CN100478441C - 一种干细胞分离液及其用于干细胞分离的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及干细胞分离和纯化的领域，尤其是涉及一种干细胞分离液及其用于干细胞分离的方法。本发明所述的一种干细胞分离液，按重量份数包括以下组分：泛影葡胺0-10份，羟甲基纤维素0-10份，氯化铯0-1.0份，聚蔗糖0-10份；由以下方法制备浓缩液：将上述成分混合，加入0.01mol/L磷酸盐缓冲液配成所述的干细胞分离液的浓缩液；由以下方法制备工作液：将所述的浓缩液用0.01mol/L磷酸盐缓冲液稀释至所需的比重，比重范围为1.080-1.120g/ml。与现有的常规密度梯度离心方法相比，利用本发明所述的干细胞分离液，对于各种干细胞的分离效果均有明显的提高。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞分离和纯化的领域，尤其是涉及一种干细胞分离液及其用于干细胞分离的方法。
背景技术
美国Thomson和Gearhart两实验室于1998年分别报道人体胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)和胚胎生殖干细胞(Embryonic germ cell，EG细胞)建系成功，启迪和激起人们对ES细胞及其定向分化的研究的热情。这一科技成就将成为新近的最具发展和应用前景的研究领域。近年来干细胞的研究使人们看到了新的希望。干细胞是正常人体内存在的细胞群体，具有高度自我复制和高度的分化能力。随着研究的深入，人们发现利用干细胞可再生各种组织器官，如肝脏、胰腺、神经组织、骨骼、肌腱等。
ES细胞也称多能干细胞，是从早期哺乳类动物胚胎或原始生殖细胞中分离的具有发育全能性的细胞系，ES细胞具有自我更新能力和高度增殖以及多向分化的潜能，可以定向诱导分化为几乎所有种类的细胞，甚至可以形成复杂的组织和器官，其建系体外扩增，定向诱导分化、调控机制、细胞性能、组织重构等方面的研究将在发育生物学、细胞及组织的分化、基因功能、药物开发、细胞治疗和组织细胞替代治疗等领域发挥重要作用，并将成为细胞组织和器官移植的新资源。
ES细胞具有潜在的医学研究价值：(1)它是基因功能研究的有效手段。ES细胞具有种系传递功能，根据同源基因重组的原理，可利用基因打靶技术进行遗传操作，实现动物基因组内指定基因的失活或替代，可以研究人体重要基因的功能或在生物体内特定部位表达重组的目的基因和蛋白质药物。(2)有可能成为今后细胞替代疗法和组织，器官移植的最佳来源，ES细胞定向诱导分化成各种有临床应用价值的组织细胞是目前最受人们关注的研究热点。
目前，在干细胞领域研究最多和最清楚的仍是造血干细胞(hematopoieticstem cells，HSC)，HSC在基础与临床应用研究现仍处干细胞的最前沿，并不断为其它干细胞研究提供理论和实践的指导和依据。
干细胞可分为长期亚群和短期亚群，长期亚群具有无限的自我更新能力，在个体中持续终生，短期亚群自我更新能力有限，如短期HSC的自我更新能力仅维持8周左右；根据分化功能不同，干细胞分为全能性干细胞、多能性干细胞和单能性干细胞，个体形成中最早的干细胞为全能性干细胞，包括受精卵及胚泡的内细胞团。全能性干细胞进一步形成原始的生殖干细胞及体干/祖细胞，并最终分化形成各种组织细胞。
骨髓移植，HSC细胞可以扩增约100倍，尽管用饲养层细胞可以长期培养HSC细胞，但其扩增能力同体内相比是不可同日而语。因此，研究人员采用了一系列的方法而促进体外增培养中HSC细胞扩增或获得永生细胞系，如信号途径的基因干预，信号分子，转录分子等，但其结果却不理想，要么扩增不成功，要么导致类白血病的产生。
