CN105586308A - 干细胞培养基及培养宫内膜干细胞的方法 - Google Patents

干细胞培养基及培养宫内膜干细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种干细胞培养基及使用该干细胞培养基培养宫内膜干细胞的方法，所述的办法包括将采集到的经血与子宫内膜组织分开收集，然后分别用本发明提供的干细胞培养基进行培养分别得到经血贴壁细胞和子宫内膜贴壁细胞，再将经血贴壁细胞和子宫内膜贴壁细胞于细胞培养瓶培养，用胰酶消化收集贴壁细胞，接种于细胞共培养皿，再用本发明提供的干细胞培养基进行培养。该干细胞培养基成分简单，添加成分较少，成本较低；体外培养20代以上，细胞不易出现衰老、退化现象，能长久维持干细胞的活性与干性；干细胞培养方法简单、有效，细胞增殖效率快，体外培养倍增时间仅20小时左右；且细胞能够稳定扩增50代。

Description

干细胞培养基及培养宫内膜干细胞的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从经血中分离、培养宫内膜干细胞的方法以及使用到的干细胞培养基。
背景技术
大量研究已证明，宫内膜干细胞具有很强的再生能力，同时具有多分化潜能和低免疫原性，可作为细胞治疗、组织工程的种子细胞，其应用前景广阔。宫内膜干细胞最早是从刮宫组织中提取，随着研究深入，人们发现从女性月经血中同样能分离得到具有再生能力的干细胞，并且其获取方式无侵害性，无伦理问题，方法更简单、安全。从经血中获取的宫内膜干细胞具有极强的再生能力，其主要表现：扩增快，倍增时间仅24小时左右，而骨髓干细胞倍增时间则需要更长。然而，现有培养技术条件下，宫内膜干细胞使用培养基成分较多，价格昂贵，且体外培养10代以上，细胞容易出现衰老、退化现象，增殖效率降低，且在培养基中添加较多的细胞生长因子，会促进干细胞分化，对于维持其干性与稳定性不利，影响干细胞储存与研究质量。
发明内容
针对现有培养基成分较多、价格昂贵、细胞随着扩增代次增加容易老化等问题，本发明提供一种经济有效的干细胞培养基，其能够稳定扩增干细胞，长久维持其活性与干性，同时提供有效促进干细胞生长的培养方法，通过经血与子宫脱落内膜分开收集、分离、共培养来获得稳定、大量的干细胞。
为提供一种经济有效的干细胞培养基，本发明采取如下的技术方案：
干细胞培养基，包含以下组分：低糖DMED培养基，胎牛血清(FBS)，青链霉素双抗溶液，硫酸庆大霉素，谷氨酰胺。
作为优选，各组分按体积含量各占总体积百分比，低糖DMEM培养基占82％，胎牛血清占15％，青链霉素双抗溶液占1％，硫酸庆大霉素占1％，谷氨酰胺占1％。
本发明的另一目的在于提供一种培养宫内膜干细胞的方法，采取如下的技术方案：
一种培养宫内膜干细胞的方法，包括将采集到的经血与子宫内膜组织分开收集，然后分别用本发明提供的干细胞培养基进行培养分别得到经血贴壁细胞和子宫内膜贴壁细胞，再将经血贴壁细胞和子宫内膜贴壁细胞于细胞培养瓶培养，用胰酶消化收集贴壁细胞，接种于细胞共培养皿，再用本发明提供的干细胞培养基进行培养。
更具体的，一种培养宫内膜干细胞的方法，包括如下操作步骤：
步骤1：采集经血与子宫内膜组织，将经血转移至含肝素钠的无菌离心管中，子宫内膜组织转移至无菌培养皿，离心管与培养皿用封口膜封住，24h内低温(4～8℃)运输至实验室；
步骤2：将步骤1所得离心管中的经血与生理盐水充分混合，然后与Ficoll分离液1:1叠加，离心，收集单个核细胞；生理盐水重悬单个核细胞，离心洗涤，去除红细胞、血小板、细胞碎片；离心的细胞沉淀用本发明提供的干细胞培养基重悬并接种于T25细胞培养瓶，放置于37℃、5％CO2培养箱培养7天，中间每2～3天半量换液一次，干细胞逐渐贴壁生长；
