CN102106342B

CN102106342B - 一种间充质干细胞的保存方法和培养方法

Info

Publication number: CN102106342B
Application number: CN 200910260704
Authority: CN
Inventors: 李栋; 侯怀水; 肖琼; 范奉群; 刘�东
Original assignee: SHANDONG QILU STEM CELL ENGINEERING Co Ltd
Current assignee: SHANDONG QILU STEM CELL ENGINEERING Co Ltd
Priority date: 2009-12-29
Filing date: 2009-12-29
Publication date: 2013-08-28
Anticipated expiration: 2029-12-29
Also published as: CN102106342A

Abstract

本发明提供一种间充质干细胞的保存方法和培养方法，该保存方法包括将脐带组织切割成块，置于体积比为1∶3的冻存液与基础液的混合溶液中预处理；将脐带组织块转移至体积比为1∶1的冻存液与基础液的混合溶液中，0℃下处理；将脐带组织块转移至的冻存液中，0℃下处理；将脐带组织块在液氮中冻存。培养方法是以保存的脐带组织块进行培养的。这样在婴儿分娩后不需立即对脐带进行昂贵的细胞培养操作，可以直接在深低温中冻存脐带组织而不影响细胞活力。可随时取出1个冻存管复苏并成功培养扩增出MSCs，避免了对每份脐带均进行培养操作，极大地降低了脐带MSCs储存库的运营成本。

Description

一种间充质干细胞的保存方法和培养方法

技术领域

本发明属于细胞生物学和低温医学技术领域，具体涉及一种间充质干细胞的保存方法和培养方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)在发育生物学研究和临床治疗，如组织和器官修复等方面具有广阔的应用前景(Blood，102，3483-3493，2003)。MSCs最先在骨髓中确认其存在，随后在成人外周血、骨膜、肌肉和脂肪组织等均发现有MSCs存在。MSCs属于多能干细胞，在相应的诱导条件下能分化为骨、脂肪、软骨、肌肉和肝细胞等不同类型的细胞(Science，284，143-147，1999)。脐带是来源丰富的正常分娩废弃物，其含有丰富的MSCs。最近已有多篇有关从脐带中分离MSCs的报道(StemCells，22，1330-1337，2004；Stem Cells，25，1384-1392，2007)。脐带间充质干细胞(Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells，UC-MSCs)具有多向分化能力和免疫抑制调节能力，在再生医学和细胞治疗方面具有广泛的用途(Stem Cells，25，2017-2024，2007)。如在出生时就储存自己的脐带间充质干细胞，则在日后的应用中就不存在免疫排斥的难题。

现有储存自体UC-MSCs的方法为采集新鲜的脐带后，立即消化培养MSCs，扩增获得一定数量的细胞后进行冻存。这个扩增培养过程需要15到30天，且消耗大量的昂贵培养液和人力。如果日后没有应用，还造成浪费。

发明内容

本发明的目的是提供一种脐带间充质干细胞的保存方法，以克服现有技术中储存脐带间充质干细胞之前必需进行扩增的限制。

用于实现本发明的上述目的的技术方案如下：

一种间充质干细胞的冻存液，该冻存液为包含50％(体积/体积；mL/mL)的胎牛血清、18.6％(体积/体积；mL/mL)的DMSO、15.4％(质量/体积；g/mL)的乙酰胺、9.0％(体积/体积；mL/mL)的1，2-丙二醇、4.0％(质量/体积；g/mL)的聚乙二醇的低糖DMEM培养基；优选地，低糖DMEM培养基的葡萄糖浓度为1000mg/L。

一种间充质干细胞的保存方法，该方法包括以下步骤：

(1)将脐带组织切割成块，置于体积比为1∶3(mL∶mL)的上述冻存液与基础液的混合溶液中预处理；

(2)将脐带组织块转移至体积比为1∶1(mL∶mL)的上述冻存液与基础液的混合溶液中，0℃下处理；

(3)将脐带组织块转移至上述冻存液中，0℃下处理；

(4)将脐带组织块在液氮中冻存，

其中所述基础液为包含50％(体积/体积；mL/mL)的胎牛血清的低糖DMEM培养基；优选地，低糖DMEM培养基的葡萄糖浓度为1000mg/L。

在上述保存方法中，优选地，脐带组织块的体积小于2mm³。优选地，所述步骤(1)中的预处理时间为10～25分钟，例如15分钟；所述步骤(2)中的处理时间为5～15分钟，例如10分钟；所述步骤(3)中的处理时间为5～15分钟，例如10分钟。优选地，所述冻存过程中脐带组织块与冻存液的质量体积比均为1∶4(g/mL)。

