CN103031274A - 小分子化合物tws119作为神经干细胞分化诱导剂的新应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了TWS119(4，6-二取代吡咯[2，3-d]嘧啶)作为诱导哺乳动物神经干细胞向神经元分化的诱导剂的新应用，公开了一种诱导哺乳动物神经干细胞向神经元分化的细胞培养基，含有诱导剂TWS119，并且提供了此种细胞培养基的制备方法；实验证实在哺乳动物神经干细胞分化培养基中加入诱导剂TWS119后，神经干细胞向神经元分化的比例明显提高，特别是当TWS119浓度为350nM时效果最佳。含有TWS119的细胞培养基可诱导哺乳动物神经干细胞向神经元分化，具有潜在的临床应用价值。

Description

小分子化合物TWS119作为神经干细胞分化诱导剂的新应用
技术领域
本发明所涉及的是再生医学和细胞生物学领域，具体涉及TWS119作为诱导哺乳动物神经干细胞向神经元分化的诱导剂的新应用。
背景技术
神经干细胞(neural stem cells，NSCs)存在于胚胎和成年哺乳动物的中枢神经系统，具有自我更新和多向分化潜能，能分化为各种神经细胞，如神经元、少突胶质细胞以及星形胶质细胞等，为中枢神经系统损伤、神经系统变性疾病或遗传性代谢疾病、神经退行性疾病等提供了新的治疗策略。中枢神经系统损伤后，大部分NSCs分化为胶质细胞，在损伤部位形成胶质瘢痕，阻碍了轴突生长，使损伤不能修复。因此，提高NSCs向神经元的分化比例成为神经科学研究的热点。
目前，国内外通用的体外诱导NSCs增殖分化的方法是给予丝裂原，如碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)及表皮生长因子(epidermalgrowth factor，EGF)等，干预维持培养的神经干细胞，使其处于增殖状态，除去丝裂原并添加含胎牛血清的培养基后，诱导NSCs进行分化，但这种方法所得到的分化细胞主要是胶质细胞，神经元比例较低。
TWS119(3-[[6-(3-氨基苯基)-7H-吡咯并[2，3-D]嘧啶-4-基]氧基]苯酚)是一种小分子有机化合物，最早是美国Scripps Research Institute的Wu等在2002年合成的[Wu，X.et al：J.Am.Chem.Soc.(2002)：124，14520-14521]。TWS119的结构式如下：
Figure BSA00000584356200011
分子式：C18H14N4O2；分子量：318.3
Anand Mayasundari等人开发了TWS119的简易合成方法，通过与同时存在的普通环类原料在一个反应器中形成醚或硫醚连接，总共两步便可形成所需要的产物。简易合成步骤小结如下：
Figure BSA00000584356200021
TWS119是糖原合成酶激酶-3β(GSK3β)的抑制剂。GSK3β是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，受胰岛素、生长因子、细胞特异性因子和细胞黏着等细胞外刺激因素的抑制。GSK3β的活性调节细胞分裂、凋亡和炎症等细胞功能。当TWS119的IC50值为30nM时，可抑制GSK3β的活性。但迄今为止，TWS119对哺乳动物NSCs的增殖与分化是否也有调控作用尚不明确。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供TWS119作为诱导哺乳动物NSCs向神经元分化的诱导剂的新应用，从而为NSCs移植治疗神经系统疾病和损伤修复研究提供新的思路和方法。
本发明的目的之二在于提供一种诱导哺乳动物NSCs向神经元分化的细胞培养基，含有诱导剂TWS119。
进一步，所述细胞培养基中含有浓度为200～500nM的诱导剂TWS119；
进一步，所述细胞培养基中含有浓度为350nM的诱导剂TWS119；
进一步，所述细胞培养基中还含有胎牛血清；
进一步，所述细胞培养基中还含有体积百分浓度为5～20％的胎牛血清；
进一步，所述细胞培养基中还含有体积百分浓度为10％的胎牛血清。
本发明的目的之三在于提供一种诱导哺乳动物NSCs向神经元分化的细胞培养基的制备方法，包括以下步骤：