步骤3：将步骤1所得培养皿中的子宫内膜组织加入到消化液中，静置消化半小时，再加入等体积缓冲液稀释消化液，再用1ml枪头吹打消化组织，将组织与稀释过的消化液混匀，过筛网，使细胞分散、分离，去除未消化组织；经过筛网滤过的细胞用生理盐水重悬，离心，去除上清，再加入空白低糖DMEM培养基重悬细胞，离心，收集细胞沉淀；再向细胞沉淀中加入本发明提供的干细胞培养基重悬细胞；接种于T25细胞培养瓶，放置于37℃、5％CO2培养箱培养7天，中间每2～3天半量换液一次，干细胞逐渐贴壁生长；
步骤4：将步骤2及步骤3所得贴壁细胞接种于T25细胞培养瓶继续培养7天后，用胰酶消化收集贴壁细胞，贴壁细胞离心经过离心洗涤，接种于细胞共培养皿，上层为步骤2所述经血贴壁细胞，下层为步骤3所述子宫内膜贴壁细胞，所述细胞接种密度为1×106细胞/ml，采用本发明提供的干细胞培养基，共培养7天，细胞获得大量扩增；
步骤5：宫内膜干细胞冻存：当细胞扩增到1～3×107细胞时，按照(3～5)×106细胞/ml加入1ml细胞冻存液；将含有细胞的冻存液转移至1.5ml冻存管，冻存管放入冻存盒，冻存盒置于-80℃，24h后，再将冻存盒中的冻存管转入-196℃液氮储存；
步骤6：宫内膜干细胞复苏：将储存于-196℃液氮中的宫内膜干细胞冻存管取出，迅速放置于40℃水浴锅中，溶解1-2min，取1ml解冻细胞悬液转移至15ml离心管，加入10ml体积的空白DMEM培养基充分混匀，离心，重复洗涤一遍，再将本发明提供的干细胞培养基加入细胞沉淀，以1×106细胞/ml接种于T75细胞培养瓶，放置于37℃、5％CO2培养基培养，可连续传代20次以上。
作为优选，所述步骤3中缓冲液为含0.5％Ⅲ胶原蛋白酶的磷酸缓冲液。
作为优选，所述步骤2中的生理盐水含有1％青链霉素双抗溶液；所述离心洗涤步骤包括2次离心，分别用生理盐水重悬细胞沉淀，然后离心。
作为优选，所述步骤2中以细胞浓度3×105/ml接种于T25细胞培养瓶。
作为优选，所述步骤3中以细胞浓度3×105/ml接种于T25细胞培养瓶。
作为优选，所述步骤4中的离心洗涤步骤为用空白低糖DMEM培养基重悬细胞，800g，离心10min。
作为优选，所述的步骤5中的细胞冻存液配方为：体积百分比为40％的胎牛血清、体积百分比为10％DMSO(二甲基亚砜)、体积百分比为50％空白低糖DMEM培养基。
本发明提供的干细胞培养基成分简单，添加成分较少，成本较低；体外培养20代以上，细胞不易出现衰老、退化现象，能长久维持干细胞的活性与干性。
本发明提供的干细胞培养方法简单、有效，细胞增殖效率快，体外培养倍增时间仅20小时左右；且细胞能够稳定扩增50代。
而且通过本发明提供的培养宫内膜干细胞的方法培养得到的宫内膜干细胞具有如下特性：
1)形态特征：细胞培养瓶置于倒置显微镜下，可观察到宫内膜干细胞成长梭性，成簇排列，第7代至第22代细胞形态均保持不变。
2)倍增时间：利用MTT法绘制细胞增长曲线，宫内膜干细胞的倍增时间在20小时左右。
3)表面标志物检测：利用流式细胞术检测细胞表面标志物，检测出宫内膜干细胞具有间充质干细胞标志物典型特点：CD29、CD44、CD73、CD90、CD105阳性；CD34、CD45、CD117、HLA-DR阴性。
附图说明
图1是实施例2得到的干细胞第7代的形态图；
图2是实施例2得到的干细胞第20代的形态图；
图3是实施例2得到的干细胞增长曲线图；
图4是实施例2得到的干细胞的表面标志物鉴定。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
干细胞培养基，按体积含量各占总体积百分比，低糖DMEM培养基占82％，胎牛血清占15％，青链霉素双抗溶液占1％；硫酸庆大霉素占1％；谷氨酰胺占1％。
实施例2
采用实施例1提供的干细胞培养基培养宫内膜干细胞的方法，包括如下步骤：
步骤1：利用经血采集装置采集经血与子宫内膜组织，并将经血转移至含肝素钠的无菌离心管中，子宫内膜组织转移至无菌的培养皿，用封口膜将离心管与培养皿开口处封住，24h内低温(4～8℃)运输至实验室；