鉴于干细胞在体外扩增的局限性和成瘤性，目前一般采用原代的干细胞进行临床试验。虽然胚胎干细胞更具有全能性，理论上可生成任何组织，容易分化为一些组织如心脏等，但胚胎干细胞诱导分化的细胞和组织若用于病人的细胞和组织替代性治疗，相当于异体移植，存在免疫排斥的问题，而且胚胎干细胞能否分化为肿瘤样的组织，尚是个未知数。成体干细胞可取自于病人的自身组织如骨髓和外周血等，定向诱导分化后移植回给病人，不存在免疫排斥的问题。因此，成体干细胞在临床应用方面可能有更广阔的前景。
因来源和分离的原因，现阶段临床应用的干细胞主要有成人骨髓间充质干细胞和造血干细胞，人外周血干细胞，人胚胎来源的干细胞和脐带血造血干细胞及胎盘或脐带间充质干细胞。按HSC来源分为：骨髓移植(BMT)、外周血造血干细胞移植(PBSCT)、脐带血干细胞移植、纯化的CD34+细胞移植、胎肝HSCT。按免疫遗传学分为：异基因干细胞移植、同基因干细胞移植、自体干细胞移植。
目前，分离干细胞的方法主要有以下四种：
一、贴壁分离法。该法主要利用干细胞具有在塑料培养瓶中贴壁生长的特性将干细胞与其它细胞相分离，这种分离方法分离细胞有限，且干细胞极易分化，因而影响其临床应用价值。而且，分离得到的贴壁细胞中除了有干细胞外，同时含有贴壁的成纤维细胞，从形态上二者相似不易区分。
二、流式细胞分选法。该法是根据干细胞体积小、相对缺少颗粒的特性对其加以分离。
三、免疫磁珠法。该法是根据免疫学原理，利用包备有抗体的磁珠与干细胞表面的一些特殊标志如CD34特异结合，通过一定强度磁场时被滞留而分选。
采用流式细胞分选法或免疫磁珠法分离得到的干细胞纯度较大，但所获细胞数量极少，且易造成细胞损伤，细胞存活率极低。
四、密度梯度离心法。该法是根据干细胞与其它细胞的密度不同，实验证明间质干细胞位于低密度细胞层。所采用的常用梯度分离液有Percoll和Ficoll，Ficoll法或Peroll法可有效地将造血干细胞从骨髓中分离出来，且纯度较高，细胞存活好。但是，用Ficoll分离的细胞中常混有其它的细胞(如成纤维细胞、骨髓或血液中的非单个核细胞)。
上述方法多用于分离骨髓间质干细胞，而目前的实验表明，用上述方法都无法从人类、鼠胎肝中有效地分离出肝干细胞。
我们在实践中发现，用淋巴细胞分离液、Ficoll法或Peroll法无法从人类、鼠胎肝中有效地分离出肝干细胞，经提高干细胞分离液的比重，可有效地分离出肝干细胞，并将其用于神经干细胞和造血干细胞，也获得了很好的效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种干细胞分离液，可通过调整该分离液中组分的含量来提高分离液的比重，以达到分离特定的干细胞并提高干细胞数量和纯度的目的。
本发明所述的一种干细胞分离液，按重量份数包括以下组分：泛影葡胺0-10份，羟甲基纤维素0-10份，氯化铯0-1.0份，聚蔗糖0-10份；由以下方法制备浓缩液：将上述成分混合，加入0.01mol/L磷酸盐缓冲液配成所述的干细胞分离液的浓缩液；由以下方法制备工作液：将所述的浓缩液用0.01mol/L磷酸盐缓冲液稀释至所需的比重，比重范围为1.080-1.120g/ml。
优选的，所述的泛影葡胺为3份。
优选的，所述的羟甲基纤维素为2份。
优选的，所述的氯化铯为0.2份。
优选的，所述的聚蔗糖为3份。
本发明所述的干细胞分离液采用泛影葡胺、羟甲基纤维素、氯化铯、聚蔗糖等能提高分离液比重的成分，可配成成型的干粉或液体，用于实验室操作或临床干细胞的试验研究和临床应用。本发明所述的干细胞分离液可用于骨髓干细胞、肝干细胞、脐血干细胞、神经干细胞及相应的人类或动物不同组织干细胞的分离纯化。
本发明的另一目的是提供将所述的干细胞分离液用于干细胞分离的方法，其原理是根据干细胞与红细胞、淋巴细胞和成熟组织细胞的比重不同，通过提高干细胞分离液的比重来达到分离干细胞的目的。
