CN116491501A - 一种原代组织冻存液及其冻存、复苏和消化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种组织冻存液，包括以下体积份数的组分：Advanced DMEM/F12 60~80份，胎牛血清10~20份，二甲基亚砜10~20份，ROCK抑制剂0.05~0.15份。本发明的组织冻存液，适用性广，可以用于人体和动物组织的冻存。适用的组织类型包括：实体瘤组织、肺、肝脏、消化道、睾丸、胰腺、神经组织，以及神经胶质瘤类器官组织等。冻存于液氮或者‑80℃的组织，经过复苏和组织消化后活力可以达到75%以上，经过消化获得的原代细胞，可以按照常规的方法进行类器官培养和其他生物学测试。

Description

一种原代组织冻存液及其冻存、复苏和消化方法
技术领域
本发明属于组织类器官培养技术领域，具体涉及一种原代组织冻存液及其冻存、复苏和消化方法。
背景技术
在围绕神经系统的研究中，神经元的原代分离培养是非常重要的体外研究，用于研究神经细胞的各种生理功能，由于神经组织获得的局限性，关于神经元原代分离主要是在啮齿类哺乳动物上进行。例如，常用于神经元原代分离的啮齿类动物有胎鼠、新生鼠。然而由于神经元细胞缺乏增殖能力，一次原代分离后，在体外不适宜长期存活、生长、分化，不利于研究的顺利进行；此外，对于原代神经元来说，其对外界环境尤为敏感，不良刺激后极易死亡，所以神经组织的原代细胞体外实验中，一般都是现用现分离新鲜组织培养，这就导致了在研究原代神经元时，由于研究目标取材的限制，例如胎鼠、新生鼠获取的不易、周期较长，综合导致研究周期成本的增高。
细胞冷冻技术作为一种保存细胞的有效方法在生物学领域已深入广泛的应用。研究人员经常需要冷冻细胞并保存，以供后续实验或临床使用。传统的低温冷冻保存技术是将二甲亚砜和血清中加入细胞混悬液后放入冻存管中，于-80℃冰箱慢慢冷冻后，将冻存管置于液氮中保存，使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，需要时快速解冻。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄增、交换和运输某些细胞。细胞冻存时加入保护剂终浓度5％-15％的甘油或二甲基亚砜(DMSO)，可使溶液冰点降低，在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。采用"慢冻快融"的方法能较好地保证细胞存活。
组织类器官(Tissue Organoids)是从机体（人体和动物）组织干细胞衍生而来的组织类似物。来自于特定疾病类型的患者组织（最常见的是肿瘤组织），经过在实验室培养，形成可以保留来源组织的病理组织结构特征、遗传特征和细胞类型异质性的类器官。类器官具有可以在体外长期培养、传代、冻存和复苏的特征，因此，类器官为基础科研和临床转化医学提供了一种非常灵活的工具，在疾病研究、再生医学、新药研发和临床精准医疗中具有重要意义。
制备类器官的第一步是组织取样，组织的初始样本量和新鲜程度直接决定了类器官培养的成功率。但是在实际情况中，常常出现组织取材后不能第一时间进行类器官培养，或者需要进行长距离运输超过48小时的情况，这样组织中细胞活力的保持就是最大的难题。目前，市场上还没有一款产品是用来进行组织冻存的试剂，采用已有的细胞冻存的方法进行组织冻存，导致组织复苏后细胞活力显著降低，基本不能用于类器官的培养。
发明内容
本发明针对已有的细胞冻存的方法进行组织冻存，导致组织复苏后细胞活力显著降低，基本不能用于类器官的培养的问题，提供一种原代组织冻存液及其冻存、复苏和消化方法，消化后的细胞可以进行常规的类器官培养，真正解决了长距离运输组织和长时间冻存组织类器官培养成功率低的难题。
本发明提供的一种组织冻存液，包括以下体积份数的组分：Advanced DMEM/F1260~80份，胎牛血清（FBS）10~20份，二甲基亚砜10~20份，ROCK抑制剂（Y27632） 0.05~15份 。