利用上述冻存方法可以将脐带直接进行玻璃化冻存至深低温-196℃并保持其中大部分细胞的生命活力，复苏该玻璃化冻存脐带组织可以从中快速培养出脐带间充质干细胞并扩增。

本发明的另一个目的是提供一种间充质干细胞的培养方法。

用于实现本发明的上述目的的技术方案如下：

一种间充质干细胞的完全培养液，该完全培养液为包含10～20％(体积/体积；mL/mL)的胎牛血清，100U/mL的青霉素，100U/mL链霉素，2ng/mL的两性霉素B，2～5mmol/L的L-谷氨酰胺和20mmol/L的羟乙基呱嗪乙硫磺酸的低糖DMEM培养基；优选地，低糖DMEM培养基的葡萄糖浓度为1000mg/L。

本发明提供的间充质干细胞的培养方法包括以下步骤：

(1)将根据上述保存方法冻存的脐带组织块立即置于39℃水浴中融化；

(2)加入包含1.5mol/L蔗糖的基础液，室温下平衡后离心；沉淀用包含0.5mol/L蔗糖的基础液悬浮，例如直接悬浮或吹打悬浮，室温下平衡后离心；沉淀用包含0.25mol/L蔗糖的基础液悬浮，例如直接悬浮或吹打悬浮，室温下平衡后离心；沉淀用包含0.125mol/L蔗糖的基础液悬浮，例如直接悬浮或吹打悬浮，室温下平衡后离心；

(3)在37℃下使沉淀的脐带组织块贴壁，加入上述完全培养液在37℃、100％湿度和5％(体积/体积；mL/mL)CO₂的条件下培养得到间充质干细胞，

在上述培养方法中，优选地，所述步骤(1)中的冻存的脐带组织块在水浴中经充分振荡快速升温融化。优选地，所述步骤(2)中的平衡时间和离心时间均为5～10分钟，离心转速均为1800～2500转/分钟。优选地，所述步骤(2)中的脐带组织块质与包含蔗糖的基础液的质量体积比例均为1∶3(g/mL)。优选地，所述步骤(3)中的贴壁时间为10～90分钟。

利用上述培养方法培养出的间充质干细胞生长良好，细胞倍增时间约为36小时，传代稳定；表达CD29、CD44、CD105和CD106，不表达CD34和CD45等表面抗原；在一定的体外诱导条件下，可向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化，符合间充质干细胞的特点。

使用本发明的冻存方法和培养方法，在婴儿分娩后不需立即对脐带进行昂贵的细胞培养操作，可以直接在深低温中冻存脐带组织(UC-Tissue)而不影响细胞活力。以后如需要这份脐带，可随时取出1个冻存管复苏并成功培养扩增出MSCs，这样就避免了对每份脐带均进行培养操作，极大地降低了脐带MSCs储存库的运营成本。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1显示从复融的脐带组织块中培养出的间充质干细胞的形态；

图2显示采用流式细胞术检测的脐带间充质干细胞的细胞表型；

图3显示脐带间充质干细胞的生长曲线。

图4显示脐带间充质干细胞向成骨、软骨和脂肪细胞分化后的照片。(A：碱性磷酸酶染色；B：茜素红S染色；C：向软骨诱导分化2周后细胞聚集；D：向软骨诱导分化2周后的甲苯胺蓝染色；E：向脂肪细胞诱导分化；F：油红O染色。图中标尺＝50μm)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

实施例1

使用的脐带为正常分娩产物，并取得了产妇的同意。分娩过程无宫内缺氧情况发生，脐带的色泽为正常的象牙白，无充血现象。甲肝、乙肝、梅毒和艾滋病检测均为阴性的脐带方可进行下一步的分离、冻存和培养工作。

制备冻存液(CL液)。首先配制冻存复苏基础液，其为包含50％(体积/体积；mL/mL)的胎牛血清的低糖DMEM(Dulbecco′s modified Eagle′smedium)培养基(LG-DMEM)。然后在冻存复苏基础液中加入18.6％(体积/体积；mL/mL)的DMSO、15.4％(质量/体积；g/mL)的乙酰胺、9.0％(体积/体积；mL/mL)的1，2-丙二醇和4.0％(质量/体积；g/mL)的聚乙二醇(分子量为6000)制成CL液。

所有液体都使用0.22μm孔径的过滤器进行除菌。

脐带的采集和运输过程均严格进行无菌操作。所取脐带在到达细胞培养无菌层流间后，应使用无菌生理盐水进行充分的洗涤，每次1分钟，洗涤6-10次，以去除可能的微生物污染。

