CN110338189A - 一种牙髓组织无血清冻存及复苏方法及冻存液 - Google Patents

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贺捷
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Abstract

一种牙髓组织无血清冻存及复苏方法及冻存液，相较于现有的牙齿根尖部分切开的牙髓组织冻存方法复苏后组织块细胞爬出时间较短，爬出细胞状态较好，细胞传代后细胞呈涡旋状排列，排列相对紧密，边缘清晰透光性好，形态多为长梭形，效果接近于原代提取的牙髓干细胞。

Description

一种牙髓组织无血清冻存及复苏方法及冻存液
技术领域
本发明涉及干细胞培养技术领域，特别涉及一种牙髓组织无血清冻存及复苏方法及冻存液。
背景技术
牙髓位于牙髓腔内，是牙体组织中主要包含神经血管的疏松结缔组织，2000年，Gronthos等[Gronthos SM,Brabim J.Postnatal human dental pulp stem cells(DPSCs)in vitro and in vivo.Proc Natl Acad Sci U S A,2000,97(25):13625-13630.]通过对人牙髓细胞的研究，发现了一种与骨髓间充质干细胞有着极其相似的免疫表型及形成矿化结节能力的细胞，细胞形态呈梭形，可多向分化，有着较强的克隆能力，这些由牙髓组织中分离出的成纤维状细胞称为牙髓干细胞(Dental Pulp Stem Cells,DPSCs)。
目前采用冻存方式来保存组织和细胞，但冻存过程中使用的冻存液由于存在大量的胎牛血清虽然可以为细胞提供必要的营养物质，，但也因为其成分不明确而存在携带细菌、病毒、蛋白传染性疾病或朊病毒的风险而且还有可能引起免疫反应，来源生产批次差异可能会造成不一致的影响，容易对干细胞生物学特性产生干扰，且为后续干细胞制品的分离纯化造成一定的困难。
而在冻存方法上，专利(一种牙髓或牙髓干细胞的冻存液及其冻存，申请公布号CN105941390 A)采用牙齿根尖部分切开方式进行冻存，因此本专利对根尖部分切开冻存及牙髓组织冻存两种方式进行对比，结果表明牙髓组织冻存方式的组织块细胞爬出时间较短，爬出的细胞状态较好。
因此发明一种适合牙髓组织冻存、保持牙髓干细胞活性的无血清冻存液及冻存复苏方法尤为重要。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种牙髓组织无血清冻存及复苏方法及冻存液，使牙髓组织复苏后原代提取的牙髓干细胞依旧保持活力及生物学特性。
本发明采用的技术解决方案是：一种牙髓组织无血清冻存及复苏方法，包括以下步骤：
(1)提取牙髓：采集完整无损的人的牙齿，放入干净培养皿中加入浓度为75％的医用酒精，没过牙齿30s，吸去医用酒精，向培养皿中加入含双抗的PBS溶液，轻轻冲洗牙齿，重复3次，直至完全去除牙齿表面的医用酒精，液压钳压碎，取出牙髓；
(2)配制牙髓冻存液：所述的牙髓冻存液为由1.25％血清替代物、5％人血白蛋白、20％Cryosure DEX-4组成的无血清培养体系-基础培养基组成的冻存液；
(3)冻存牙髓：将牙髓放置在装有4℃预冷牙髓冻存液的冻存管中，使牙髓完全浸没于冻存液中，将冻存管放置在装有异丙醇的程序冻存盒中，随后将程序冻存盒放置于-80℃条件下过夜，然后液氮永久保存；
(4)牙髓复苏：取冻存的牙髓，快速放置37℃水浴中解冻后加入10倍量的无血清培养基以稀释冻存液，弃培养基，用含双抗的PBS清洗后在牙髓组织中加入消化液，将牙髓剪成0.5mm3的组织块，消化10min，加无血清培养基终止消化，离心，弃上清，加入原代培养基700μL，将组织块悬液平铺于T25培养瓶中，第2天补培养液，之后半量换培养液直至组织块贴壁，第7天观察细胞爬出情况。