优选的所述组织冻存液包括以下体积份数的组分：Advanced DMEM/F12 60份，胎牛血清20份，二甲基亚砜20份，ROCK抑制剂0.1份。
优选的组织冻存液包括以下体积份数的组分：Advanced DMEM/F12 70份，胎牛血清20份，二甲基亚砜10份，ROCK抑制剂0.1份。
优选的组织冻存液包括以下体积份数的组分：Advanced DMEM/F12 70份，胎牛血清10份，二甲基亚砜20份，ROCK抑制剂0.1份。
优选的组织冻存液包括以下体积份数的组分：Advanced DMEM/F12 80份，胎牛血清15份，二甲基亚砜15份，ROCK抑制剂0.15份。
本发明另外涉及一种原代组织冻存液冻存、复苏和消化方法，包括以下步骤：
原代组织收集和冻存：取离体哺乳动物的组织，放置于专用样本管中，低温保存或冷链运输，转移至培养皿中，滴加权利要求1至3任一组织保存液保证组织表面润湿，将组织切成碎片，转移至含有权利要求1至3任一组织保存液的冻存管中，并在液氮温度下长期保存；
组织复苏：将需要复苏的组织冻存管从液氮中取出，迅速放入恒温水浴锅中，轻柔融化，至冻存液融化只剩一小块冰晶的时候，将冻存管取出，将组织取出，转移至含有基础培养基的离心管中；
组织消化：复苏后的组织，放入无菌培养皿中，用含有双抗的PBS抽吸冲洗，对标本进行机械分离，将大块的组织分离成为碎片或糊糜状，将经过机械分离的组织，使用巴氏吸管全部转移至无菌离心管中，根据组织量，添加适量组织消化液，用枪头轻轻吹打组织，使其充分分散；将含有该消化液的离心管放置恒温空气浴的摇床上，进行消化，中间每隔段时间取出，镜下观察分离效果，至大部分组织分离消化后停止，用无菌的PBS进行终止消化，将细胞悬液用筛网进行过滤，用无菌PBS清洗筛网，将细胞悬液过滤至新的50ml离心管中，将上述含有细胞滤液的离心管进行离心，小心去除上清，沉淀细胞用PBS清洗一次；向细胞沉淀中加入适量的细胞培养液 ，轻轻吹打制成细胞悬液，进行后续类器官培养，其中细胞培养液可以按照文献配方进行目标类器官培养液配制，市场上也有类器官培养液，比如嘉士腾医药的各种癌种组织类器官培养液。
在所述原代组织收集和冻存步骤中，采集手术切除或穿刺的新鲜组织，避开坏死、溃疡部位，组织离体后尽快放置于专用样本管中，并置于4℃保存或冷链运输；样本运送至超净细胞间后，在生物安全柜中操作，将组织块转移至10cm培养皿中，滴加少量权利要求1至3任一组织保存液保证组织表面润湿，采用无菌手术刀和刀片，对组织进行机械分离，直至成为大约1×1×1mm3的细小碎片，使得冷冻保护剂能够充分渗透进入组织内部，以此达到减小胞内冰晶损伤，起到保护细胞的作用，使用巴氏吸管将组织碎片转移至含有2ml组织冻存液的冻存管中，室温平衡1小时，使用-1℃/分钟慢速控制冷却方案或异丙醇冷冻容器冷冻保存组织，并在液氮温度-196°C下长期保存，也可放入程序性冻存盒内于-80℃冰箱过夜保存，次日将冻存管转移至液氮罐中长期保存。
在所述组织复苏步骤中，将需要复苏的组织冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃的恒温水浴锅中，轻柔融化，至冻存液融化只剩一小块冰晶的时候，将冻存管取出，将组织取出，转移至含有Advanced DMEM/F12或DMEM/F12基础培养基的离心管中。
在所述组织消化步骤中，复苏后的组织，放入10cm无菌培养皿中，用含有双抗的PBS抽吸冲洗3次以上，采用无菌的剪刀和手术刀，对标本进行机械分离，将大块的组织分离成为大约0.5mm3的细小碎片或糊糜状；减少酶消化时间，提高细胞活率。将经过机械分离的组织，使用巴氏吸管全部转移至15ml无菌离心管中，根据组织量，按照1：4的体积比，添加适量组织消化液，用1ml枪头轻轻吹打组织，使其充分分散；将含有该消化液的离心管放置恒温空气浴的摇床上，于37℃、200rpm，进行消化，中间每隔5min取出，镜下观察分离效果，至大部分组织分离消化后停止，用无菌的PBS进行终止消化，将细胞悬液用100μm的筛网进行过滤，用无菌PBS清洗筛网，将细胞悬液过滤至新的50ml离心管中，将上述含有细胞滤液的离心管进行4℃，300g，离心5min，小心去除上清，沉淀细胞用PBS清洗一次；向细胞沉淀中加入适量的细胞培养液，轻轻吹打制成细胞悬液，进行后续类器官培养。
