CN109161520A - 间充质干细胞的分离培养方法及相应的保存方法和无血清培养基 - Google Patents

间充质干细胞的分离培养方法及相应的保存方法和无血清培养基 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种间充质干细胞的分离培养方法及相应的保存方法和无血清培养基。该间充质干细胞的分离培养方法及相应的保存方法，通过使用I型胶原酶和DNase I处理间充质干细胞组织，然后分离得到干细胞的单细胞悬液和未完全消化的组织块，分别接种，使用无血清干细胞培养基进行大规模干细胞的扩大培养，扩增结束后使用干细胞冻存保护剂进行液氮冻存。与传统方法相比，上述间充质干细胞的分离培养方法及相应的保存方法对整个干细胞组织的利用率更高，且细胞活力更高；使用无血清培养方法可以有效降低血清对干细胞后续应用的影响；使用高效的冻存保护剂，价格便宜，细胞活率高，可现配现用，简单可行。

Description

间充质干细胞的分离培养方法及相应的保存方法和无血清培 养基
技术领域
本发明涉及细胞工程技术领域，尤其是涉及一种间充质干细胞的分离培养方法及相应的保存方法和无血清培养基。
背景技术
间充质干细胞来源于多种组织(如骨髓组织、脐带组织、胎盘组织和脂肪组织等)，是一类具有自我复制和多向分化能力的细胞。间充质干细胞可以不断地自我更新，并在特定条件下转变成为一种或多种构成人体组织或器官的细胞。间充质干细胞临床应用于解决多种血液系统疾病，如在心血管疾病、肝硬化、神经系统疾病、膝关节半月板部分切除损伤修复，自身免疫性疾病等方面取得了重大突破，挽救了更多病患的生命。此外，间充质干细胞在神经系统修复及更多方面也具有长远的发展前景。
现阶段的间充质干细胞主要来源于骨髓、脐带和胎盘。相对于骨髓间充质干细胞，脐带和胎盘来源的间充质干细胞更原始，有更强的增殖分化能力；而且脐带和胎盘来源的干细胞纯度高，无肿瘤细胞污染，扩增时培养体系能统一，便于质控；此外，获取方便，易于保存和运输，伦理学争议少。胎盘和脐带来源的间充质干细胞有可能成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，并具有更大的应用潜能。
然而现在我国脐带或胎盘等间充质干细胞普遍存在实验室小规模制备、扩增效果不高、细胞活力较低的问题。间充质干细胞的分离培养方法一般都是组织剪碎后直接贴壁培养的方法，或者是胰酶消化后接种培养的方法。这两种方法细胞的得率都较低，而且胰酶消化会影响细胞的活力。现在间充质干细胞一般传代扩增时用的都是含血清的培养基，血清残留会影响后续间充质干细胞的临床应用。另外，由于间充质干细胞临床应用所需的细胞数量较大，临床应用常需要达到108～1010数量级，这种规模的细胞数量在实验室中常规使用培养瓶扩增，耗材消耗量大，人力成本也很高。国外也有机构使用生物反应器进行干细胞大规模扩增，但是通常生物反应器用于悬浮细胞的大规模扩增，而且是开放式系统，需要很多支持设备，不但操作复杂，还容易导致污染等问题，临床应用也存在相当大的风险。
发明内容
基于此，有必要提供一种间充质干细胞的分离培养方法及相应的保存方法和无血清培养基，以解决传统的间充质干细胞分离培养过程中存在规模小、操作复杂的问题。
本发明解决所述技术问题的技术方案如下。
一种间充质干细胞的分离培养方法，包括如下步骤：
向间充质干细胞组织中加入I型胶原酶溶液和DNase I溶液；
将所述间充质干细胞组织切碎，过滤分离，分别收集干细胞消化液和未完全消化的组织块；
洗涤所述干细胞消化液并离心，收集干细胞的单细胞沉淀；
分别将所述干细胞的单细胞沉淀和未完全消化的组织块接种于无血清培养基中进行扩大培养。
在其中一个实施例中，所述I型胶原酶溶液是用DPBS缓冲液配制的I型胶原酶终浓度为0.10PZU/ml～0.15PZU/ml的溶液。