所述的步骤(4)中消化液由浓度12mg/mL中性蛋白酶和浓度12mg/mLⅠ型胶原酶以及PBS组成，所述的中性蛋白酶：Ⅰ型胶原酶：PBS的体积比＝1:1:2。
所述的步骤(4)中第2天补培养液为1mL。
所述的步骤(2)中血清替代物包括生长因子、激素、蛋白质、维生素及还原类物质、促贴壁物质、酶抑制剂以及微量元素。
一种牙髓组织冻存液，所述的牙髓组织冻存液为由1.25％血清替代物、5％人血白蛋白、20％Cryosure DEX-4组成的无血清培养体系-基础培养基组成的冻存液，所述的血清替代物由生长因子、激素、蛋白质、维生素及还原类物质、促贴壁物质、酶抑制剂以及微量元素组成。
所述的生长因子由PDGF-AB、PDGF-BB、FGF、EGF、TGF-β1和bFGF组成。
所述的维生素及还原类物质由氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、核黄素、维生素B3、维生素B6、维生素B12、肌醇、甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸中的一种或几种组成。
所述的促贴壁物质由胶原蛋白和纤连蛋白组成，
所述的酶抑制剂为抗凝血酶Ⅲ，所述的微量元素由钠离子、磷离子、钙离子、镁离子、钾离子、氯化物、铁离子中的一种或几种组成，
所述的所述的其他物质由胆固醇、胆红素、葡萄糖、甘油三酯、肌酐、AST、CPK、γ-GT、CK、GGT、重碳酸盐中的一种或几种组成，。
所述的生长因子中添加浓度为PDGF-AB：21.45-60.49ng/mL、PDGF-BB：13.57-32.63ng/mL、FGF：3.76-14.5ng/mL、EGF：3-6.12ng/mL、TGF-β1：74.45-133.84ng/mL、bFGF：40.71-97.89ng/mL。生长因子是维持细胞体外培养生存、增殖和分化所必需的补充因子。
所述的激素中胰岛素的添加浓度为0.1-10μg/ml。激素如胰岛素、生长激素、胰高糖素等。几乎所有的细胞系都需要胰岛素，它是一种多肽，能与细胞上的胰岛素受体结合形成复合物，促进RNA、蛋白质和脂肪酸的合成，抑制细胞凋亡，是重要的细胞存活因子。
所述的蛋白质中添加浓度为球蛋白：1.8-2g/dL、白蛋白：3.0-3.6g/dL。蛋白质如转铁蛋白、球蛋白、白蛋白等能够运输维生素、脂类等营养物质，促进细胞新陈代谢以及保护细胞不受蛋白酶的损伤。
所述的维生素及还原类物质中添加浓度为氯化胆碱0.5-0.8mg/dL、D-泛酸钙1-3mg/dL、叶酸0.1-3mg/dL、烟酰胺0.2-0.3mg/dL、盐酸吡哆醇0.01-0.03mg/dL、核黄素0.1-0.5mg/dL、维生素B35-10mg/dL、维生素B6 0.1-1mg/dL、维生素B12 0.1-0.8mg/L、肌醇1-3mg/dL、甘氨酸2-4mg/dL、L-丙氨酸4-6mg/dL、L-精氨酸4-6mg/dL、L-天冬酰胺5-15mg/dL、L-天冬氨酸7-8mg/dL、L-半胱氨酸4-6mg/dL、L-谷氨酸3-5mg/dL、L-谷氨酰胺1-4mg/dL、L-组氨酸盐酸盐5-8mg/dL、L-异亮氨酸4-6mg/dL、L-亮氨酸4-6mg/dL、L-赖氨酸盐酸盐9-10mg/dL、L-蛋氨酸1-5mg/dL、L-苯丙氨酸2-5mg/dL、L-脯氨酸1-2mg/dL、L-丝氨酸2-3mg/dL、L-苏氨酸5-6mg/dL、L-色氨酸5-10mg/dL、L-酪氨酸3-4mg/dL和L-缬氨酸5-10mg/dL。