所述组织消化液是胶原酶或DNase（脱氧核糖核酸酶）。
采用细胞计数仪进行细胞计数，采用台盼蓝染色法测定细胞活率。
本发明的组织冻存液，适用性广，可以用于人体和动物组织的冻存。适用的组织类型包括：实体瘤组织、肺、肝脏、消化道、睾丸、胰腺、神经组织，以及神经胶质瘤类器官组织等。
本发明冻存于液氮或者-80℃的组织，经过复苏和组织消化后活力可以达到75%以上。
本发明经过消化获得的原代细胞，可以按照常规的方法进行类器官培养和其他生物学测试。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施方式对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅仅用以解释本发明，但并不用于限定本发明。
本发明实验及测试所用产品来源如下：
Advanced DMEM/F12（购于Thermo公司，货号12634010），胎牛血清（FBS, 购于Thermo公司，货号10100147），二甲基亚砜（购于Sigma公司，货号D8418），ROCK抑制剂（Y27632, 购于mce公司，货号HY-10071），台盼蓝染色液(购于Thermo公司，货号15250061)，新鲜组织（某医院结直肠癌手术切除组织），胶原酶（购于roche，货号10103586001），DNase（购于翌圣生物科技（上海）股份有限公司，货号10607ES15）。
实施例1
（1）按表一配方分别取Advanced DMEM/F12，FBS，二甲基亚砜，ROCK
抑制剂于试剂瓶中，混匀待用。
表一 组织冻存液配方：
实施例2
一种原代组织冻存液冻存、复苏和消化方法，包括以下步骤：
（1）原代组织收集和冻存：采集手术切除的新鲜组织，避开坏死、溃疡部位，组织离体后尽快放置于专用样本管中，并置于4℃保存或冷链运输；样本运送至超净细胞间后，在生物安全柜中操作，将组织块转移至10cm培养皿中，滴加少量实施例1序号1的组织保存液保证组织表面润湿，采用无菌手术刀和刀片，对组织进行机械分离，直至成为大约1×1×1mm3的细小碎片，使得冷冻保护剂能够充分渗透进入组织内部，以此达到减小胞内冰晶损伤，起到保护细胞的作用，使用巴氏吸管将组织碎片转移至含有2ml实施例1序号1的组织冻存液的冻存管中，室温平衡1小时，使用-1℃/分钟慢速控制冷却方案或异丙醇冷冻容器冷冻保存组织，并在液氮温度-196°C下长期保存，也可放入程序性冻存盒内于-80℃冰箱过夜保存，次日将冻存管转移至液氮罐中长期保存。
在所述组织复苏步骤中，将需要复苏的组织冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃的恒温水浴锅中，轻柔融化，至冻存液融化只剩一小块冰晶的时候，将冻存管取出，将组织取出，转移至含有Advanced DMEM/F12或DMEM/F12基础培养基的离心管中；
（2）组织复苏：将需要复苏的组织冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃的恒温水浴锅中，轻柔融化，至冻存液融化只剩一小块冰晶的时候，将冻存管取出，将组织取出，转移至含有Advanced DMEM/F12或DMEM/F12基础培养基的离心管中；
（3）组织消化：复苏后的组织，放入10cm无菌培养皿中，用含有双抗的PBS抽吸冲洗3次，采用无菌的剪刀和手术刀，对标本进行机械分离，将大块的组织分离成为大约0.5mm3的细小碎片或糊糜状；将经过机械分离的组织，使用巴氏吸管全部转移至15ml无菌离心管中，根据组织量，按照1：4的体积比，添加胶原酶，用1ml枪头轻轻吹打组织，使其充分分散；将含有该消化液的离心管放置恒温空气浴的摇床上，于37℃、200rpm，进行消化，中间每隔5min取出，镜下观察分离效果，至大部分组织分离消化后停止，用无菌的PBS进行终止消化，将细胞悬液用100μm的筛网进行过滤，用无菌PBS清洗筛网，将细胞悬液过滤至新的50ml离心管中，将上述含有细胞滤液的离心管进行4℃，300g，离心5min，小心去除上清，沉淀细胞用PBS清洗一次；向细胞沉淀中加入适量的细胞培养液，轻轻吹打制成细胞悬液，进行后续类器官培养。