本发明所述的干细胞分离液用于肝干细胞分离的方法，包括以下步骤：
A)鼠胚肝细胞的制备：取12-14日龄的鼠胚，将肝脏剪碎，置0.06％IV型胶原酶溶液中，37℃下振荡消化30分钟；
B)过滤，在0-4℃下以200r/min离心10分钟，倾去上清液，用F12培养液悬浮细胞，得细胞悬液；
C)按细胞悬液∶分离液体积比为1∶2的比例将细胞悬液加入到所述的干细胞分离液的最上层，于0-4℃下以1000r/min离心10分钟；
D)吸取第二层细胞，该层为肝干细胞层，用Hanks液洗细胞1-3次；
E)0-4℃以1000r/min离心15分钟，弃上清液；将细胞团沉淀悬浮于培养液中，台盼蓝染色，计算活细胞率；
F)用肝干细胞培养基进行培养并进行观察和肝干细胞染色。
本发明所述的干细胞分离液用于哺乳动物骨髓干细胞分离的方法，包括以下步骤：
A)骨髓的采集：按常规方法抽取哺乳动物骨髓；
B)将骨髓加入磷酸盐缓冲液PBS中轻匀，按细胞悬液∶分离液体积比为2∶1的比例将细胞悬液加入到所述的干细胞分离液中；
C)常温离心机中以1500r/min进行密度梯度离心15分钟；
D)小心吸取富含有核细胞的中间细胞层；
E)将获取的单个核细胞加入到含10％小牛血清的高糖DMEM培养基中，接种于培养瓶内中，在37℃、5％CO2孵育箱连续培养并适时观察。
本发明所述的干细胞分离液用于人骨髓干细胞分离的方法，包括以下步骤：
A)骨髓的采集：采集临床志愿者髂骨内骨髓，按临床常规骨髓穿刺操作取得红骨髓；
B)将骨髓加入磷酸盐缓冲液PBS中轻匀，按细胞悬液∶分离液体积比为2∶1的比例将细胞悬液加入到所述的干细胞分离液中，低温离心机0-4℃以1500r/min进行密度梯度离心15分钟；
C)小心吸取富含有核细胞的中间细胞层；
D)将获取的单个核细胞加入到含10％小牛血清的高糖DMEM培养基中，接种于培养瓶内中，在37℃、5％CO2、饱和湿度孵育箱连续培养并适时观察。
本发明所述的干细胞分离液用于脐血干细胞分离的方法，包括以下步骤：
A)按常规方法抽取健康足月顺产新生儿脐带血，按细胞悬液∶分离液体积比为1∶2的比例将细胞悬液缓慢加入所述的干细胞分离液中；
B)常温离心机20℃以2500r/min离心15分钟；
C)离心管中液体分为四层，吸取血清层和分离层之间的呈白色云雾状的有核细胞层；
D)以磷酸盐缓冲液PBS洗涤，800r/min常温离心4分钟；
E)弃上清，加入培养基充分吹打混匀制成单细胞悬液，接种至培养瓶，在37℃、5％CO2、饱和湿度孵箱中连续培养并适时观察。
与现有的常规密度梯度离心方法相比，利用本发明所述的干细胞分离液，对于各种干细胞的分离效果均有明显的提高，见以下实施例的具体分析。所得的干细胞可用于人类各种干细胞领域的技术研究和肝病、糖尿病、动脉粥样硬化及心、脑疾病等各种相关疾病的治疗。
附图说明
图1为用淋巴细胞分离液分离所得的细胞，40×10倍(显微镜下)；
图2为用干细胞分离液分离所得的细胞，40×10倍(显微镜下)。
具体实施方式
实施例一：干细胞分离液的配制
一、材料
1、泛影葡胺(Sigma)、羟甲基纤维素(Sigma)、氯化铯(Sigma)、聚蔗糖(Ficoll400，phamacia)
2、磷酸二氢钾，氢氧化钠(广州化学试剂厂)
3、比重计(1.000-1.100、1.100-1.200)
二、方法
称取泛影葡胺3g、羟甲基纤维素2g、氯化铯0.2g、聚蔗糖3g。将上述组分依次加入100ml的量筒中，加0.01mol/L磷酸盐缓冲液至100ml，即得干细胞分离液的浓缩液。用比重计测得其比重为1.123g/ml。
使用时，将上述干细胞分离液的浓缩液用0.01mol/L磷酸盐缓冲液稀释至所需的比重，即为工作液。