所述的促贴壁物质中添加浓度为胶原蛋白10-50μg/ml、纤连蛋白10-50μg/ml。促贴壁物质可促进细胞贴壁生长。
所述的酶抑制剂抗凝血酶Ⅲ添加浓度为0.01-1mg/mL。添加酶抑制剂的目的是终止消化时不需要额外使用酶抑制剂，只用培养基终止消化即可。
所述的其他物质中添加浓度为胆固醇：125-135mg/dL、胆红素：0.2-0.4mg/dL、葡萄糖：131-208mg/dL、甘油三酯：75-80mg/dL、肌酐：0.90-0.93mg/dL、AST：36-43U/L、CPK159U/L、γ-GT：26U/L、CK：170U/L、GGT：32U/L、重碳酸盐＜10mEq/L。
所述的微量元素中添加浓度为钠离子：140-157mmol/L、磷离子：3.9-4.6mg/dL、钙离子：44.6-61.5mg/dL、镁离子：2.1-2.2mg/dL、钾离子：4.4-5.0mEq/L、氯化物：109-122mEq/L、铁离子：64-65μg/dL。这些都是细胞组成所必需并参与细胞的代谢。培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡。此外，通过提供钠，钾和钙离子，帮助细胞调节细胞膜功能。
所述的牙髓冻存液的培养基为无血清培养体系-基础培养基。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种牙髓组织无血清冻存及复苏方法及冻存液，相较于现有的牙齿根尖部分切开的牙髓组织冻存方法复苏后组织块细胞爬出时间较短，爬出细胞状态较好，细胞传代后细胞呈涡旋状排列，排列相对紧密，边缘清晰透光性好，形态多为长梭形，效果接近于原代提取的牙髓干细胞。
附图说明
图1为本发明实施例1牙髓复苏后的实验组和对照组组织块及细胞爬出情况对比表。
图2为本发明实施例1细胞传代实验组和对照组P1、P2细胞形态对比表。
图3为本发明实施例1实验组和对照组的生长曲线图。
图4为本发明实施例1流式结果对比表。
图5为本发明实施例2原代提取牙髓干细胞中实验组和对照组的组织块及细胞爬出情况对比。
图6为本发明实施例2细胞传代实验组和对照组P1、P2细胞形态对比图。
图7为本发明实施例2实验组和对照组细胞的生长曲线。
图8为实施例2流式结果对比表。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明内容，用具体实施例说明如下，具体实施例不限定本发明内容范围。
实施例1
(一)牙髓冻存
实验分为实验组和对照组
1、实验组牙髓冻存
采集30岁以下完整无损的人的牙齿，放入干净培养皿中加入适量75％医用酒精，没过牙齿30s，吸去75％医用酒精，向培养皿中加入含双抗的PBS溶液，轻轻冲洗牙齿，重复3次，直至去除75％医用酒精，液压钳压碎，取出牙髓。配制牙髓冻存液：含1.25％血清替代物、5％人血白蛋白、20％Cryosure DEX-4的无血清培养体系-基础培养基组成的冻存液。将牙髓放置在装有4℃预冷牙髓冻存液的冻存管中，使牙齿完全浸没于冻存液中。将冻存管放置在程序冻存盒中(装有异丙醇)；随后放置-80℃冰箱过夜，液氮永久保存。
2、对照组牙髓冻存
采集30岁以下完整无损的人的牙齿，放入干净培养皿中加入适量75％医用酒精，没过牙齿30s，吸去75％医用酒精，向培养皿中加入含双抗的PBS溶液，轻轻冲洗牙齿，重复3次，直至去除75％医用酒精。配制牙髓冻存液：含1.25％血清替代物、5％人血白蛋白、20％Cryosure DEX-4的无血清培养体系-基础培养基组成的冻存液。用无菌钳将牙齿根尖部分切开；至少切开一个小口即可，将牙齿放置在装有4℃预冷牙髓冻存液的冻存管中，使牙齿完全浸没于冻存液中。将冻存管放置在程序冻存盒中(装有异丙醇)；随后放置-80℃冰箱过夜，液氮永久保存。