a.DMEM/F12基础培养液的制备：取制备DMEM/F12基础培养液1L用量的DMEM/F12(1∶1)干粉1袋、谷氨酰胺2.5g，用浓度为0.1mol/L、pH值为7.35的磷酸盐缓冲液即PBS溶解并稀释至1L，调节PH值为7.5，用0.2um微孔滤膜过滤除菌，即得；
b.细胞培养基的制备：按照制备100ml细胞培养基计，将诱导剂TWS119(终浓度200～500nM)加入步骤a制得的DMEM/F12基础培养液70ml使溶解，用0.2uM微孔滤膜过滤除菌后，加入胎牛血清5～20ml、青霉素与链霉素的混合液(由浓度为4万U/ml的青霉素溶液、浓度为4万U/ml的链霉素溶液按1∶1混合而成)1ml，最后用DMEM/F12基础培养液定容至100ml。TWS119的终浓度为200～500nM。
进一步，所述步骤b中诱导剂TWS119的终浓度为350nM；
进一步，所述步骤b中诱导剂TWS119的终浓度为350nM，胎牛血清的加入量为10ml。
本发明的显著成果在于：在哺乳动物NSCs分化培养基中加入诱导剂TWS119，NSCs向神经元分化的比例明显提高，特别是当TWS119浓度为350nM时，免疫荧光染色后激光共聚焦显微镜检测显示NSCs分化为神经元的比例为30.7±3.6％，而对照组II为13.4±3.8％，二者相比有显著性差异(P＜0.05)；同时，流式细胞仪3次检测NSCs向神经元分化比例，分别为21.5％、19.2％、20.3％，均值为20.3％，而对照组II分别为8.9％、10.5％、12.0％，均值为10.5％，二者有统计学差异(P＜0.05)，与免疫荧光染色鉴定结果一致；以上实验结果证实TWS119具有促进NSCs向神经元分化的作用，含有TWS119的细胞培养基可诱导哺乳动物NSCs向神经元分化，具有良好的应用价值。
本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到启发。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书和权利要求书来实现和获得。
附图说明
图1为克隆球Nestin免疫荧光染色鉴定图；
图2为对照组II分化细胞免疫荧光染色鉴定图；
图3为浓度为350nM的TWS119诱导NSCs向神经元分化的免疫荧光染色鉴定图。
具体实施方式
下面将参照附图，通过实验例来进一步阐述TWS119作为诱导哺乳动物NSCs向神经元分化的诱导剂的新应用的有益效果。
一、材料与试剂
1、实验动物
新生48小时内的SD乳大鼠5只，由天津中医学院实验动物中心提供。
2、实验试剂
细胞培养基DMEM/F12(1∶1)、B27添加剂为Gibco公司产品，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，bFGF及EGF为Sigma公司产品；TWS119按照AnandMayasundari等人描述的方法合成(Tetrahedron Letters，Volume 51，Issue 27，7July 2010，Pages 3597-3598)；一抗：小鼠抗大鼠巢蛋白(Nestin)单克隆抗体、小鼠抗大鼠胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)多克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司，兔抗大鼠III型β微管蛋白(Class IIIβ-Tubulin，Tujl)单克隆抗体购自碧云天生物技术研究所；二抗：异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的羊抗小鼠IgG、Cy3标记的羊抗小鼠IgG、Cy3标记的羊抗兔IgG购自碧云天生物技术研究所；4’，6-二脒基-2-苯吲哚(4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)购自碧云天生物技术研究所。
3、细胞培养基
DMEM/F12基础培养液：取制备DMEM/F12基础培养液1L用量的DMEM/F12(1∶1)干粉1袋、谷氨酰胺2.5g，用浓度为0.1mol/L、pH值为7.35的磷酸盐缓冲液即PBS溶解并稀释至1L，调节PH值为7.5，用0.2um微孔滤膜过滤除菌，即得；
