CN106119201A - 一种大鼠器官型脊髓片培养液的配制方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种大鼠器官型脊髓片培养液的配制方法，1)将DMEM/F12培养基干粉溶解在双蒸水中，加入NaHCO3，调节培养基溶液的pH，加入双蒸水将培养基溶液定容，过滤除菌，装瓶分装，保存备用；2)冷冻胎牛血清全融后，置于水浴锅中灭活，无菌离心管分装，保存备用；3)按照体积比取DMEM/F12培养基85‑95ml，向培养基中加入5‑15ml胎牛血清，即得大鼠器官型脊髓片培养液；4)将培养液加入到NaOH和NaHCO3配制的溶液中保存。本发明大鼠器官型脊髓片培养液的配制方法具有简化培养液组分，减低实验成本，简便省时、易操作等优点，采用该培养液培养的脊髓片更容易存活，而且生长迅速。

Description

一种大鼠器官型脊髓片培养液的配制方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种大鼠器官型脊髓片培养液的配制方法。
背景技术
现有的器官型脊髓片培养液，采用传统的Stoppini培养方法中的培养液组成成分，包括：50％MEM,25mmol/L羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)，25％灭活马血清，25％Hanks平衡盐溶液，含25.6g/L葡萄糖，2mmol/L谷氨酰胺。取材来源为出生1周到2周大鼠，这个时期脊髓组织的细胞结构基本建立，脊髓组织的分化性能相对较好。
近年来，随着组织培养技术的发展，临床医疗技术的深入研究，器官型脊髓片在脊髓疾病的研究中发挥了越来越重要的作用，尤其是器官型脊髓片培养为许多脊髓生理、病理以及疾病的研究提供了有效的技术手段。传统的器官型脊髓片培养液需要的试剂种类多，相关费用很高。因此，建立一种配方简单，成本低廉，简便省时的培养液制作方法尤为重要。
发明内容
为解决现有技术中存在的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种大鼠器官型脊髓片培养液，该培养液具有配方简单、操作方便、成本低廉的优点。
本发明的技术方案是通过下述技术方案来实现的。
一种大鼠器官型脊髓片培养液的配制方法，包括下述步骤：
1)将15.6g DMEM/F12培养基干粉充分溶解在900ml的双蒸水中，然后加入1.2gNaHCO3，调节培养基溶液的pH为7.4，加入双蒸水将培养基溶液定容至1000ml，然后过滤除菌，250ml/瓶分装，4℃保存备用；
2)将胎牛血清从冷冻箱中取出后，先置于4℃的冰箱中使其溶解，然后在室温下使其全融，在溶解的过程中规则的摇晃使其混合均匀，将血清置于56℃的水浴锅中灭活30分钟，然后用10ml的无菌离心管分装成10ml/支，在-20℃的条件下保存备用；
3)按照体积比取步骤1)配制的DMEM/F12培养基85-95ml，向培养基中加入5-15ml的步骤2)配制的胎牛血清，即得大鼠器官型脊髓片培养液；
4)在配制的大鼠器官型脊髓片培养液中加入NaOH或NaHCO3溶液，调pH值至7.4，于4℃保存。
进一步，所述DMEM/F12是采用DMEM与F12为(1:1)的质量比的干粉，培养基干粉购自美国的Thermo公司。
进一步，所述胎牛血清购自美国的Gibco公司。
进一步，所述步骤1)培养基消毒灭菌采用0.22μm微孔滤器过滤除菌。
进一步，所述步骤4)，NaOH溶液摩尔浓度为1mol/L，NaHCO3溶液质量浓度为5％。
本发明的大鼠器官型脊髓片培养液能够在大鼠器官型脊髓片培养中的应用。
上述试剂均为本领域常用市售产品。
本发明所述大鼠器官型脊髓片培养液采用胎牛血清代替了传统培养液中的组成成分。这种培养液是特别理想的，由于该种培养液较传统培养液培养大鼠器官型脊髓片时，脊髓片更容易存活，而且生长迅速；此外，该培养液也具有简化培养液组分，减低实验成本，简便省时、易操作等优点。
附图说明
图1是脊髓组织片在本发明培养液体外培养1天显微镜镜像图；
图2是脊髓组织片在本发明培养液体外培养4天显微镜镜像图；
图3是脊髓组织片在本发明培养液体外培养7天显微镜镜像图。
具体实施方式
下面结合实施例对发明作进一步的详细说明，但并不作为对发明做任何限制的依据。
一种大鼠器官型脊髓片培养液的配制方法，包括下述步骤：
1)将15.6g DMEM/F12(1:1)培养基干粉充分溶解在900ml的双蒸水中，然后加入1.2g NaHCO3，调节培养基溶液的pH为7.4，加入双蒸水将培养基溶液定容至1000ml，然后用0.22μm微孔滤器将其过滤除菌，然后用消毒灭菌后得250ml/瓶分装，4℃保存备用；
2)将胎牛血清从冷冻箱中取出后，先置于4℃的冰箱中使其溶解，然后在室温下使其全融，在溶解的过程中规则的摇晃使其混合均匀，将血清置于56℃的水浴锅中灭活30分钟，然后用10ml的无菌离心管分装成10ml/支，在-20℃的条件下保存备用；
3)按照体积比取步骤1)配制的DMEM/F12培养基85-95ml，向培养基中加入5-15ml的步骤2)配制的胎牛血清，即得大鼠器官型脊髓片培养液；
