CN109321515A

CN109321515A - 经血源子宫内膜细胞分离培养方法

Info

Publication number: CN109321515A
Application number: CN201811280537.2A
Authority: CN
Inventors: 舒珊
Original assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Current assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Priority date: 2018-10-30
Filing date: 2018-10-30
Publication date: 2019-02-12

Abstract

本发明涉及细胞分离培养技术领域，具体而言，涉及一种经血源子宫内膜细胞分离培养方法。该方法包括：将经血过滤以分离出血块及内膜组织，滤液直接进行细胞培养得到子宫内膜细胞；所得滤渣用胶原酶消化后离心一次或多次直至上清无明显浑浊，弃去上清，对离心所得沉淀进行培养得到子宫内膜细胞。本发明所提供的方法将作为女性生活用品的月经杯与医学研究相结合，更加简化子宫内膜细胞培养的流程，从而可以更方便地获取子宫内膜细胞的生物学样本，以便更好地进行临床研究应用。

Description

经血源子宫内膜细胞分离培养方法

技术领域

本发明涉及细胞分离培养技术领域，具体而言，涉及一种经血源子宫内膜细胞分离培养方法。

背景技术

子宫内膜作为性激素作用的靶器官,通过子宫内膜细胞进行体外培养,观察子宫内膜对激素、各类药物细胞因子的作用,在妇产科疾病的研究中占有重要的地位。目前供临床研究所用的子宫内膜原代细胞的培养多来源于诊断性刮宫的内膜标本。此项手术操作需要有资质的妇科医生、在医院手术室进行并留取。步骤如下：

1.月经干净后一周内来医院，预约手术；

2.到手术室操作，刮取内膜组织；

3.组织放冰桶送实验室；

4.组织剪碎后消化；

5.离心、培养、传代。

从上述步骤能够推断，通过诊刮手术刮取内膜的过程存在以下缺点：

1.程序繁杂：需要来医院两次以上，需医生手术操作，对医护人员数量、资质均有要求；

2.有创伤、有风险：手术增加患者的痛苦、恐惧与损伤，存在各种术中术后并发症的风险，如宫颈的损伤、子宫穿孔、感染、内膜损伤的修复、增加阴道出血量等；

3.组织标本混杂成分增加：由于诊刮手术者和患者内膜厚度的个体差异导致诊刮刮取的内膜厚度无法形成同一性，在内膜组织中既有功能层内膜、也有基底层内膜、甚至还有子宫肌层的非内膜组织，为研究增加了人为的混杂因素；

4.患者依从性、操作可重复性差：由于以上原因无法多次刮取取得更多的内膜组织。

因而，若能够提供一种创伤小、操作简便、分离纯度高的子宫内膜细胞分离培养方法将大大降低子宫内膜细胞的获取难度。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种经血源子宫内膜细胞分离培养方法，该方法易于操作，将作为女性废弃的月经血用来疾病和自身内环境状态的研究，对被采集者没有创伤，且分离效果好。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明涉及一种经血源子宫内膜细胞分离培养方法，包括：

将经血过滤以分离出血块及内膜组织，滤液直接进行细胞培养得到子宫内膜细胞；

所得滤渣用胶原酶消化后离心一次或多次直至上清无明显浑浊，弃去上清，对离心所得沉淀进行培养得到子宫内膜细胞。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)经血获取容易，甚至患者自己就可以进行操作，与现有技术相比，没有创伤。

(2)组织来源单一：经血来源的获得的子宫内膜为功能层子宫内膜，不再含有基底层或肌层混杂组织，呈薄膜碎片状，且组织松散，易消化，无需剪碎等消化前预处理，简化流程，对研究干扰减少；

(3)重复性好：一个月经期可以多次留取，多个月经期均可留取。

(4)临床研究应用：月经血子宫内膜的培养可用于子宫内膜异位症、不孕症、子宫内膜癌的研究。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中培养得到的子宫内膜细胞；

图2为本发明一个实施例中培养得到的子宫内膜细胞。

具体实施方式

本发明涉及一种经血源子宫内膜细胞分离培养方法，包括：

本发明通过分步骤收集子宫内膜细胞可以大大提高收率。在首次过滤后，滤液中含有大量悬浮的脱落子宫内膜细胞，可直接进行培养；还有很多子宫内膜与血液形成血凝块沉积在一起，可以通过胶原酶将组织块充分消化，组织会呈云雾状飘起在上清中，因而经过过滤后能够得到较纯的子宫内膜细胞。

可选的，如上所述的经血源子宫内膜细胞分离培养方法，所述经血使用月经杯收集得到。

月经杯收集经血方便快捷，可自己放置或由医生操作，按照研究的同一性要求，一般由医生统一放置取出，可即来即放，总操作时间控制在5-10分钟；

该方法操作完全没有创伤，本身月经杯就是正常月经期的四大女性用品之一，1932年由麦格拉斯森和帕金斯接生集团发明专利，1937由好莱坞女演员Leona Chalmers申请商业生产专利，开始使用橡胶原料，2001年第一个硅胶成分的月经杯诞生于英国，硅胶材料更柔软、低反应性的特点逐渐风靡全世界。因此月经杯是一种卫生、依从性非常好的用具用来收集月经。