在其中一个实施例中，所述DNase I溶液的中DNase I的浓度是18000U/ml～23000U/ml。
在其中一个实施例中，所述无血清培养基是在无血清基础培养基中添加终浓度为4.5wt％～5.5wt％的血清替代物、终浓度为45μg/ml～55μg/ml的维生素C、终浓度为15ng/ml～25ng/ml的干细胞生长因子、终浓度为15ng/ml～25ng/ml的人血小板源生长因子、终浓度为1.5mmol/ml～2.5mmol/ml的L-谷氨酰胺、终浓度为90ng/ml～110ng/ml的人转化生长因子TGF-β1、终浓度为15ng/ml～25ng/ml的人表皮生长因子和终浓度为15ng/ml～25ng/ml的人纤维细胞生长因子。
在其中一个实施例中，所述无血清基础培养基是UltraCULTURE无血清培养基，所述血清替代物是UltraGROTM血清替代物。
在其中一个实施例中，所述分别将所述干细胞的单细胞沉淀和未完全消化的组织块接种于无血清培养基中进行扩大培养包括：
分别将所述干细胞的单细胞沉淀和未完全消化的组织块接种于添加有无血清培养基的容器中进行原代培养；
待原代培养的容器中细胞融合度达到75％～85％时，使用无胰酶的消化液消化细胞，离心去上清后，接种于多层细胞培养器中进行传代扩大培养。
在其中一个实施例中，在原代培养时，所述干细胞的单细胞沉淀是按照(4.5～5.5)×103个细胞/cm2的接种密度接种，所述未完全消化的组织块是按照每75cm2的接种培养面积添加0.15～0.25g组织块的接种密度接种；
在所述多层细胞培养器中进行扩大培养时，是将原代培养细胞按照(4.5～5.5)×103个细胞/cm2的接种密度接种。
一种间充质干细胞的保存方法，包括如下步骤：向上述任一实施例所述的间充质干细胞的分离培养方法分离培养得到的间充质干细胞的传代培养细胞中添加冻存保护剂，进行液氮冷冻存储；
所述冻存保护剂含有如下体积份数的各组分：10～12份的DMSO、0.5～1.5份的右旋糖酐-40、7～9份的注射用水、30～40份的无血清基础培养基、40～50份的白蛋白含量为20wt％的人血白蛋白注射液。
在其中一个实施例中，所述传代培养细胞是第5代的传代培养细胞。
一种无血清培养基，所述无血清培养基是在无血清基础培养基中添加终浓度为4.5wt％～5.5wt％的血清替代物、终浓度为45μg/ml～55μg/ml的维生素C、终浓度为15ng/ml～25ng/ml的干细胞生长因子、终浓度为15ng/ml～25ng/ml的人血小板源生长因子、终浓度为1.5mmol/ml～2.5mmol/ml的L-谷氨酰胺、终浓度为90ng/ml～110ng/ml的人转化生长因子TGF-β1、终浓度为15ng/ml～25ng/ml的人表皮生长因子和终浓度为15ng/ml～25ng/ml的人纤维细胞生长因子。
上述间充质干细胞的分离培养方法及相应的保存方法，通过使用I型胶原酶和DNase I处理间充质干细胞组织，然后分离得到干细胞的单细胞悬液和未完全消化的组织块，分别接种，使用无血清干细胞培养基进行大规模干细胞的扩大培养，扩增结束后使用干细胞冻存保护剂进行液氮冻存。该间充质干细胞的分离培养方法及相应的保存方法操作简单，充分利用获取的间充质干细胞组织，操作过程安全有效。
与传统方法相比，上述间充质干细胞的分离培养方法及相应的保存方法对整个干细胞组织的利用率更高；用胶原酶或胰酶替代物来代替胰酶消化，使得细胞活力更高；使用无血清培养方法可以有效降低血清对干细胞后续应用的影响，安全、活率高、得率高、扩增速率快，简便可行；后续可以配合使用细胞工厂进行大规模培养，所得的间充质干细胞数量更多；使用高效的冻存保护剂，价格便宜，细胞活率高，可现配现用，简单可行。
附图说明
图1为常规的胰酶消化法或组织块贴壁法与使用实施例1方法所得的干细胞数量的比较结果。