(二)牙髓复苏
1、实验组牙髓复苏
取实验组冻存的牙髓，快速放置37℃水浴中解冻后加入10倍量的无血清培养基以稀释冻存液，弃培养基，用含双抗的PBS清洗后在牙髓组织中加入消化液(浓度12mg/mL中性蛋白酶:浓度12mg/mLⅠ型胶原酶:PBS＝1:1:2)，用眼科剪将牙髓剪成0.5mm3的组织块，消化10min，加无血清培养基终止消化，离心，弃上清，将组织块悬液平铺于T25培养瓶中，第2天补液，之后半量换液直至组织块贴壁，第7天观察细胞爬出情况。
2、对照组牙髓复苏
取对照组冻存的牙齿，快速放置37℃水浴中解冻后加入10倍量的无血清培养基以稀释冻存液，弃培养基，用含双抗的PBS清洗后用液压钳压碎，取出牙髓，在牙髓组织中加入消化液(浓度12mg/mL中性蛋白酶:浓度12mg/mLⅠ型胶原酶:PBS＝1:1:2)，用眼科剪将牙髓剪成0.5mm3的组织块，消化10min，加无血清培养基终止消化，离心，弃上清，将组织块悬液平铺于T25培养瓶中，第2天补液，之后半量换液直至组织块贴壁，第7天观察细胞爬出情况。
实验组和对照组组织块爬出情况对比见图1中表1，表1可见实验组比对照组组织块细胞爬出时间较短，爬出细胞状态较好。
(三)细胞传代
当原代细胞融合率为80％左右时，弃培养液，加入PBS清洗，放置CO2培养箱中用1mL胰酶消化30s，镜下观察细胞由长梭形变成圆形时，轻轻拍打细胞面，加入无血清培养基终止消化，吹打，将细胞悬浮液转移至离心管中，1000r/min离心5min，弃上清，加入无血清培养基重悬，1:3或1:4传代。
实验组和对照组P1、P2细胞形态对比见图2中表2，由表2表明，实验组细胞呈涡旋状排列，排列相对紧密，边缘清晰透光性好，形态多为长梭形。对照组细胞边界模糊，细胞黏连严重，且局部出现空洞。
(四)CCK-8检测
取P2代细胞调整2000Cell/孔，加入CCK-8:培养基＝1:10混合液，37℃避光孵育1h，分别在1d、3d、5d、7d和9d测OD值，绘制增殖曲线。
实验组和对照组细胞的生长曲线见图3，由图3表明：实验组细胞比对照组细胞在9天内生长较迅速，整体生长较稳定。
(五)流式细胞术鉴定牙髓干细胞的表面标记物
将细胞消化成单细胞，1000r/min离心5min，去上清，加入2mL预冷Stain buffer重悬细胞，分两管(1管样品组，1管对照组)，300g离心5min，弃上清。样品组加入100μL预冷Stain buffer，流式抗体(CD105；CD73；CD34；CD45)5μL/TEST(1TESE 1×106)，混匀，4℃避光孵育30min后加入1mL预冷Stain buffer，300g离心5min，弃上清，重复3次，加入300μL预冷Stain buffer重悬样品组细胞，250目过滤，4℃避光保存，上机。空白组不加抗体直接加入300μL预冷Stain buffer，250目过滤。
流式结果见图4中表3，结果表明干细胞表面标记物CD105和CD73为阳性表达，而CD45和CD34为阴性表达，符合间充质干细胞表面标记物的鉴定标准，此细胞为间充质干细胞。
实施例2
(一)原代提取牙髓干细胞
实验分为实验组和对照组
1、实验组原代提取牙髓干细胞