实施例3
参考实施例2，将组织冻存液替换成实施例1序号2。
实施例4
参考实施例2，将组织冻存液替换成实施例1序号3。
实施例5
参考实施例2，将组织冻存液替换成实施例1序号4。
实施例6
参考实施例2，将组织冻存液替换成实施例1序号5。
实施例7
一种原代组织冻存液冻存、复苏和消化方法，包括以下步骤：
（1）原代组织收集和冻存：采集手术切除的新鲜组织，避开坏死、溃疡部位，组织离体后尽快放置于专用样本管中，并置于4℃保存或冷链运输；样本运送至超净细胞间后，在生物安全柜中操作，将组织块转移至10cm培养皿中，滴加少量实施例1序号1的组织保存液保证组织表面润湿，采用无菌手术刀和刀片，对组织进行机械分离，直至成为大约1×1×1mm3的细小碎片，使得冷冻保护剂能够充分渗透进入组织内部，以此达到减小胞内冰晶损伤，起到保护细胞的作用，使用巴氏吸管将组织碎片转移至含有2ml实施例1序号1的组织冻存液的冻存管中，室温平衡1小时，使用-1℃/分钟慢速控制冷却方案或异丙醇冷冻容器冷冻保存组织，并在液氮温度-196°C下长期保存，也可放入程序性冻存盒内于-80℃冰箱过夜保存，次日将冻存管转移至液氮罐中长期保存。
在所述组织复苏步骤中，将需要复苏的组织冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃的恒温水浴锅中，轻柔融化，至冻存液融化只剩一小块冰晶的时候，将冻存管取出，将组织取出，转移至含有Advanced DMEM/F12或DMEM/F12基础培养基的离心管中；
（2）组织复苏：将需要复苏的组织冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃的恒温水浴锅中，轻柔融化，至冻存液融化只剩一小块冰晶的时候，将冻存管取出，将组织取出，转移至含有Advanced DMEM/F12或DMEM/F12基础培养基的离心管中；
（3）组织消化：复苏后的组织，放入10cm无菌培养皿中，用含有双抗的PBS抽吸冲洗3次，采用无菌的剪刀和手术刀，对标本进行机械分离，将大块的组织分离成为大约0.5mm3的细小碎片或糊糜状；将经过机械分离的组织，使用巴氏吸管全部转移至15ml无菌离心管中，根据组织量，按照1：4的体积比，添加DNase，用1ml枪头轻轻吹打组织，使其充分分散；将含有该消化液的离心管放置恒温空气浴的摇床上，于37℃、200rpm，进行消化，中间每隔5min取出，镜下观察分离效果，至大部分组织分离消化后停止，用无菌的PBS进行终止消化，将细胞悬液用100μm的筛网进行过滤，用无菌PBS清洗筛网，将细胞悬液过滤至新的50ml离心管中，将上述含有细胞滤液的离心管进行4℃，300g，离心5min，小心去除上清，沉淀细胞用PBS清洗一次；向细胞沉淀中加入适量的细胞培养液，轻轻吹打制成细胞悬液，进行后续类器官培养。
对照例1
一种原代组织冻存液冻存、复苏和消化方法，包括以下步骤：
（1）原代组织收集和冻存：采集手术切除的新鲜组织，避开坏死、溃疡部位，组织离体后尽快放置于专用样本管中，并置于4℃保存或冷链运输；样本运送至超净细胞间后，在生物安全柜中操作，将组织块转移至10cm培养皿中，滴加少量实施例1序号2的组织保存液保证组织表面润湿，采用无菌手术刀和刀片，对组织进行机械分离，直至成为大约2×2×2mm3的细小碎片，使得冷冻保护剂能够充分渗透进入组织内部，以此达到减小胞内冰晶损伤，起到保护细胞的作用，使用巴氏吸管将组织碎片转移至含有2ml实施例1序号2的组织冻存液的冻存管中，室温平衡1小时，使用-1℃/分钟慢速控制冷却方案或异丙醇冷冻容器冷冻保存组织，并在液氮温度-196°C下长期保存，也可放入程序性冻存盒内于-80℃冰箱过夜保存，次日将冻存管转移至液氮罐中长期保存。