本实施例所用的上述原料，主要以最终比重为限量，至于各种的用于增加比重的添加原料如泛影葡胺、羟甲基纤维素、氯化铯、聚蔗糖等的比例可以不一样。对各组份的具体比例也不加限定。通常，各组分的用量是一个范围：泛影葡胺0-10份，羟甲基纤维素0-10份，氯化铯0-1.0份，聚蔗糖0-10份。并且，对上述用于增加比重的原料也可不予以限定，还可增加其它原料(如淀粉、聚乙二醇等)用于增加比重。
本实施例所配制的干细胞分离液将用于以下各分离实施例的实验。
实施例二：鼠肝干细胞的分离
本实施例利用实施例一所得的干细胞分离液。
一、材料
1、孕12-14天的BALB/C小鼠。
2、进口特级胎牛血清(fetal bovine serum，FBS，Gibco)、进口FBS和国产新生小牛血清(newborn calf serum，NCS；由杭州四季青生物工程材料研究所提供)。DMEM/F12(sigma)，非必需氨基酸(×100，Gibco)，人碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF，10ug，Gibco)，β-巯基乙醇(β-Mercaptoethanol，β-ME；Nacalai Tesoue INC Kyota，Japan)，牛血清白蛋白(BSA)，伴白蛋白(Conalbumin，Sigma)。四氯化碳(carbontetrachloride，CCI4)、D-氨基半乳糖(D-galactosamine，D-Galn)。
3、肝干细胞培养基：5％FBS(国产或进口)，10％国产NCS，0.14mM的β-ME，40ng.ml-1伴白蛋白，10ng.ml-1的人bFGF，1％非必需氨基酸的DMEM/F12培养基。
4、快蓝BB盐(Fast blue BB salt，Sigma，Lot No 118H5081)和萘酚-AS-MX(Naphthol ASMX phosphate，Sigma，Lot No 20K5227)。
5、C34，OV6等的抗体及免疫组化检测试剂盒，LSAB免疫组化检测试剂盒。
6、淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)，比重为1.076g/ml。
二、方法
1、鼠胚肝细胞的制备：取鼠胚(12-14日龄)，将肝脏剪碎，置0.06％IV型胶原酶溶液中，37℃下振荡消化30分钟。
2、过滤。在0-4℃下，以200r/min离心10分钟。倾去上清液，用F12培养液悬浮细胞。
3、将干细胞分离液浓缩液(实施例一)配成比重为1.120、1.096、1.091、1.086和1.080的肝干细胞离心液(工作液)，将2ml细胞悬液置于4ml肝干细胞分离液的最上层。同时于将2ml细胞悬液置于另一管4ml淋巴细胞分离液(比重为1.076)的最上层。0-4℃下，以1000r/min离心10分钟。
4、小心吸取第二层细胞，该层为肝干细胞层。用Hanks洗细胞2次。细胞计数。
5、离心(1000r/min)，弃上清液。将细胞团重悬浮于培养液中，台盼蓝染色，拒染细胞为活细胞，计算活细胞率。
6、将细胞用肝干细胞培养基稀释，细胞数为1×105个/ml，用Castar 24孔板进行培养，内置盖玻片，用于碱性磷酸酶和C34、OV6等的免疫组化染色。
三、结果
1、细胞生长情况观察：鼠胚肝细胞在肝干细胞培养液中能贴壁生长，约在第三天能长出干细胞团。肝干细胞集落，细胞小，排列紧密，界限不清，集落呈团状或鸟巢状生长。经碱性磷酸酶和C34，OV6等的免疫组化染色证实为肝干细胞团。
2、不同比重干细胞分离液所获细胞数见表1。
表1：不同比重干细胞分离液分离肝细胞所获细胞数
| 分离液比重(g/ml) | 1.076 | 1.080 | 1.086 | 1.091 | 1.096 | 1.120 |