图2为胰酶替代物Tryple消化的干细胞活率与胰酶消化的干细胞活率的比较结果。
图3为使用实施例2的干细胞无血清培养基进行干细胞扩增，干细胞扩增效率与其他培养基的比较结果。
图4为使用实施例3的干细胞冻存保护剂，冻存的干细胞活率与其他冻存液的比较结果。
图5a和图5b分别为实施例3中干细胞单细胞悬液扩增所得的P5代细胞与干细胞组织块扩增所得的P5’代细胞，经流式细胞仪所测的细胞表型比较。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本发明提供了一种间充质干细胞的分离培养方法，其包括如下四个步骤。
步骤一：向间充质干细胞组织中加入I型胶原酶溶液和DNase I溶液。
在一个具体的示例中，I型胶原酶溶液是用DPBS缓冲液配制的I型胶原酶终浓度为0.10PZU/ml～0.15PZU/ml的溶液，优选的，I型胶原酶终浓度为0.12PZU/ml。DNase I溶液的中DNase I的浓度是18000U/ml～23000U/ml，优选是20000U/ml。
对于新生儿脐带或胎盘组织，首先将其放入含有保养液的密闭容器中保养。保养液的配方可以是但不限于含有青链霉素混合液(双抗溶液)的无血清培养基，如可以是在UltraCULTURE无血清基础培养基中添加体积终浓度为2％的青链霉素混合液得到的无血清培养基。组织获取并保养后，尽量保证24小时内运送到相应的实验或生产车间，运送过程尽量4℃冷链运输，避免接触空气。运送到实验或生产车间后，去血样样本进行外源病毒检测，如检测乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病毒、梅毒病毒、巨细胞病毒等。对于符合标准的组织，可以用氯化钠注射液充分洗去残留的血液等，去掉血管，分离出所需的间充质干细胞组织，比如脐带的华通氏胶、胎盘的羊膜等组织。
组织获取后，可以将所有组织剪成5mm×5mm大小的组织块，以备后续切碎用。
步骤二：将间充质干细胞组织切碎，过滤分离，分别收集干细胞消化液和未完全消化的组织块。
将间充质干细胞组织块切碎可以使用但不限于gentleMACS组织处理器进行组织切碎处理，如在一个具体的示例中，可以将组织块转移到gentleMACS组织处理器的C管中，然后加入上述胶原酶溶液和DNase I溶液，拧紧盖子，倒置在处理器上；开机后运行程序E 1分钟，然后取出C管，37℃孵育4小时；再将C管继续放置在处理器上，运行程序m-spleen-03。
过滤分离可以使用但不限于双向收集的抽滤过滤器(专利号ZL201720070320.3)进行过滤分离，如取出gentleMACS组织处理器的C管后，将里面的所有混合物倒入双向收集的抽滤过滤器的上部管口，该过滤器下管口预先连接于一50ml离心管；打开吸泵，将粘稠的干细胞消化液泵入离心管中；然后将吸泵分开，下管口的离心管分离开，上管口连接上一新的50ml离心管，倒置过滤器，用DPBS溶液将滤膜上的未消化的组织块冲洗入连接的50ml管中；离心去上清后，得到未完全消化的组织块。
步骤三：洗涤干细胞消化液并离心，收集干细胞的单细胞沉淀。
可以使用但不限于DPBS溶液洗涤粘稠的干细胞消化液和离心两次，得到干细胞的单细胞沉淀。
步骤四：分别将干细胞的单细胞沉淀和未完全消化的组织块接种于无血清培养基中进行扩大培养。
为有效降低血清对干细胞后续应用的影响，在扩大培养时，优选使用无血清培养基进行培养。
进一步，本发明还提供了一种无血清培养基，其是在无血清基础培养基中添加终浓度为4.5wt％～5.5wt％的血清替代物、终浓度为45μg/ml～55μg/ml的维生素C、终浓度为15ng/ml～25ng/ml的干细胞生长因子、终浓度为15ng/ml～25ng/ml的人血小板源生长因子、终浓度为1.5mmol/ml～2.5mmol/ml的L-谷氨酰胺、终浓度为90ng/ml～110ng/ml的人转化生长因子TGF-β1、终浓度为15ng/ml～25ng/ml的人表皮生长因子和终浓度为15ng/ml～25ng/ml的人纤维细胞生长因子。