步骤2：将步骤1所述离心管中的经血与等体积生理盐水充分混合，生理盐水含1％青链霉素双抗溶液，用于抑制细菌增长。将经血与生理盐水混合均匀，与Ficoll分离液1:1叠加，800g离心20min，收集白膜层单个核细胞。然后用生理盐水重悬单个核细胞，800g离心10min，重复操作一遍，以去除红细胞、血小板、细胞碎片等。离心的细胞沉淀用实施例1提供的培养基重悬，然后细胞按照3×105/ml接种于T25细胞培养瓶，放置于37℃、5％CO2培养基培养7天，中间每2～3天半量换液一次；干细胞逐渐贴壁生长；
步骤3：将步骤1所述培养皿中的子宫内膜组织加入到消化液中，静置消化半小时，再加入等体积缓冲液稀释消化液，缓冲液为含有0.5％Ⅲ胶原蛋白酶的缓冲液中，静置消化半小时，再用1ml枪头吹打消化组织，将组织与稀释过的消化液混匀，过200目筛网，使细胞分散、分离，去除未消化组织。经过筛网滤过的细胞用生理盐水重悬，800g，离心洗涤10min，去除上清，再加入空白低糖DMEM培养基重悬细胞，800g，离心10min，收集细胞沉淀；再向细胞沉淀中加入实施例1提供的培养基，重悬细胞，使细胞浓度维持在3×105/ml，接种于T25细胞培养瓶，放置于37℃、5％CO2培养基培养7天，中间每2～3天半量换液一次，干细胞逐渐贴壁生长；
步骤4：上述步骤2及步骤3所得贴壁细胞接种于T25细胞培养瓶继续培养7天，用胰酶消化贴壁细胞，贴壁离心经过离心洗涤，接种于细胞共培养皿，上层为步骤2所述经血贴壁细胞，下层为步骤3所述子宫内膜贴壁细胞，细胞接种密度为1×106细胞/ml，采用实施例1提供的干细胞培养基，共培养7天，细胞获得大量扩增；
步骤5：宫内膜干细胞冻存：当细胞扩增到1～3×107细胞时，按照(3～5)×106细胞/ml加入1ml细胞冻存液。将含有细胞的冻存液转移至1.5ml冻存管，冻存管放入冻存盒，冻存盒置于-80℃，24h后，再将冻存盒中的冻存管转入-196℃液氮储存，细胞冻存液配方为：体积百分比为40％的胎牛血清、体积百分比为10％DMSO(二甲基亚砜)、体积百分比为50％空白低糖DMEM培养基；
步骤6：宫内膜干细胞复苏：将-196℃液氮储存的宫内膜干细胞冻存管取出，迅速放置于40℃水浴锅中，溶解1-2min，将1ml解冻细胞悬液转移置15ml离心管，加入10ml体积的空白低糖DMEM培养基，充分混匀，800g，离心5min，重复洗涤一遍，再将实施例1提供的干细胞培养基加入细胞沉淀，以1×106细胞/ml接种于T75细胞培养瓶，放置于37℃、5％CO2培养基培养，可连续传代20次以上。
对实施例2所述宫内膜干细胞鉴定方法如下：
1)形态特征：将细胞培养瓶放置于倒置显微镜下，显微镜连接摄像装置，调整细胞视野并拍照，细胞呈长梭型，成簇排列。
2)细胞增长曲线绘制：传代后把细胞重悬，得到细胞悬液，把悬液均匀加到1孔板中；24h开始进行细胞计数，以后每隔12h计数一次，每次取3孔细胞，分别计数，计数结果取3孔平均值，连续计数6天。根据细胞计数结果，以单位细胞数(细胞数/ml)为纵坐标，以时间为橫坐标绘制生长曲线。
3)细胞表面标志物检测：用FITC\PE荧光标记抗体(CD29、CD105、CD90、CD117、CD45、CD34、CD73、CD44、HLA-DR)直接标记细胞表面分子，通过流式细胞仪检测表面标记物表达。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (10)

1.干细胞培养基，其特征在于包含以下组分：低糖DMED培养基，胎牛血清，青链霉素双抗溶液，硫酸庆大霉素，谷氨酰胺。
2.根据权利要求1所述的干细胞培养基，其特征在于各组分按体积含量各占总体积百分比，低糖DMEM培养基占82％，胎牛血清占15％，青链霉素双抗溶液占1％，硫酸庆大霉素占1％，谷氨酰胺占1％。