经血用月经杯收集后应尽快进行分离，若需短途运输，则需要低温(例如0～6℃)保存运输。

可选的，如上所述的经血源子宫内膜细胞分离培养方法，将经血过滤之前经过稀释，经血与稀释液的体积比为1：(0.5～1.5)。

在一些实施方式中，所述经血与稀释液的体积比为1：1。

可选的，如上所述的经血源子宫内膜细胞分离培养方法，所述过滤具体为用90～110μm的滤网过滤。

在一些实施方式中，滤网的孔径为100μm。

可选的，如上所述的经血源子宫内膜细胞分离培养方法，所述稀释液的成分包含0.8～1.2％；

在一些实施方式中，所述稀释液的成分所用溶剂为1×PBS。

在一些实施方式中，青霉素和链霉素的添加比例为(0.8～1.2):(0.8～1.2)，优选为1：1。

可选的，如上所述的经血源子宫内膜细胞分离培养方法，所述胶原酶消化的方法包括：

用0.8％～1.2％I型胶原酶在36.0℃～38.0℃下，以130～160次/分钟的频率震荡消化70min～110min；

在一些实施方式中，所述胶原酶消化的方法包括：

用0.1％I型胶原酶在37.0℃下，以140次/分钟的频率震荡消化90min；

I型胶原酶含有比较均匀的各种酶活力，可分解经血中的胶原成分，从而更好地将子宫内膜细胞释放出来。

可选的，如上所述的经血源子宫内膜细胞分离培养方法，在所述胶原酶消化过后，将所述胶原酶消化过后的子宫内膜组织用吹打分散后，用90～110μm的滤网过滤，再进行离心。

可选的，如上所述的经血源子宫内膜细胞分离培养方法，所述离心每次800～1200离心3min～7min；

在一些实施方式中，所述离心每次1000离心5min。

经血样本相比较为复杂，存在较多粘液物质及大量血凝块，因而在处理时需要以合适的条件去除杂质，并且选择适宜的离心速率。

可选的，如上所述的经血源子宫内膜细胞分离培养方法，所述培养的方法包括：

将所述滤液及所述沉淀分别加入培养基进行培养，20h～28h后第一次换液，以后2-3天换液一次。

可选的，如上所述的经血源子宫内膜细胞分离培养方法，所述培养的方法还包括：

细胞汇合度为80-90％时传代。

本发明所提供的方法将作为女性生活用品的月经杯与医学研究相结合，更加简化子宫内膜细胞培养的流程，从而可以更方便地获取子宫内膜细胞的生物学样本，以便更好地进行临床研究应用。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

本实施例提供了一种月经血采集的示例实施方案。

一、选月经血来源的主体

1.年龄：25-40岁或疾病组任何年龄；

2.排除急性感染疾病；

3.月经第一天通知医生或实验人员；

二、月经血的收集

1.备用物品：月经杯、碘伏、生理盐水、血管钳、窥阴器、冰桶、冰、消毒后的45ml离心管；

2.方法：

1)月经第二天来医院门诊；

2)消毒月经杯：碘伏消毒月经杯数分钟、生理盐水冲洗杯内壁；

3)放置月经杯：女士脱去一侧外内裤、仰卧检查床，双腿分开，暴露会阴，血管钳将杯缘双折成C/8字型(通过打开的窥阴器开口即可)、打开窥阴器暴露宫颈、钳夹月经杯置入宫颈外口、松开血管钳、月经杯杯缘自动回弹打开，如果打开不完全，可以钳夹下缘左右稍旋转调整、上推杯下缘至阴道内，放置4-5小时；

4)取出月经杯：双手带消毒手套，右手食指沿阴道右侧壁进入进入阴道找到顶端的月经杯口，钩住杯口稍下拉松动，以去除月经杯内的负压，另一只手下拉月经杯下缘，双手配合拉出月经杯，注意至月经杯口弹出前稍卷曲杯口，以免造成经过处女膜缘造成的不适。

5)收集月经血：将取出月经杯内的月经血倒入冰桶中的离心管，拧紧管盖，弃月经杯，冰桶送实验室。

实施例2

本实施例提供了一种经血提取子宫内膜细胞的示例性实施方式。

1.备用物品：消毒超净台及相应器械及实验物品：自动移液枪、1000ul移液枪、移液管数根、铝饭盒一只、100目手柄式不锈钢细胞筛一只(150um)、10cm眼科镊一只、BD100um细胞滤网一只、培养皿数只、1ml枪头一盒、封口膜、45ml离心管数只、1％I型胶原酶、PBS液、培养基(DMEM+F12/10％FBS/1％双抗)；