优选的，上述无血清培养基是在无血清基础培养基中添加终浓度为4.8wt％～5.2wt％的血清替代物、终浓度为48μg/ml～52μg/ml的维生素C、终浓度为18ng/ml～22ng/ml的干细胞生长因子、终浓度为18ng/ml～22ng/ml的人血小板源生长因子、终浓度为1.8mmol/ml～2.2mmol/ml的L-谷氨酰胺、终浓度为95ng/ml～105ng/ml的人转化生长因子TGF-β1、终浓度为18ng/ml～22ng/ml的人表皮生长因子和终浓度为18ng/ml～22ng/ml的人纤维细胞生长因子。
进一步优选的，上述无血清培养基是在无血清基础培养基中添加终浓度为5.0wt％的血清替代物、终浓度为50μg/ml的维生素C、终浓度为20ng/ml的干细胞生长因子、终浓度为20ng/ml的人血小板源生长因子、终浓度为2.0mmol/ml的L-谷氨酰胺、终浓度为100ng/ml的人转化生长因子TGF-β1、终浓度为20ng/ml的人表皮生长因子和终浓度为20ng/ml的人纤维细胞生长因子。
优选的，所述无血清基础培养基是UltraCULTURE无血清培养基，血清替代物是UltraGROTM血清替代物。
在一个具体的示例中，分别将干细胞的单细胞沉淀和未完全消化的组织块接种于无血清培养基中进行扩大培养包括：
分别将干细胞的单细胞沉淀和未完全消化的组织块接种于添加有无血清培养基的容器中进行原代培养；
待原代培养的容器中细胞融合度达到75％～85％时，使用无胰酶的消化液消化细胞，离心去上清后，接种于多层细胞培养器中进行传代扩大培养。
其中，在原代培养时，干细胞的单细胞沉淀是按照(4.5～5.5)×103个细胞/cm2，优选5.0×103个细胞/cm2的接种密度接种，未完全消化的组织块是按照每75cm2的接种培养面积(如T75培养瓶)添加0.15～0.25g，优选0.20g的组织块的接种密度接种；在多层细胞培养器中进行扩大培养时，是将原代培养细胞按照(4.5～5.5)×103个细胞/cm2，优选5.0×103个细胞/cm2的接种密度接种。
无胰酶的消化液可以是但不限于胰酶替代物Tryple消化液。
本发明进一步还提供了一种间充质干细胞的保存方法，其包括如下步骤：向上述间充质干细胞的分离培养方法分离培养得到的间充质干细胞的传代培养细胞中添加冻存保护剂，进行液氮冷冻存储。
冻存保护剂含有如下体积份数的各组分：10～12份的DMSO、0.5～1.5份的右旋糖酐-40、7～9份的注射用水、30～40份的无血清基础培养基、40～50份的白蛋白含量为20wt％的人血白蛋白注射液。优选的，冻存保护剂含有如下体积份数的各组分：11份的DMSO、1份的右旋糖酐-40、8份的注射用水、35份的无血清基础培养基、45份的白蛋白含量为20wt％的人血白蛋白注射液。
上述间充质干细胞的保存方法优选是将上述间充质干细胞的分离培养方法中传代扩大培养的第5代传代培养细胞进行保存。在保存之前，先对干细胞进行质量评估，包括细胞数量、表型、活率、核型、诱导分化等鉴定。
上述干细胞冻存保护剂优选要求现用现配。冻存时可以使用但不限于1.8ml低温冷冻麦管，使用麦管封口机进行封口，可以有效避免液氮进入冷冻管，管内压力升高导致爆炸或者样品泄露导致生物污染等。