DMEM/F12无血清培养基：在DMEM/F12基础培养液中加入B27、bFGF、EGF至B27最终体积百分浓度为2％、bFGF终浓度为20ng/ml、EGF终浓度为20ng/ml，即得。
TWS119诱导培养基：分别在70ml DMEM/F12基础培养液中加入TWS119，溶解后用0.2um微孔滤膜过滤除菌后，加入胎牛血清10ml、青霉素与链霉素的混合液(由浓度为4万U/ml的青霉素溶液、浓度为4万U/ml的链霉素溶液按1∶1混合而成)1ml，最后用DMEM/F12基础培养液定容至100ml，TWS119的最终浓度分别为：200nM，300nM，350nM，400nM和500nM，胎牛血清最终浓度为10％。
二、实验方法与结果
1、NSCs的分离、培养与鉴定
方法：将新生48小时内的SD乳大鼠用体积百分浓度为75％的乙醇溶液消毒，脱颈椎处死后，无菌条件下打开颅腔，于解剖显微镜下剥离脑膜分离出海马，置D-Hank’s溶液中剪切成大小约为0.5mm3的细小组织块，滴管反复吹打，再经200目铜网过滤后离心，细胞沉淀重悬于DMEM/F12无血清培养基，台盼蓝染色后进行活细胞计数；
按细胞密度为1x 106细胞/ml将细胞接种于75ml培养瓶中，置温度37℃，体积浓度为5％的CO2培养箱中悬浮培养，当原代克隆球形成后用机械分离法制作单细胞悬液，再按细胞密度为5x 105细胞/ml进行传代培养，每隔3天半量更换培养液1次，每隔7～8天机械分离克隆球并传代培养1次；
将经过传代所形成的NSCs克隆球接种于预先涂布有多聚赖氨酸的载玻片上，继续培养4小时使其贴壁后进行Nestin免疫荧光染色，观察NSCs特异性抗原Nestin的表达情况。免疫荧光染色方法为：取上述贴壁克隆球，用质量百分浓度为4％的多聚甲醛溶液固30分钟，用浓度为0.1mol/L的PBS洗涤3次，加入一抗：小鼠抗大鼠Nestin单克隆抗体(稀释度为1∶100)，于室温下孵育6小时，PBS洗涤3次，加入二抗：Cy3标记的羊抗小鼠IgG(稀释度为1∶150)，于室温下孵育50分钟，PBS洗涤3次，甘油缓冲液(由甘油9份和浓度为0.1mol/L的PBS 1份组成)封片，激光共聚焦显微镜进行检查。
结果：原代细胞取材之后，培养24小时可见克隆开始形成，3～4天克隆形态已较为丰满规则，7～8天克隆球已需要传代。克隆球Nestin免疫荧光染色鉴定结果见图1，其中A为传代克隆球Nestin免疫荧光染色，x 100；B为原代克隆球，x 100；从图可见传代克隆球呈Nestin抗原强阳性。
2、TWS119作为诱导剂诱导NSCs向神经元分化的能力
方法：取传代培养的NSCs克隆，用TWS119浓度分别为200nM，300nM，350nM，400nM和500nM的诱导培养基，按细胞密度为5x 105细胞/ml接种于预先置有多聚赖氨酸涂层盖玻片的12孔板内，作为5个实验组，同时设对照组I(按照TWS119诱导培养基配制方法制备培养基，但不加入TWS119)及对照组II(用体积百分浓度为10％的胎牛血清溶液代替TWS119诱导培养基)，每组设3个复孔，置温度37℃，体积浓度为5％的CO2培养箱中培养，于培养10天后采用免疫荧光染色和流式细胞术检测各组NSCs分化为神经元的比例。
免疫荧光染色方法为前述常规方法，不同之处在于：以兔抗大鼠Tujl单克隆抗体(稀释度为1∶200)为一抗标记神经元，对应二抗为Cy3标记的羊抗兔IgG(稀释度为1∶200)；以小鼠抗大鼠GFAP多克隆杭体(稀释度为1∶100)为一抗标记星形胶质细胞，对应二抗为FITC标记的羊抗小鼠IgG(稀释度为1∶150)；用DAPI标记细胞核；采用激光共聚焦显微镜进行检测，每组随机计数5个视野下Tujl阳性和GFAP阳性细胞数，并计算其占总细胞数的比例。
流式细胞术检测方法为：每组收集5x 104个细胞，用质量百分浓度为4％的多聚甲醛溶液固定30分钟后，加入一抗：兔抗大鼠Tujl单克隆抗体(稀释度为1∶150)，于室温下孵育1小时，用浓度为0.1mol/L的PBS洗涤3次，加入二抗：FITC标记的羊抗兔IgG(稀释度为1∶100)，于室温下孵育45分钟，PBS洗涤3次后，采用流式细胞仪检测；对照组I和对照组II用PBS代替一抗，其余方法相同。