3.一种培养宫内膜干细胞的方法，其特征在于包括将采集到的经血与子宫内膜组织分开收集，然后分别用如权利要求1或2所述的干细胞培养基进行培养分别得到经血贴壁细胞和子宫内膜贴壁细胞，再将经血贴壁细胞和子宫内膜贴壁细胞于细胞培养瓶培养，用胰酶消化收集贴壁细胞，接种于细胞共培养皿，再用如权利要求1或2所述的干细胞培养基进行培养。
4.根据权利要求3所述的一种培养宫内膜干细胞的方法，其特征在于包括如下操作步骤：
步骤1：采集经血与子宫内膜组织，将经血转移至含肝素钠的无菌离心管中，子宫内膜组织转移至无菌培养皿，离心管与培养皿用封口膜封住，24h内低温(4～8℃)运输至实验室；
步骤2：将步骤1所得离心管中的经血与生理盐水充分混合，然后与Ficoll分离液1:1叠加，离心，收集单个核细胞；生理盐水重悬单个核细胞，离心洗涤，去除红细胞、血小板、细胞碎片；离心的细胞沉淀用如权利要求1或2所述的干细胞培养基重悬并接种于T25细胞培养瓶，放置于37℃、5％CO2培养箱培养7天，中间每2～3天半量换液一次，干细胞逐渐贴壁生长；
步骤3：将步骤1所得培养皿中的子宫内膜组织加入到消化液中，静置消化半小时，再加入等体积缓冲液稀释消化液，再用1ml枪头吹打组织，将组织与稀释过的消化液混匀，过筛网，使细胞分散、分离，去除未消化组织；经过筛网滤过的细胞用生理盐水重悬，离心，去除上清，再加入空白低糖DMEM培养基重悬细胞，离心，收集细胞沉淀；再向细胞沉淀中加入如权利要求1或2所述的干细胞培养基重悬细胞；接种于T25细胞培养瓶，放置于37℃、5％CO2培养箱培养7天，中间每2～3天半量换液一次，干细胞逐渐贴壁生长；
步骤4：将步骤2及步骤3所得贴壁细胞接种于T25细胞培养瓶继续培养7天后，用胰酶消化收集贴壁细胞，贴壁细胞经过离心洗涤，接种于细胞共培养皿，上层为步骤2所述经血贴壁细胞，下层为步骤3所述子宫内膜贴壁细胞，所述细胞接种密度为1×106细胞/ml，采用如权利要求1或2所述的干细胞培养基，共培养7天，细胞获得大量扩增；
步骤5：宫内膜干细胞冻存：当细胞扩增到1～3×107细胞时，按照(3～5)×106细胞/ml加入1ml细胞冻存液；将含有细胞的冻存液转移至1.5ml冻存管，冻存管放入冻存盒，冻存盒置于-80℃，24h后，再将冻存盒中的冻存管转入-196℃液氮储存；
步骤6：宫内膜干细胞复苏：将储存于-196℃液氮中的宫内膜干细胞冻存管取出，迅速放置于40℃水浴锅中，溶解1-2min，取1ml解冻细胞悬液转移至15ml离心管，加入10ml体积的空白DMEM培养基充分混匀，离心，重复洗涤一遍，再将本发明提供的干细胞培养基加入细胞沉淀，以1×106细胞/ml接种于T75细胞培养瓶，放置于37℃、5％CO2培养基培养，可连续传代20次以上。
5.根据权利要求4所述的一种培养宫内膜干细胞的方法，其特征在于所述步骤2中的生理盐水含有1％青链霉素双抗溶液；所述离心洗涤步骤包括2次离心，分别用生理盐水重悬细胞沉淀，然后离心。
6.根据权利要求4所述的一种培养宫内膜干细胞的方法，其特征在于所述步骤3中缓冲液为含0.5％Ⅲ胶原蛋白酶的磷酸缓冲液。
7.根据权利要求4所述的一种培养宫内膜干细胞的方法，其特征在于所述步骤2中以细胞浓度3×105/ml接种于T25细胞培养瓶。
8.根据权利要求4所述的一种培养宫内膜干细胞的方法，其特征在于所述步骤3中以细胞浓度3×105/ml接种于T25细胞培养瓶。
9.根据权利要求4所述的一种培养宫内膜干细胞的方法，其特征在于所述步骤4中的离心洗涤步骤为用空白低糖DMEM培养基重悬细胞，800g，离心10min。
10.根据权利要求4所述的一种培养宫内膜干细胞的方法，其特征在于所述的步骤5中的细胞冻存液配方为：体积百分比为40％的胎牛血清、体积百分比为10％二甲基亚砜、体积百分比为50％空白低糖DMEM培养基。
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