2.方法：

1)将PBS+1％双抗1：1加入装月经血的离心管；

2)分离月经血及其他成分(血块、内膜)：取出培养皿，带柄滤网置其上，将1：1稀释的月经血倒入100um的滤网上，将月经血过滤至培养皿1中；

3)消化：将滤网上剩余的血块及内膜冲洗、转移至45ml离心管，加入20ml PBS+1％I型胶原酶，封口，置恒温震荡仪(37.0℃，140次/分钟)90分钟；

4)离心：消化后，1000ul移液枪吹打松散的内膜组织至均匀分散，经BD 100um滤网至离心机1000r/min*5分钟，去除观察上清，根据每人血液黏稠情况，离心2-3次，直至上液变清，区别于血性下液；

5)留沉淀：弃上清液，吸出血性沉积液至另一培养皿2；

6)温箱孵育培养：两皿培养皿分别加入8ml培养基置于温箱(CO₂)，24小时后第一次换液，以后2-3天换液一次。每日倒置显微镜观察、拍照；到长满80-90％时传代。传代方法同其他原代细胞的传代方法。

其中，培养皿1和培养皿2培养得到的子宫内膜细胞分别如图1和图2所示。

实施例3

1.同实施例2。

2.方法：

1)将经血与稀释液按体积比为1：0.5的比例混合，稀释液成分为PBS+0.8％双抗。

2)分离月经血及其他成分(血块、内膜)：取出培养皿，带柄滤网置其上，将稀释的月经血倒入90μm的滤网上，将月经血过滤至培养皿中；

3)消化：将滤网上剩余的血块及内膜冲洗、转移至45ml离心管，加入20mlPBS+0.8％～1.2％I型胶原酶，封口，置恒温震荡仪(37.0℃，130次/分钟)110min；

4)离心：消化后，1000ul移液枪吹打松散的内膜组织至均匀分散，经BD 90μm滤网至离心机800r/min离心7min，去除观察上清，根据每人血液黏稠情况，离心2-3次，直至上液变清，区别于血性下液；

5)留沉淀：弃上清液，吸出血性沉积液至另一培养皿；

6)温箱孵育培养：两皿培养皿分别加入8ml培养基置于温箱(CO₂)，28h后第一次换液，以后2-3天换液一次。每日倒置显微镜观察、拍照；到长满80-90％时传代。传代方法同其他原代细胞的传代方法。

实施例4

1.同实施例2。

2.方法：

1)将经血与稀释液按体积比为1：1.5的比例混合，稀释液成分为PBS+1.2％双抗。

2)分离月经血及其他成分(血块、内膜)：取出培养皿，带柄滤网置其上，将稀释的月经血倒入110μm的滤网上，将月经血过滤至培养皿中；

3)消化：将滤网上剩余的血块及内膜冲洗、转移至45ml离心管，加入20mlPBS+0.8％～1.2％I型胶原酶，封口，置恒温震荡仪(37.0℃，160次/分钟)70min；

4)离心：消化后，1000ul移液枪吹打松散的内膜组织至均匀分散，经BD 110μm滤网至离心机1200r/min离心3min，去除观察上清，根据每人血液黏稠情况，离心2-3次，直至上液变清，区别于血性下液；

5)留沉淀：弃上清液，吸出血性沉积液至另一培养皿；

6)温箱孵育培养：两皿培养皿分别加入8ml培养基置于温箱(CO₂)，20h后第一次换液，以后2-3天换液一次。每日倒置显微镜观察、拍照；到长满80-90％时传代。传代方法同其他原代细胞的传代方法。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种经血源子宫内膜细胞分离培养方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的经血源子宫内膜细胞分离培养方法，其特征在于，所述经血使用月经杯收集得到。

3.根据权利要求1所述的经血源子宫内膜细胞分离培养方法，其特征在于，将经血过滤之前经过稀释，经血与稀释液的体积比为1：(0.5～1.5)。

4.根据权利要求3所述的经血源子宫内膜细胞分离培养方法，其特征在于，所述过滤具体为用90～110μm的滤网过滤。

5.根据权利要求3所述的经血源子宫内膜细胞分离培养方法，其特征在于，所述稀释液的成分包含0.8～1.2％青霉素和链霉素。

6.根据权利要求1所述的经血源子宫内膜细胞分离培养方法，其特征在于，所述胶原酶消化的方法包括：

用0.8％～1.2％I型胶原酶在36.0℃～38.0℃下，以130～160次/分钟的频率震荡消化70min～110min。

7.根据权利要求6所述的经血源子宫内膜细胞分离培养方法，其特征在于，在所述胶原酶消化过后，将所述胶原酶消化过后的子宫内膜组织用吹打分散后，用90～110μm的滤网过滤，再进行离心。

8.根据权利要求1所述的经血源子宫内膜细胞分离培养方法，其特征在于，所述离心每次800～1200r/min离心3min～7min。

9.根据权利要求1所述的经血源子宫内膜细胞分离培养方法，其特征在于，所述培养的方法包括：

10.根据权利要求9所述的经血源子宫内膜细胞分离培养方法，其特征在于，所述培养的方法还包括：

细胞汇合度为80-90％时传代。