脐带在洗涤后，应该切割成长3cm的小段，利用手术刀纵向剖开脐带，用镊子挑出其内的2根动脉和1根静脉，将剩余的脐带胶质部分称重后，用锋利的剪刀快速剪切成小于2mm³的小块。然后将组织块全部置于用25％(体积/体积；mL/mL)CL液+75％(体积/体积；mL/mL)LG-DMEM液于室温下预处理15分钟，吸弃上清后，组织块再用50％(体积/体积；mL/mL)CL液+50％(体积/体积；mL/mL)LG-DMEM液0℃下处理10分钟，然后用100％(体积/体积；mL/mL)CL液0℃下处理10分钟，分装成5ml/管，直接投入液氮中冻存。在冻存过程中，脐带组织块与液体的质量/体积比始终为1∶4(g/mL)。

复苏液分别为含有1.5、0.5、0.25、0.125mol/L的蔗糖的冻存复苏基础液。

间充质干细胞完全培养液(Complete Medium，CM液)的组成为：LG-DMEM中包含10％(体积/体积；mL/mL)的胎牛血清，100U/mL的青霉素-链霉素，2ng/mL的两性霉素B，4mM的L-谷氨酰胺和20mM的羟乙基呱嗪乙硫磺酸(N’-a-hydroxythylpiperazine-N’-ethanesulfanic acid，HEPES)。

脐带组织碎块在解冻时，将冻存管从液氮中取后，立即放入39℃水浴中，充分振荡使其快速复温融化，样品复温后立即移入离心管，加入3倍(mL/g)于质量的体积的包含1.5mol/L蔗糖的复苏液于室温下平衡5分钟，然后以2500rpm离心5分钟，弃上清；组织块沉淀用包含0.5mol/L蔗糖的复苏液吹悬，平衡5分钟，再以2500rpm离心5分钟，弃上清；组织块沉淀用包含0.25mol/L蔗糖的复苏液吹悬，平衡5分钟，再以2500rpm离心5分钟，弃上清；用包含0.125mol/L蔗糖的复苏液吹悬，平衡5分钟，再以2500rpm离心5分钟弃上清。将组织碎块均匀移入培养皿中，在37℃下贴壁培养10分钟，然后缓慢加入完全培养液(Complete Medium，CM液)，小心勿使组织块浮起。将细胞培养皿置于37℃、100％湿度、5％(体积/体积；mL/mL)CO₂的细胞培养箱中培养3天后，用CM液全量换液，可见有贴壁MSCs在组织块周围生长(见图1)。随后每3～4天换液1次，约8～12天后达到80％汇合时，用0.25％的胰蛋白酶溶液消化，以细胞密度5×10⁴个/cm²传代培养。

流式细胞仪检测表型。取第5代稳定增殖细胞，使用0.25％的胰蛋白酶溶液消化收集，将10⁶个细胞悬浮在100μl含1％(体积/体积；mL/mL)的牛血清白蛋白的PBS中，分别加入下列鼠抗人单克隆抗体20μl：FITC-CD34、FITC-CD45、PE-CD29、PE-CD44、PE-CD105和PE-CD106，在4℃下标记30分钟，PBS洗1次，使用CytomicsTM F C500流式细胞仪检测，Cytometer1.0软件进行分析。结果表明，利用本发明的方法保存和培养出的间充质干细胞表达CD29、CD44、CD105和CD106，不表达CD34和CD45表面抗原(见图2)。

利用本发明的方法培养出的间充质干细胞生长良好，细胞倍增时间约为36小时，传代稳定(见图3)

利用本发明的方法培养出的第5代间充质干细胞，使用Thermo公司的脂肪分化试剂盒(SH30876.KT)、软骨分化试剂盒(SH30885.KT)和成骨分化试剂盒(SH30877.KT)分别进行诱导分化，其可向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化(见图4)，符合间充质干细胞的特点。

Claims

1.一种间充质干细胞的冻存液，该冻存液为包含体积/体积比为50%的胎牛血清、体积/体积比为18.6%的DMSO、0.154g/mL的乙酰胺、体积/体积比为9.0%的1,2-丙二醇、0.040g/mL的聚乙二醇的低糖DMEM培养基。