上述间充质干细胞的分离培养方法及相应的保存方法操作简单，充分利用获取的间充质干细胞组织，操作过程安全有效。与现有方法相比，上述间充质干细胞的分离培养方法及相应的保存方法可以短时间内获得更多的大量的高纯度间充质干细胞，并且保持间充质干细胞良好的生物学特性，具体地，该间充质干细胞的分离培养方法及相应的保存方法对整个干细胞组织的利用率更高；用胶原酶或胰酶替代物来代替胰酶消化，使得细胞活力更高；后续可以配合使用细胞工厂进行大规模培养，所得的间充质干细胞数量更多；使用高效的冻存保护剂，价格便宜，细胞活率高，可现配现用，简单可行。
以下结合具体实施例对本发明的间充质干细胞的分离方法和相应的保存方法进行进一步详细的说明。
实施例1脐带间充质干细胞的分离
收集脐血样本，将脐带放入含保养液的密闭容器中，保养液配方是：UltraCULTURE无血清基础培养基中添加体积终浓度为2％的青链霉素混合液(双抗溶液)。保证24小时内将组织运送到生产车间，运送过程尽量4℃冷链运输，避免接触空气。运送到生产车间的组织，取脐血样本进行外源病毒检测，检测是否有乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病毒、梅毒病毒、巨细胞病毒等。
对满足要求的样本，从保养液中取出脐带，无菌镊子转移脐带至10cm无菌培养皿中，加入5～10ml氯化钠注射液冲洗，重复2～3次，去除血渍。无菌手术剪将脐带剪成约2～3cm数段，加入5～10ml氯化钠注射液洗涤血凝块，重复洗涤直至基本去除血渍、洗涤液较清澈。按血管螺旋走式剔除脐带的两条动脉，一条静脉。位于羊膜与血管之间的白色结缔组织即为华通氏胶，用长柄锯齿镊将其撕下，放入无菌平皿中，加入5～10ml氯化钠注射液，洗涤胶体。
将所有华通氏胶组织剪成5×5mm大小的组织块，转移到gentleMACS组织处理器的C管中，然后加入5ml I型胶原酶溶液(用DPBS溶液配制，终浓度0.12PZU/ml)和25μl20000U/ml的DNase I溶液。拧紧盖子，倒置在处理器上。开机，运行程序E 1分钟，然后取出C管，37℃孵育4小时。然后将C管继续放置在处理器上，运行程序m-spleen-03。
取出C管，将里面的所有混合物倒入双向收集的抽滤过滤器(专利号ZL201720070320.3)上部管口，该过滤器下管口预先连接于一50ml离心管。打开吸泵，将粘稠的干细胞消化液泵入离心管中。然后将吸泵分开，下管口的离心管分离开，上管口连接上一新的50ml离心管，倒置过滤器，用DPBS溶液将滤膜上的未消化的组织块冲洗入连接的50ml管中。离心去上清后，得到未完全消化的组织块。将干细胞消化液用DPBS溶液洗涤和离心两次，得到干细胞的单细胞沉淀。
实施例2脐带间充质干细胞的大规模扩增
将干细胞的单细胞沉淀用上述无血清培养基重悬后，按照5.0×103个细胞/cm2的密度接种在T75或T175培养瓶中。未消化完全的干细胞组织块按照每T75培养瓶0.2g左右的密度，加入10ml的上述无血清培养基接种。为区分干细胞的单细胞悬液制备的间充质干细胞，将其原代细胞命名为P0代。干细胞组织块制备的间充质原代干细胞命名为P0’代。
P0代细胞生长到5天左右时，待培养瓶中的细胞融合度达到80％左右时，使用胰酶替代物Tryple消化液进行细胞消化，离心去上清后，按照约5.0×103个细胞/cm2的密度接种在T175培养瓶中进行扩大培养，此时细胞记为P1细胞。
P0’代细胞在贴壁14天左右时，细胞克隆团的细胞融合度到达80％时，轻轻拍打培养瓶，使组织块脱离贴壁状态漂浮在培养基中；去除漂浮的组织块和培养基，使用DPBS溶液洗涤2次，然后使用胰酶替代物Tryple消化液进行细胞消化，离心去上清后，按照约5.0×103个细胞/cm2的密度接种在T175培养瓶中进行扩大培养，此时细胞记为P1’细胞。
待P1和P1’细胞生长约5天后，按照同样方法进行细胞消化，同样的细胞密度接种在CellSTACK多层细胞培养器中。当细胞培养到5天左右时，通过配套的光学显微镜观察细胞融合度，当细胞融合度达到80％左右时，按照上述方法进行消化和传代。