结果：对照组II分化细胞免疫荧光染色鉴定结果见图2，其中A为NSCs分化状态，x 400；B～D为NSCs分化后的免疫荧光染色，B为GFAP免疫荧光染色；C为Tujl免疫荧光染色；D为GFAP与Tujl双标免疫荧光染色。从图2可见，分化条件下培养10天后，绝大部分细胞呈Tujl阳性或GFAP阳性。各组NSCs分化为Tujl阳性、GFAP阳性细胞的比例见表1，结果显示TWS119诱导组除浓度为200nM组外，其余各浓度组Tujl阳性细胞比例均较对照组II有所提高，其中浓度为350nM组与对照组II有显著差异(P＜0.05)。
表1、各组NSCs分化为Tujl阳性、GFAP阳性细胞的比例
Figure BSA00000584356200061
浓度为350nM的TWS119诱导NSCs向神经元分化的免疫荧光染色鉴定结果见图3，其中A～D为对照组II，E～H为浓度为350nM的TWS119诱导组；A～H均为DAPI染色；同时，B与F行Tujl免疫荧光染色；C与G行GFAP免疫荧光染色；D与H行GFAP与Tujl双标免疫荧光染色。从图3可见，用浓度为350nM的TWS119诱导后显著提高了NSCs向Tujl阳性细胞分化的比例。
为进一步明确浓度为350nM的TWS119对NSCs分化能力的影响，采用流式细胞术检测NSCs向Tujl阳性细胞分化比例，重复检测3次，结果分别为28.7％、19.2％、23.4％，均值为23.8％，而对照组II结果分别为9.8％、10.1％、11.6％，均值为10.5％，二者有统计学差异(P＜0.05)，显示浓度为350nM的TWS119诱导显著提高了NSCs向Tujl阳性细胞的分化，与免疫荧光染色鉴定结果相符。尽管通过参照本发明的优选实施例，已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其做出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims (10)

1.TWS119(4，6-二取代吡咯[2，3-d]嘧啶)作为诱导哺乳动物神经干细胞向神经元分化的诱导剂的新应用。
2.诱导哺乳动物神经干细胞向神经元分化的细胞培养基，其特征在于：所述细胞培养基中含有诱导剂TWS119。
3.根据权利要求2所述的诱导哺乳动物神经干细胞向神经元分化的细胞培养基，其特征在于所述细胞培养基中含有浓度为200～500nM的诱导剂TWS119。
4.根据权利要求3所述的诱导哺乳动物神经干细胞向神经元分化的细胞培养基，其特征在于所述细胞培养基中含有浓度为350nM的诱导剂TWS119。
5.根据权利要求2、3、4之任一权利要求所述的诱导哺乳动物神经干细胞向神经元分化的细胞培养基，其特征在于所述细胞培养基中还含有胎牛血清。
6.根据权利要求5所述的诱导哺乳动物神经干细胞向神经元分化的细胞培养基，其特征在于所述细胞培养基中还含有体积百分浓度为5～20％的胎牛血清。
7.根据权利要求6所述的诱导哺乳动物神经干细胞向神经元分化的细胞培养基，其特征在于所述细胞培养基中还含有体积百分浓度为10％的胎牛血清。
8.权利要求2所述的诱导哺乳动物神经干细胞向神经元分化的细胞培养基的制备方法，包括以下步骤：
a.DMEM/F12基础培养液的制备：取制备DMEM/F12基础培养液1L用量的DMEM/F12(1∶1)干粉1袋、谷氨酰胺2.5g，用浓度为0.1mol/L、pH值为7.35的磷酸盐缓冲液即PBS溶解并稀释至1L，调节pH值为7.5，用0.2um微孔滤膜过滤除菌，即得；
b.细胞培养基的制备：按照制备100ml细胞培养基计，将诱导剂TWS119(200～500nM)加入步骤a制得的DMEM/F12基础培养液70ml使溶解，用0.2um微孔滤膜过滤除菌后，加入胎牛血清5～20ml、青霉素与链霉素的混合液(即由浓度为4万U/ml的青霉素溶液、浓度为4万U/ml的链霉素溶液按1∶1混合而成)的溶液1ml，最后用DMEM/F12基础培养液定容至100ml，即得。
9.根据权利要求8所述的诱导哺乳动物神经干细胞向神经元分化的细胞培养基的制备方法，其特征在于步骤b中诱导剂TWS119的终浓度为350nM。
10.根据权利要求9所述的诱导哺乳动物神经干细胞向神经元分化的细胞培养基的制备方法，其特征在于步骤b中诱导剂TWS119的终浓度为350nM，胎牛血清的加入量为10ml。
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