2.权利要求1所述的冻存液，其特征在于，低糖DMEM培养基的葡萄糖浓度为1000mg/L。

3.一种间充质干细胞的保存方法，该方法包括以下步骤：

（1）将脐带组织切割成块，置于体积比为1：3的根据权利要求1所述的冻存液与基础液的混合溶液中预处理；

（2）将脐带组织块转移至体积比为1：1的根据权利要求1所述的冻存液与基础液的混合溶液中，0℃下处理；

（3）将脐带组织块转移至根据权利要求1所述的冻存液中，0℃下处理；

（4）将脐带组织块在液氮中冻存，

其中，所述基础液为包含体积/体积比为50%的胎牛血清的低糖DMEM培养基。

4.权利要求3所述的保存方法，其特征在于，所述低糖DMEM培养基的葡萄糖浓度为1000mg/L。

5.根据权利要求3所述的保存方法，其特征在于，所述脐带组织块的体积小于2mm³。

6.根据权利要求3-5中任一项所述的保存方法，其特征在于，所述步骤（1）中的预处理时间为10～25分钟；所述步骤（2）中的处理时间为5～15分钟；所述步骤（3）中的处理时间为5～15分钟。

7.根据权利要求6所述的保存方法，其特征在于，所述步骤（1）中的预处理时间为15分钟。

8.根据权利要求6所述的保存方法，其特征在于，所述步骤（2）中的处理时间为10分钟。

9.根据权利要求6所述的保存方法，其特征在于，所述步骤（3）中的处理时间为10分钟。

10.根据权利要求3-5和7-9中任一项所述的保存方法，其特征在于，所述冻存过程中脐带组织块与冻存液的质量体积比均为1：4。

11.根据权利要求6所述的保存方法，其特征在于，所述冻存过程中脐带组织块与冻存液的质量体积比均为1：4。

12.一种间充质干细胞的培养方法，该方法包括以下步骤：

（1）将根据权利要求3-11中任一项所述的保存方法冻存的脐带组织块立即置于39℃水浴中融化；

（2）加入包含1.5mol/L蔗糖的基础液，室温下平衡后离心；沉淀用包含0.5mol/L蔗糖的基础液悬浮，室温下平衡后离心；沉淀用包含0.25mol/L蔗糖的基础液悬浮，室温下平衡后离心；沉淀用包含0.125mol/L蔗糖的基础液悬浮，室温下平衡后离心；

（3）在37℃下使沉淀的脐带组织块贴壁，加入根据完全培养液在37℃下、100%湿度下，和在体积/体积比为5%的CO₂的条件下培养，得到间充质干细胞，

所述的完全培养液为包含体积/体积比为10～20%的胎牛血清，100U/mL的青霉素-链霉素，2ng/mL的两性霉素B，2～5mmol/L的L-谷氨酰胺和20mmol/L的羟乙基呱嗪乙硫磺酸的低糖DMEM培养基；

其中所述基础液为包含体积/体积比为50%的胎牛血清的低糖DMEM培养基。

13.根据权利要求12所述的培养方法，其特征在于，在步骤（2）中，沉淀用包含0.5mol/L蔗糖的基础液悬浮时采用直接悬浮或吹打悬浮。

14.根据权利要求12所述的培养方法，其特征在于，在步骤（2）中，沉淀用包含0.25mol/L蔗糖的基础液悬浮时采用直接悬浮或吹打悬浮。

15.根据权利要求12所述的培养方法，其特征在于，在步骤（2）中，沉淀用包含0.125mol/L蔗糖的基础液悬浮时采用直接悬浮或吹打悬浮。

16.根据权利要求12所述的培养方法，其特征在于，所述基础液的低糖DMEM培养基的葡萄糖浓度为1000mg/L。

17.根据权利要求12所述的培养方法，其特征在于，所述完全培养液的低糖DMEM培养基的葡萄糖浓度为1000mg/L。

18.根据权利要求12-17中任一项所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（1）中的冻存的脐带组织块在水浴中经充分振荡快速升温融化。

19.根据权利要求12-17中任一项所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（2）中的平衡时间和离心时间均为5～10分钟，离心转速均为1800～2500转/分钟。

20.根据权利要求18所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（2）中的平衡时间和离心时间均为5～10分钟，离心转速均为1800～2500转/分钟。

21.根据权利要求12-17及20中任一项所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（2）中的脐带组织块与包含蔗糖的基础液的质量体积比均为1：3。

22.根据权利要求18所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（2）中的脐带组织块与包含蔗糖的基础液的质量体积比均为1：3。

23.根据权利要求21所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（2）中的脐带组织块与包含蔗糖的基础液的质量体积比均为1：3。

24.根据权利要求12-17，20和22-23中任一项所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（3）中的贴壁时间为10～90分钟。

25.根据权利要求18所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（3）中的贴壁时间为10～90分钟。

26.根据权利要求19所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（3）中的贴壁时间为10～90分钟。

27.根据权利要求21所述的培养方法，其特征在于，所述步骤（3）中的贴壁时间为10～90分钟。