取新鲜离体牙放入干净培养皿中加入适量75％医用酒精，没过牙齿30s，吸去75％医用酒精，向培养皿中加入含双抗的PBS轻轻冲洗牙齿，重复3次，直至去除75％医用酒精，液压钳压碎，取出牙髓。配制牙髓冻存液：含1.25％血清替代物、5％人血白蛋白、20％Cryosure DEX-4的无血清培养体系-基础培养基组成的冻存液。将牙髓放置在装有4℃预冷牙髓冻存液的冻存管中，使牙髓完全浸没于冻存液中。将冻存管放置在程序冻存盒中(装有异丙醇)；随后放置-80℃冰箱过夜，液氮永久保存。取冻存的牙髓，快速放置37℃水浴中解冻后加入10倍量的无血清培养基以稀释冻存液，弃培养基，用含双抗的PBS清洗，将牙髓放至1.5mL EP管中，加入200μL消化液(浓度12mg/mL中性蛋白酶:浓度12mg/mLⅠ型胶原酶:PBS＝1:1:2)，用眼科剪将牙髓剪成0.5mm3的组织块，再加消化液直至总体积为500μL，消化10min，加原代培养基500μL终止消化，离心，弃上清，加入原代培养基700μL，将组织块悬液平铺于T25培养瓶中，第2天补液1mL，之后半量换液直至组织块贴壁，第7天观察细胞爬出情况。
2、对照组原代提取牙髓干细胞
取新鲜离体牙放入干净培养皿中加入适量75％医用酒精，没过牙齿30s，吸去75％医用酒精，向培养皿中加入含双抗的PBS轻轻冲洗牙齿，重复3次，直至去除75％医用酒精，液压钳压碎，取出牙髓，用含双抗的PBS清洗。将牙髓放至1.5mL EP管中，加入200μL消化液(浓度12mg/mL中性蛋白酶:浓度12mg/mLⅠ型胶原酶:PBS＝1:1:2)，用眼科剪将牙髓剪成0.5mm3的组织块，再加消化液直至总体积为500μL，消化10min，加原代培养基500μL终止消化，离心，弃上清，加入原代培养基700μL，将组织块悬液平铺于T25培养瓶中，第2天补液1mL，之后半量换液直至组织块贴壁，第7天观察细胞爬出情况。原代提取牙髓干细胞中实验组和对照组的组织块及细胞爬出情况对比见图5中表4，结果表明实验组和对照组的组织块通透性良好，实验组细胞爬出时间比对照组快。
(二)细胞传代
当原代细胞融合率为80％左右时，弃培养液，加入PBS清洗，放置CO2培养箱中用1mL胰酶消化30s，镜下观察细胞由长梭形变成圆形时，轻轻拍打细胞面，加入无血清培养基终止消化，吹打，将细胞悬浮液转移至离心管中，1000r/min离心5min，弃上清，加入无血清培养基重悬，1:3或1:4传代。
实验组和对照组P1、P2细胞形态对比见图6中表5，结果表明实验组和对照组细胞都呈涡旋状排列，排列相对紧密，边缘清晰透光性好，形态多为长梭形。
(三)CCK-8检测
取P2代细胞调整2000Cell/孔，加入CCK-8:培养基＝1:10混合液，37℃避光孵育1h，分别在1d、3d、5d、7d和9d测OD值，绘制增殖曲线。
实验组和对照组细胞的生长曲线见图7，结果表明对照组1和2在9天内生长较实验组迅速。
(四)流式细胞术鉴定牙髓干细胞的表面标记物
将细胞消化成单细胞，1000r/min离心5min，去上清，加入2mL预冷Stain buffer重悬细胞，分两管(1管样品组，1管对照组)，300g离心5min，弃上清。样品组加入100μL预冷Stain buffer，流式抗体(CD105；CD73；CD34；CD45)5μL/TEST(1TESE 1×106)，混匀，4℃避光孵育30min后加入1mL预冷Stain buffer，300g离心5min，弃上清，重复3次，加入300μL预冷Stain buffer重悬样品组细胞，250目过滤，4℃避光保存，上机。空白组不加抗体直接加入300μL预冷Stain buffer，250目过滤。
流式结果见图8中表6，结果表明干细胞表面标记物CD105和CD73为阳性表达，而CD45和CD34为阴性表达，符合间充质干细胞表面标记物的鉴定标准，此细胞为间充质干细胞。