| 细胞总数(10<sup>5</sup>个/ml) | 1.2 | 1.6 | 1.8 | 5.4 | 8.6 | 12.6 |
结果显示，比重为1.120的分离液所获细胞数最多，经细胞涂片、瑞氏染色和显微镜下观察为淋巴细胞、肝细胞和部分红细胞。
3、不同比重干细胞分离液所获细胞在肝干细胞培养基中生成肝干细胞团的数量见表2。
表2：不同比重干细胞分离液所得细胞形成肝干细胞团的数量
| 分离液比重(g/ml) | 1.076 | 1.080 | 1.086 | 1.091 | 1.096 | 1.120 |
| 肝干细胞团数(个/cm<sup>2</sup>) | 0 | 2-3 | 5-10 | 20 | 52 | 123 |
结果显示，经碱性磷酸酶和C34、OV6等的免疫组化染色证实，比重为1.120的分离液所获肝干细胞团数最多。
四、结论
采用比重为1.081-1.120的干细胞分离液均可成功分离胎鼠肝中的肝干细胞，其中，比重为1.120的干细胞分离液的分离效果最好。
实施例三：猪骨髓干细胞的分离
本实施例利用实施例一所得的干细胞分离液。
一、材料
1、设备：超净工作台，水平离心机，倒置显微镜和普通显微镜。离心管和平衡天平，骨髓穿剌针和采血袋。流式细胞仪，干燥箱，手套和手术衣。
2、试剂：泛影葡胺(Sigma公司)，羟甲基纤维素(Sigma公司)，氯化铯(Sigma公司)，聚蔗糖(Ficoll-400，Phamacia公司)，磷酸二氢钾、氢氧化钠(均为广州化学试剂厂)，罗丹明123(Sigma公司)。
3、BD Procount progenitor Cell Enumeration Kit(BD公司，干细胞计数试剂盒，批号：NO.340498)。
4、淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)，比重为1.076g/ml。
5、细胞培养基：含10％小牛血清的高糖DMEM培养基(Gibco公司)。
6、实验用的试验猪均为雌性，体重10kg，由广州市芳村屠宰场提供。
二、方法
1、实验猪进行骨髓抽取手术，其步骤如下：
按每公斤实验猪体重使用30mg/kg量的戊巴比妥钠，对实验猪进行腹腔麻醉，对所有手术器械进行高压灭菌，手术间紫外消毒，用电推剪将实验猪腿部体表的毛发剪去，用75wt％酒精对实验猪进行体表消毒，铺巾，利多卡因局部麻醉后抽取猪髂骨内骨髓30ml。
2、骨髓成功抽取后按以下方法分离猪骨髓细胞：
将骨髓加入到磷酸盐缓冲液(PBS)中轻匀，常温离心机中以1500r/min离心15分钟，弃上清，将沉淀物用磷酸盐缓冲液(PBS)轻轻悬浮，得细胞悬液。
将干细胞分离液浓缩液(实施例一)配成比重为1.080、1.083、1.086、1.089和1.092的肝干细胞离心液(工作液)。
将细胞悬液按2∶1比例缓慢加入上述不同比重的干细胞分离液和淋巴细胞分离液(比重为1.076)中，20℃以2500r/min离心10分钟。离心管中液体分为四层，小心吸取富含有核细胞的中间细胞层，以PBS洗涤，800r/min常温离心4分钟。细胞计数。胎盘蓝染色，活细胞计数。瑞氏染色和有核细胞分析。
3、将获取的细胞加入到特殊的DMEM培养基中，接种于50mL培养瓶内中。在37℃饱和湿度条件下，5％CO2孵育箱中连续培养并适时观察。
4、用罗丹明拒染实验鉴定猪骨髓干细胞
罗丹明染色步骤如下：新鲜分离的细胞以1×106接种在培养板上培养2小时，加入1μg罗丹明123，37℃孵育1小时后，用PBS洗去细胞外罗丹明123，流式细胞仪观察罗丹明123在细胞内的分布情况。
5、用干细胞计数试剂盒和流式细胞仪鉴定猪骨髓干细胞