在所述组织复苏步骤中，将需要复苏的组织冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃的恒温水浴锅中，轻柔融化，至冻存液融化只剩一小块冰晶的时候，将冻存管取出，将组织取出，转移至含有Advanced DMEM/F12或DMEM/F12基础培养基的离心管中；
（2）组织复苏：将需要复苏的组织冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃的恒温水浴锅中，轻柔融化，至冻存液融化只剩一小块冰晶的时候，将冻存管取出，将组织取出，转移至含有Advanced DMEM/F12或DMEM/F12基础培养基的离心管中；
（3）组织消化：复苏后的组织，放入10cm无菌培养皿中，用含有双抗的PBS抽吸冲洗3次，采用无菌的剪刀和手术刀，对标本进行机械分离，将大块的组织分离成为大约0.5mm3的细小碎片或糊糜状；将经过机械分离的组织，使用巴氏吸管全部转移至15ml无菌离心管中，根据组织量，按照1：4的体积比，添加DNase，用1ml枪头轻轻吹打组织，使其充分分散；将含有该消化液的离心管放置恒温空气浴的摇床上，于37℃、200rpm，进行消化，中间每隔5min取出，镜下观察分离效果，至大部分组织分离消化后停止，用无菌的PBS进行终止消化，将细胞悬液用100μm的筛网进行过滤，用无菌PBS清洗筛网，将细胞悬液过滤至新的50ml离心管中，将上述含有细胞滤液的离心管进行4℃，300g，离心5min，小心去除上清，沉淀细胞用PBS清洗一次；向细胞沉淀中加入适量的细胞培养液，轻轻吹打制成细胞悬液，进行后续类器官培养。
对照例2
一种原代组织冻存液冻存、复苏和消化方法，包括以下步骤：
（1）原代组织收集和冻存：采集手术切除的新鲜组织，避开坏死、溃疡部位，组织离体后尽快放置于专用样本管中，并置于4℃保存或冷链运输；样本运送至超净细胞间后，在生物安全柜中操作，将组织块转移至10cm培养皿中，滴加少量实施例1序号2的组织保存液保证组织表面润湿，采用无菌手术刀和刀片，对组织进行机械分离，直至成为大约5×5×5mm3的细小碎片，使得冷冻保护剂能够充分渗透进入组织内部，以此达到减小胞内冰晶损伤，起到保护细胞的作用，使用巴氏吸管将组织碎片转移至含有2ml实施例1序号2的组织冻存液的冻存管中，室温平衡1小时，使用-1℃/分钟慢速控制冷却方案或异丙醇冷冻容器冷冻保存组织，并在液氮温度-196°C下长期保存，也可放入程序性冻存盒内于-80℃冰箱过夜保存，次日将冻存管转移至液氮罐中长期保存。
在所述组织复苏步骤中，将需要复苏的组织冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃的恒温水浴锅中，轻柔融化，至冻存液融化只剩一小块冰晶的时候，将冻存管取出，将组织取出，转移至含有Advanced DMEM/F12或DMEM/F12基础培养基的离心管中；
（2）组织复苏：将需要复苏的组织冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃的恒温水浴锅中，轻柔融化，至冻存液融化只剩一小块冰晶的时候，将冻存管取出，将组织取出，转移至含有Advanced DMEM/F12或DMEM/F12基础培养基的离心管中；
（3）组织消化：复苏后的组织，放入10cm无菌培养皿中，用含有双抗的PBS抽吸冲洗3次，采用无菌的剪刀和手术刀，对标本进行机械分离，将大块的组织分离成为大约0.5mm3的细小碎片或糊糜状；将经过机械分离的组织，使用巴氏吸管全部转移至15ml无菌离心管中，根据组织量，按照1：4的体积比，添加DNase，用1ml枪头轻轻吹打组织，使其充分分散；将含有该消化液的离心管放置恒温空气浴的摇床上，于37℃、200rpm，进行消化，中间每隔5min取出，镜下观察分离效果，至大部分组织分离消化后停止，用无菌的PBS进行终止消化，将细胞悬液用100μm的筛网进行过滤，用无菌PBS清洗筛网，将细胞悬液过滤至新的50ml离心管中，将上述含有细胞滤液的离心管进行4℃，300g，离心5min，小心去除上清，沉淀细胞用PBS清洗一次；向细胞沉淀中加入适量的细胞培养液，轻轻吹打制成细胞悬液，进行后续类器官培养。
对照例3
