脉和经脉，将血迹清洗干净，将洗净的脐带小段剪成组织块，并将组织块均匀散布在培养皿中。
7.根据权利要求5所述的一种脐带间充质干细胞的冻存方法，其特征在于：S2传代培养的具体方法为：在放置有脐带组织块的培养皿中加入含有血清的MEM培养基，之后放入温度为37℃、CO2体积分数为5％的培养箱中进行培养，之后进行加液，换液，培养到细胞达80％融合度，进行传代培养。
8.根据权利要求5所述的一种脐带间充质干细胞的冻存方法，其特征在于：S3收集细胞的具体方法为：吸除培养皿中的组织块或培养基，进行润洗，弃上清，加入TrypLE消化，再用与TrypLE等量的相对应培养基终止，收集细胞悬液，用滤网过滤至离心瓶中，离心去上清，加入生理盐水，计数，再离心去上清，用MEM培养基重悬细胞，并调整细胞密度为1×105cells/ml，按照4×105cells/皿接种于细胞瓶中，于37℃、体积分数5％CO2培养箱中培养，细胞达80％融合度，进行收集。
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