间充质干细胞最多可以传代到第5代，此时细胞记为P5和P5’细胞。
实施例3脐带间充质干细胞的冻存
待P5和P5’细胞融合度达到80％左右时，使用胰酶替代物Tryple消化液进行细胞消化，离心去上清后，使用DPBS溶液洗涤2次，留样进行干细胞表型、活率、细胞计数、无菌、内毒素和支原体等检测。
现场配置干细胞冻存保护剂，冻存保护剂的配方是11％DMSO、1％右旋糖酐-40、8％注射用水、35％UltraCULTURE无血清培养基和45％的人血白蛋白注射液，其中人血白蛋白注射液是20％含量的商品化原液，各百分比数据为体积百分比。
向细胞沉淀中加入少量干细胞冻存保护剂，轻轻吹打混匀，然后调整细胞密度与要求一致。一般干细胞冻存的密度为1×107细胞/ml。
将细胞悬液分装于低温冻存麦管内，每管1ml，用麦管封口机将麦管进行封口，避免样品泄露或液氮进入管内导致冻存管爆炸。
使用程序降温仪进行程序降温，并将干细胞样品转移到液氮罐中进行冻存。
图1所示的是不同脐带组织处理方法得到的脐带间充质干细胞的数量比较。由图1可以看出，在传代第5代时，实施例1方法(Group 1)处理脐带，每条脐带(20cm长度)可以得到间充质干细胞8×1010个；而使用胰酶等消化处理方法(Group 2)，每条脐带(20cm长度)可以得到间充质干细胞2×1010个；使用组织块贴壁培养法(Group 3)，每条脐带(20cm长度)可以得到间充质干细胞2.5×1010个，说明实施例1方法所得脐带间充质干细胞数量要远大于胰酶等酶消化法或组织块贴壁培养法。
图2所示的是胰酶替代物Tryple消化的干细胞活率与胰酶消化的干细胞活率比较。由图2可以看出，胰酶替代物Tryple消化干细胞所得的细胞活率比胰酶消化的干细胞活率要高，细胞状态更好。
图3所示的是使用实施例2方法的干细胞无血清培养基进行干细胞扩增，干细胞扩增效率与其他培养基比较。Medium 1是实施例2使用的无血清培养基，Medium2指UltraCULTURE培养基+10％FBS培养体系，Medium3指UltraCULTURE培养基+5％UltraGROTM血清替代物培养体系，Medium4指完全使用UltraCULTURE培养基，不添加任何成分。由图3可以看出，实施例2的培养体系细胞扩增速率要高于添加FBS血清，以及血清替代物的扩增速率，远远高于未添加任何其他成分的无血清培养体系。
图4所示的是实施例3的干细胞冻存保护剂，冻存的干细胞活率与其他冻存液比较。Cryo1是实施例3方法使用的干细胞冻存保护剂，Cryo2是商品化的CryoStor CS10冻存液，Cryo3是商品化的CELLBANKER 2细胞冻存液，Cryo4是常用的90％FBS+10％DMSO冻存液。由图4可以看出，在细胞冻存6个月和12个月后，分别复苏细胞计算活率，实施例3方法的细胞活率高于商品化的两个冻存液(而且成本要低得多)，且远高于常用的90％FBS+10％DMSO冻存液。
请结合下表1、图5a和图5b，使用上述干细胞单细胞悬液扩增所得的P5代细胞与干细胞组织块扩增所得的P5’代细胞，经流式细胞仪所测的细胞表型比较，可以看出，P5代细胞和P5’代细胞的表型基本相同，都满足间充质干细胞的标准。
表1
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
向间充质干细胞组织中加入I型胶原酶溶液和DNase I溶液；
将所述间充质干细胞组织切碎，过滤分离，分别收集干细胞消化液和未完全消化的组织块；
洗涤所述干细胞消化液并离心，收集干细胞的单细胞沉淀；
分别将所述干细胞的单细胞沉淀和未完全消化的组织块接种于无血清培养基中进行扩大培养。
2.如权利要求1所述的间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述I型胶原酶溶液是用DPBS缓冲液配制的I型胶原酶终浓度为0.10PZU/ml～0.15PZU/ml的溶液。