一种原代组织冻存液冻存、复苏和消化方法，包括以下步骤：
（1）原代组织收集和冻存：采集手术切除的新鲜组织，避开坏死、溃疡部位，组织离体后尽快放置于专用样本管中，并置于4℃保存或冷链运输；样本运送至超净细胞间后，在生物安全柜中操作，将组织块转移至10cm培养皿中，滴加少量实施例1序号2的组织保存液保证组织表面润湿，采用无菌手术刀和刀片，对组织进行机械分离，直至成为大约1×1×1mm3的细小碎片，使得冷冻保护剂能够充分渗透进入组织内部，以此达到减小胞内冰晶损伤，起到保护细胞的作用，使用巴氏吸管将组织碎片转移至含有2ml实施例1序号2的组织冻存液的冻存管中，室温平衡1小时，使用-1℃/分钟慢速控制冷却方案或异丙醇冷冻容器冷冻保存组织，并在液氮温度-196°C下长期保存，也可放入程序性冻存盒内于-80℃冰箱过夜保存，次日将冻存管转移至液氮罐中长期保存。
在所述组织复苏步骤中，将需要复苏的组织冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃的恒温水浴锅中，轻柔融化，至冻存液融化只剩一小块冰晶的时候，将冻存管取出，将组织取出，转移至含有Advanced DMEM/F12或DMEM/F12基础培养基的离心管中；
（2）组织复苏：将需要复苏的组织冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃的恒温水浴锅中，轻柔融化，至冻存液融化只剩一小块冰晶的时候，将冻存管取出，将组织取出，转移至含有Advanced DMEM/F12或DMEM/F12基础培养基的离心管中；
（3）组织消化：复苏后的组织，放入10cm无菌培养皿中，用含有双抗的PBS抽吸冲洗3次，采用无菌的剪刀和手术刀，对标本进行机械分离，将大块的组织分离成为大约1mm3的细小碎片或糊糜状；将经过机械分离的组织，使用巴氏吸管全部转移至15ml无菌离心管中，根据组织量，按照1：4的体积比，添加胶原酶，用1ml枪头轻轻吹打组织，使其充分分散；将含有该消化液的离心管放置恒温空气浴的摇床上，于37℃、200rpm，进行消化，中间每隔5min取出，镜下观察分离效果，至大部分组织分离消化后停止，用无菌的PBS进行终止消化，将细胞悬液用100μm的筛网进行过滤，用无菌PBS清洗筛网，将细胞悬液过滤至新的50ml离心管中，将上述含有细胞滤液的离心管进行4℃，300g，离心5min，小心去除上清，沉淀细胞用PBS清洗一次；向细胞沉淀中加入适量的细胞培养液，轻轻吹打制成细胞悬液，进行后续类器官培养。
细胞活率测定
对本发明实施例及对照例冻存1个月、复苏和消化的细胞采用细胞计数仪进行细胞计数，采用台盼蓝染色法测定细胞活率。
1. 组织冻存液组分含量对细胞活率的影响
2. 原代组织收集和冻存步骤组织机械分离的碎片大小对细胞活率的影响
3. 组织消化步骤将大块组织分离的碎片大小对细胞活率的影响
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种组织冻存液，其特征在于，所述组织冻存液包括以下体积份数的组分：AdvancedDMEM/F12 60~80份，胎牛血清10~20份，二甲基亚砜10~20份，ROCK抑制剂0.05~0.15份。
2.根据权利要求1所述的组织冻存液，其特征在于，所述组织冻存液包括以下体积份数的组分：Advanced DMEM/F12 60份，胎牛血清20份，二甲基亚砜20份，ROCK抑制剂0.1份。
3.根据权利要求1所述的组织冻存液，其特征在于，所述组织冻存液包括以下体积份数的组分：Advanced DMEM/F12 70份，胎牛血清20份，二甲基亚砜10份，ROCK抑制剂0.1份。
4.根据权利要求1所述的组织冻存液，其特征在于，所述组织冻存液包括以下体积份数的组分：Advanced DMEM/F12 70份，胎牛血清10份，二甲基亚砜20份，ROCK抑制剂0.1份。
5.根据权利要求1所述的组织冻存液，其特征在于，所述组织冻存液包括以下体积份数的组分：Advanced DMEM/F12 80份，胎牛血清15份，二甲基亚砜15份，ROCK抑制剂0.15份。