各位技术人员须知：虽然本发明已按照上述具体实施方式做了描述，但是本发明的发明思想并不仅限于此发明，任何运用本发明思想的改装，都将纳入本专利专利权保护范围内。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种牙髓组织无血清冻存及复苏方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取牙髓：采集完整无损的人的牙齿，放入干净培养皿中加入浓度为75％的医用酒精，没过牙齿30s，吸去医用酒精，向培养皿中加入含双抗的PBS溶液，轻轻冲洗牙齿，重复3次，直至完全去除牙齿表面的医用酒精，液压钳压碎，取出牙髓；
(2)配制牙髓冻存液：所述的牙髓冻存液为由1.25％血清替代物、5％人血白蛋白、20％Cryosure DEX-4组成的无血清培养体系-基础培养基组成的冻存液；
(3)冻存牙髓：将牙髓放置在装有4℃预冷牙髓冻存液的冻存管中，使牙髓完全浸没于冻存液中，将冻存管放置在装有异丙醇的程序冻存盒中，随后将程序冻存盒放置于-80℃条件下过夜，然后液氮永久保存；
(4)牙髓复苏：取冻存的牙髓，快速放置37℃水浴中解冻后加入10倍量的无血清培养基以稀释冻存液，弃培养基，用含双抗的PBS清洗后在牙髓组织中加入消化液，将牙髓剪成0.5mm3的组织块，消化10min，加无血清培养基终止消化，离心，弃上清，加入原代培养基700μL，将组织块悬液平铺于T25培养瓶中，第2天补培养液，之后半量换培养液直至组织块贴壁，第7天观察细胞爬出情况。
2.根据权利要求1所述的一种牙髓组织无血清冻存及复苏方法，其特征在于，所述的步骤(4)中消化液由浓度12mg/mL中性蛋白酶和浓度12mg/mL Ⅰ型胶原酶以及PBS组成，所述的中性蛋白酶：Ⅰ型胶原酶：PBS的体积比＝1:1:2。
3.根据权利要求1所述的一种牙髓组织无血清冻存及复苏方法，其特征在于，所述的步骤(4)中第2天补培养液为1mL。
4.根据权利要求1所述的一种牙髓组织无血清冻存及复苏方法，其特征在于，所述的步骤(2)中血清替代物包括生长因子、激素、蛋白质、维生素及还原类物质、促贴壁物质、酶抑制剂以及微量元素。
5.一种牙髓组织冻存液，其特征在于，所述的牙髓组织冻存液为由1.25％血清替代物、5％人血白蛋白、20％Cryosure DEX-4组成的无血清培养体系-基础培养基组成的冻存液，所述的血清替代物由生长因子、激素、蛋白质、维生素及还原类物质、促贴壁物质、酶抑制剂以及微量元素组成。
6.根据权利要求5所述的一种牙髓组织冻存液，其特征在于，所述的生长因子由PDGF-AB、PDGF-BB、FGF、EGF、TGF-β1和bFGF组成。
7.根据权利要求5所述的一种牙髓组织冻存液，其特征在于，所述的维生素及还原类物质由氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、核黄素、维生素B3、维生素B6、维生素B12、肌醇、甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸中的一种或几种组成。
8.根据权利要求5所述的一种牙髓组织冻存液，其特征在于，所述的促贴壁物质由胶原蛋白和纤连蛋白组成。
9.根据权利要求5所述的一种牙髓组织冻存液，其特征在于，所述的酶抑制剂为抗凝血酶Ⅲ，所述的微量元素由钠离子、磷离子、钙离子、镁离子、钾离子、氯化物、铁离子中的一种或几种组成。
10.根据权利要求5所述的一种牙髓组织冻存液，其特征在于，所述的所述的其他物质由胆固醇、胆红素、葡萄糖、甘油三酯、肌酐、AST、CPK、γ-GT、CK、GGT、重碳酸盐中的一种或几种组成。
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