3.如权利要求1所述的间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述DNase I溶液的中DNase I的浓度是18000U/ml～23000U/ml。
4.如权利要求1所述的间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述无血清培养基是在无血清基础培养基中添加终浓度为4.5wt％～5.5wt％的血清替代物、终浓度为45μg/ml～55μg/ml的维生素C、终浓度为15ng/ml～25ng/ml的干细胞生长因子、终浓度为15ng/ml～25ng/ml的人血小板源生长因子、终浓度为1.5mmol/ml～2.5mmol/ml的L-谷氨酰胺、终浓度为90ng/ml～110ng/ml的人转化生长因子TGF-β1、终浓度为15ng/ml～25ng/ml的人表皮生长因子和终浓度为15ng/ml～25ng/ml的人纤维细胞生长因子。
5.如权利要求4所述的间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述无血清基础培养基是UltraCULTURE无血清培养基，所述血清替代物是UltraGROTM血清替代物。
6.如权利要求1～5中任一项所述的间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，所述分别将所述干细胞的单细胞沉淀和未完全消化的组织块接种于无血清培养基中进行扩大培养包括：
分别将所述干细胞的单细胞沉淀和未完全消化的组织块接种于添加有无血清培养基的容器中进行原代培养；
待原代培养的容器中细胞融合度达到75％～85％时，使用无胰酶的消化液消化细胞，离心去上清后，接种于多层细胞培养器中进行传代扩大培养。
7.如权利要求6所述的间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，在原代培养时，所述干细胞的单细胞沉淀是按照(4.5～5.5)×103个细胞/cm2的接种密度接种，所述未完全消化的组织块是按照每75cm2的接种培养面积添加0.15～0.25g组织块的接种密度接种；
在所述多层细胞培养器中进行扩大培养时，是将原代培养细胞按照(4.5～5.5)×103个细胞/cm2的接种密度接种。
8.一种间充质干细胞的保存方法，其特征在于，包括如下步骤：向如权利要求1～7中任一项所述的间充质干细胞的分离培养方法分离培养得到的间充质干细胞的传代培养细胞中添加冻存保护剂，进行液氮冷冻存储；
所述冻存保护剂含有如下体积份数的各组分：10～12份的DMSO、0.5～1.5份的右旋糖酐-40、7～9份的注射用水、30～40份的无血清基础培养基、40～50份的白蛋白含量为20wt％的人血白蛋白注射液。
9.如权利要求8所述的间充质干细胞的保存方法，其特征在于，所述传代培养细胞是第5代的传代培养细胞。
10.一种无血清培养基，其特征在于，所述无血清培养基是在无血清基础培养基中添加终浓度为4.5wt％～5.5wt％的血清替代物、终浓度为45μg/ml～55μg/ml的维生素C、终浓度为15ng/ml～25ng/ml的干细胞生长因子、终浓度为15ng/ml～25ng/ml的人血小板源生长因子、终浓度为1.5mmol/ml～2.5mmol/ml的L-谷氨酰胺、终浓度为90ng/ml～110ng/ml的人转化生长因子TGF-β1、终浓度为15ng/ml～25ng/ml的人表皮生长因子和终浓度为15ng/ml～25ng/ml的人纤维细胞生长因子。
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