6.一种原代组织冻存液冻存、复苏和消化方法，其特征在于，所述冻存、复苏和消化方法包括以下步骤：
原代组织收集和冻存：取离体哺乳动物的组织，放置于样本管中，低温保存或冷链运输，转移至培养皿中，滴加权利要求1至5任一组织冻存液保证组织表面润湿，将组织切成碎片，转移至含有权利要求1至5任一组织冻存液的冻存管中，并在液氮温度下长期保存；
组织复苏：将需要复苏的冻存管从液氮中取出，迅速放入恒温水浴锅中，轻柔融化，至冻存液融化只剩一小块冰晶时，将冻存管取出，将组织取出，转移至含有基础培养基的离心管中；
组织消化：复苏后的组织，放入无菌培养皿中，用含有双抗的PBS抽吸冲洗，对标本进行机械分离，将大块的组织分离成为碎片或糊糜状，将经过机械分离的组织，使用巴氏吸管全部转移至无菌离心管中，根据组织量，添加组织消化液，用枪头轻轻吹打组织，使其充分分散；将含有该消化液的离心管放置恒温空气浴的摇床上，进行消化，中间每隔段时间取出，镜下观察分离效果，至大部分组织分离消化后停止，用无菌的PBS进行终止消化，将细胞悬液用筛网进行过滤，用无菌PBS清洗筛网，将细胞悬液过滤至新的离心管中，将上述含有细胞滤液的离心管进行离心，小心去除上清，沉淀细胞用PBS清洗一次；向细胞沉淀中加入适量的细胞培养液，轻轻吹打制成细胞悬液，进行后续类器官培养。
7.根据权利要求6所述的原代组织冻存液冻存、复苏和消化方法，其特征在于，在所述原代组织收集和冻存步骤中，采集手术切除或穿刺的新鲜组织，避开坏死、溃疡部位，组织离体后尽快放置于专用样本管中，并置于4℃保存或冷链运输；样本运送至超净细胞间后，在生物安全柜中操作，将组织块转移至10cm培养皿中，滴加少量权利要求1至3任一组织冻存液保证组织表面润湿，采用无菌手术刀和刀片，对组织进行机械分离，直至成为大约1×1×1mm3的细小碎片，使用巴氏吸管将组织碎片转移至含有2ml组织冻存液的冻存管中，室温平衡1小时，使用-1℃/分钟慢速控制冷却方案或异丙醇冷冻容器冷冻保存组织，并在液氮温度-196°C下长期保存，也可放入程序性冻存盒内于-80℃冰箱过夜保存，次日将冻存管转移至液氮罐中长期保存。
8.根据权利要求6所述的原代组织冻存液冻存、复苏和消化方法，其特征在于，在所述组织复苏步骤中，将需要复苏的组织冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃的恒温水浴锅中，轻柔融化，至冻存液融化只剩一小块冰晶的时候，将冻存管取出，将组织取出，转移至含有Advanced DMEM/F12或DMEM/F12基础培养基的离心管中。
9.根据权利要求6所述的原代组织冻存液冻存、复苏和消化方法，其特征在于，在所述组织消化步骤中，复苏后的组织，放入10cm无菌培养皿中，用含有双抗的PBS抽吸冲洗3次以上，采用无菌的剪刀和手术刀，对标本进行机械分离，将大块的组织分离成为大约0.5mm3的细小碎片或糊糜状；将经过机械分离的组织，使用巴氏吸管全部转移至15ml无菌离心管中，根据组织量，按照1：4的体积比，添加组织消化液，用1ml枪头轻轻吹打组织，使其充分分散；将含有该消化液的离心管放置恒温空气浴的摇床上，于37℃、200rpm，进行消化，中间每隔5min取出，镜下观察分离效果，至大部分组织分离消化后停止，用无菌的PBS进行终止消化，将细胞悬液用100μm的筛网进行过滤，用无菌PBS清洗筛网，将细胞悬液过滤至新的50ml离心管中，将上述含有细胞滤液的离心管进行4℃，300g，离心5min，小心去除上清，沉淀细胞用PBS清洗一次；向细胞沉淀中加入适量的细胞培养液，轻轻吹打制成细胞悬液，进行后续类器官培养。
10.根据权利要求9所述的原代组织冻存液冻存、复苏和消化方法，其特征在于，所述组织消化液是胶原酶或DNase。
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Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009219503A (ja) * 2009-07-07 2009-10-01 Cell Bank:Kk 組織由来細胞の凍結保存方法