4)在配制的大鼠器官型脊髓片培养液加入摩尔浓度为1mol/L的NaOH或质量浓度为5％的NaHCO3，调pH值至7.4，于4℃保存。
原料来源
配制大鼠器官型脊髓片培养液各种试剂的来源：
DMEM/F12(1:1)购自美国的Thermo公司。
胎牛血清购自美国的Gibco公司。
其他相关试剂的来源：
琼脂糖购自美国的Sigma公司。
实施例
在实施本发明的过程中，所使用的器皿及其他用具均系灭菌处理，而且所有操作均在无菌条件下实施。此外，所有的外科手术操作均在无菌的环境下进行。灭菌方法和无菌操作均属于本领域的公知技术。实施例配制见表1。
表1本发明的一种大鼠器官型脊髓片培养液实施例
试验例
需要说明的是，下述手术介入方式获取大鼠器官型脊髓片过程不在本发明培养液保护范围内，仅用于说明本发明培养液的应用。
将上述培养液按如下步骤实验培养：
(1)取新鲜的大鼠腰段脊髓，将4％的琼脂糖凝块用手术刀刻出一个长方形凹槽，将新鲜的腰段脊髓放入凹槽中，用胶水将腰段脊髓底部与琼脂糖凹槽底部相粘连，用滤纸将多余的胶水吸尽；
(2)将预冷的人工脑脊液置于ZQP-86型振动切片机的水槽中，将准备好的带有脊髓的琼脂糖凝块的底座用胶水粘在振动切片机的载物台上，用滤纸吸尽多余的胶水；
(3)用ZQP-86型振动切片机将腰段脊髓切成350μm后的组织片；
(4)在Transwell小室底部加入1ml的脊髓片培养液，经过CO2培养箱中预存15分钟；
(5)用3ml无菌吸管将完整的脊髓切片转移到transwell小室的插入式培养皿中，每个插入式培养皿上放5个脊髓组织片，用移液器将微孔膜上多余的液体吸尽，使得组织片恰好处于气液交换的平面上；
(6)将Transwell小室放入温度为37℃的CO2培养箱中(5％O2+95％CO2),每3天换液一次，在倒置显微镜下观察脊髓组织片的生长状态；
(7)培养后的脊髓组织片用台盼蓝染色观察脊髓片的存活情况，用免疫组化方法鉴定脊髓片的神经细胞。
结果分析：
(1)器官型脊髓片在倒置相差显微镜下观察
在倒置相差显微镜下观察脊髓组织片存活与生长情况：体外培养1天时，可见脊髓片边界清楚完整，周围有不透明光晕，折光性较强，脊髓白质和灰质分界不清，见图1所示；培养的脊髓片4天时可见脊髓组织片中有细胞呈放射状向外迁移，在脊髓组织片外没有发现细胞，脊髓灰质和白质有模糊的分界线，见图2所示；体外培养7天时，脊髓片形态完整，结构分明，脊髓灰质白质分界较清楚，在组织片外可见从组织片向外爬出的大量细胞，脊髓组织中央管结构清晰可见，见图3所示。由于细胞持续向外迁移，组织片厚度逐渐变薄，折光性良好，在体外培养5周时脊髓切片厚度为100-150μm。组织片在体外培养7天后，用台盼蓝染色后，几乎没有细胞被染成蓝色，提示组织片细胞活性良好。
(2)器官型脊髓组织片免疫组化染色
在脊髓片腹侧可见被SMI-32染色的α运动神经元，直径均大于25微米，细胞形态完整。脊髓片可见被NF200染色的轴突，轴突分布于整个脊髓片，数量较多，轴突和轴突之间广泛连接。
本发明并不局限于上述实施例，在本发明公开的技术方案的基础上，本领域的技术人员根据所公开的技术内容，不需要创造性的劳动就可以对其中的一些技术特征作出一些替换和变形，这些替换和变形均在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种大鼠器官型脊髓片培养液的配制方法，其特征在于，包括下述步骤：
1)将15.6g DMEM/F12培养基干粉充分溶解在900ml的双蒸水中，然后加入1.2g NaHCO3，调节培养基溶液的pH为7.4，加入双蒸水将培养基溶液定容至1000ml，然后过滤除菌，用250ml/瓶分装，4℃保存备用；
2)将胎牛血清从冷冻箱中取出后，先置于4℃的冰箱中使其溶解，然后在室温下使其全融，在溶解的过程中规则的摇晃使其混合均匀，将血清置于56℃的水浴锅中灭活30分钟，然后用10ml的无菌离心管分装成10ml/支，在-20℃的条件下保存备用；
3)按照体积比取步骤1)配制的DMEM/F12培养基85-95ml，向培养基中加入5-15ml的步骤2)配制的胎牛血清，即得大鼠器官型脊髓片培养液；
4)在配制的大鼠器官型脊髓片培养液中加入NaOH或NaHCO3溶液，调pH值至7.4，于4℃保存。
2.根据权利要求1所述的一种大鼠器官型脊髓片培养液的配制方法，其特征在于，所述DMEM/F12是采用DMEM与F12为(1:1)的质量比的干粉，培养基干粉购自美国的Thermo公司。
3.根据权利要求1所述的一种大鼠器官型脊髓片培养液的配制方法，其特征在于，所述胎牛血清购自美国的Gibco公司。
4.根据权利要求1所述的一种大鼠器官型脊髓片培养液的配制方法，其特征在于，所述步骤1)培养基消毒灭菌采用0.22μm微孔滤器过滤除菌。
5.根据权利要求1所述的一种大鼠器官型脊髓片培养液的配制方法，其特征在于，所述步骤4)，NaOH溶液摩尔浓度为1mol/L，NaHCO3溶液质量浓度为5％。
6.权利要求1-5任一项所述的大鼠器官型脊髓片培养液在大鼠器官型脊髓片培养中的应用。
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