CN104480533A (zh) * 2014-12-29 2015-04-01 黑龙江天晴干细胞股份有限公司 一种胎盘干细胞库的构建方法及胎盘组织复苏方法
CN105850980A (zh) * 2016-04-14 2016-08-17 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种角膜缘干细胞的冻存液及冻存方法
CN109090100A (zh) * 2018-08-27 2018-12-28 深圳市浊安认证生物技术有限公司 一种间充质干细胞冻存液及其制备方法与使用方法
CN110338189A (zh) * 2019-07-09 2019-10-18 浙江优牙生物科技有限公司 一种牙髓组织无血清冻存及复苏方法及冻存液
CN111602652A (zh) * 2020-07-03 2020-09-01 上海中溢精准医疗科技有限公司 一种脐带间充质干细胞冻存保护液
CN113287599A (zh) * 2021-04-30 2021-08-24 创芯国际生物科技(广州)有限公司 一种冻存液组合物、冻存液及类器官冻存方法
CN113558043A (zh) * 2021-08-07 2021-10-29 扈晖 一种肿瘤类器官专用冻存液
CN115247147A (zh) * 2021-12-17 2022-10-28 黑龙江诺亚康大干细胞技术有限责任公司 一种脐带间充质干细胞的培养及冻存方法
CN115299434A (zh) * 2022-08-09 2022-11-08 广州明迅生物科技有限责任公司 细胞冻存液、细胞冻存和复苏方法及其应用
CN116034987A (zh) * 2022-12-26 2023-05-02 首都医科大学 组织和细胞的保存液、细胞分离方法及其应用

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009219503A (ja) * 2009-07-07 2009-10-01 Cell Bank:Kk 組織由来細胞の凍結保存方法
CN104480533A (zh) * 2014-12-29 2015-04-01 黑龙江天晴干细胞股份有限公司 一种胎盘干细胞库的构建方法及胎盘组织复苏方法
CN105850980A (zh) * 2016-04-14 2016-08-17 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种角膜缘干细胞的冻存液及冻存方法
CN109090100A (zh) * 2018-08-27 2018-12-28 深圳市浊安认证生物技术有限公司 一种间充质干细胞冻存液及其制备方法与使用方法
CN110338189A (zh) * 2019-07-09 2019-10-18 浙江优牙生物科技有限公司 一种牙髓组织无血清冻存及复苏方法及冻存液
CN111602652A (zh) * 2020-07-03 2020-09-01 上海中溢精准医疗科技有限公司 一种脐带间充质干细胞冻存保护液
CN113287599A (zh) * 2021-04-30 2021-08-24 创芯国际生物科技(广州)有限公司 一种冻存液组合物、冻存液及类器官冻存方法
CN113558043A (zh) * 2021-08-07 2021-10-29 扈晖 一种肿瘤类器官专用冻存液
CN115247147A (zh) * 2021-12-17 2022-10-28 黑龙江诺亚康大干细胞技术有限责任公司 一种脐带间充质干细胞的培养及冻存方法
CN115299434A (zh) * 2022-08-09 2022-11-08 广州明迅生物科技有限责任公司 细胞冻存液、细胞冻存和复苏方法及其应用
CN116034987A (zh) * 2022-12-26 2023-05-02 首都医科大学 组织和细胞的保存液、细胞分离方法及其应用

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