将新鲜分离的细胞加入Eppendoff管(106细胞/管)，以1500rpm转速离心5分钟，PBS洗1次，加入冷丙酮1ml，0-4℃固定8分钟；离心，弃上清后加入一抗(CD34、CD45)，混匀后37℃反应45分钟，1500rpm转速离心10分钟，PBS洗3次，离心弃上清后加入带二抗标记的IgG，混匀后37℃反应30分钟，PBS洗涤两次，离心后视沉淀物的量加入PBS，制备成细胞悬液，流式细胞仪进行检测。
三、结果
1、各种分离液所得细胞经胎盘蓝染色显示，细胞存活率均达90％以上，均未显示对猪骨髓细胞有毒性作用。细胞计数：
计算公式：
注：本实验中，每离心管所加骨髓血量为5ml。
经计算后细胞计数结果如表3所示：
表3：干细胞分离液分离猪骨髓细胞所获细胞数
| 管号 | 干细胞分离液比重(g/ml) | 每ml骨髓所获细胞数(×10<sup>6</sup>) |
| 1 | 1.076 | 0.48 |
| 2 | 1.080 | 0.60 |
| 3 | 1.083 | 1.20 |
| 4 | 1.086 | 2.00 |
| 5 | 1.089 | 2.80 |
| 6 | 1.092 | 2.80 |
管1为淋巴细胞分离液。
管2-6为本发明所述的干细胞分离液(配制方法见实施例一)。
结果显示：比重为1.092的干细胞分离液所得的细胞数比淋巴细胞分离液的细胞数多5倍。
2、用瑞氏染色法鉴定，淋巴细胞分离液获得的细胞主要为淋巴细胞，细胞核较大(如图1所示)，而用干细胞分离液分离所得细胞主要为干细胞，细胞小，如红细胞大小，核染色深，胞质很少(如图2所示)。
3、罗丹明123拒染试验结果
根据干细胞不主动吸收荧光染料罗丹明123的特点，可用罗丹明123拒染试验鉴定骨髓血中的干细胞。
用不同比重干细胞分离液分离猪骨髓细胞中罗丹明123拒染细胞的比例见表4。
表4：干细胞分离液分离猪骨髓细胞罗丹明123拒染细胞比例
| 管号 | 干细胞分离液比重(g/ml) | 所获拒染细胞比例(％) |
| 1 | 1.076 | 0.43 |
| 2 | 1.080 | 1.12 |
| 3 | 1.083 | 2.13 |
| 4 | 1.086 | 2.43 |
| 5 | 1.089 | 2.62 |
| 6 | 1.092 | 5.18 |
管1为淋巴细胞分离液。
管2-6为本发明所述的干细胞分离液(配制方法见实施例一)。
结果显示：用比重为1.092的干细胞分离液所得的罗丹明123拒染细胞比例为5.18％，而淋巴细胞分离液所得细胞罗丹明拒染细胞仅为0.43％。比重为1.092的干细胞分离液所得的罗丹明123拒染细胞数为淋巴细胞分离液所得细胞罗丹明拒染细胞的12倍。
4、用干细胞标志试剂盒和流式细胞仪鉴定猪骨髓干细胞的结果
干细胞标志试剂盒主要用于鉴定骨髓造血干细胞，其中CD34用于标志造血干细胞，CD45用于标志淋巴细胞，PI主要用于标志有核细胞。
经流式细胞仪测定，经干细胞分离液所得细胞悬液中CD34、CD45和有核细胞比例见表5。
表5：干细胞分离液分离猪骨髓细胞各种标志的细胞比例
| 管号 | 干细胞分离液比重(g/ml) | 有核细胞比例(％) | CD34+细胞比例(％) | CD45+细胞比例(％) |
| 1 | 1.076 | 52.31 | 0.05 | 45.8 |
| 2 | 1.080 | 45.35 | 0.57 | 41.57 |
| 3 | 1.086 | 44.58 | 0.69 | 40.96 |
管1为淋巴细胞分离液。
管2-3为本发明所述的干细胞分离液(配制方法见实施例一)。
结果提示：用比重为1.086的干细胞分离液所得的CD34阳性细胞数比淋巴细胞分离液所得的CD34阳性数多12倍。
5、细胞经培养1-7天，在相差显微镜观察，结果如下：新鲜分离的的骨髓单个核细胞呈圆球状分散悬浮于培养液中，有少量造血细胞。换液去除非黏附细胞后，留下来的细胞的形态大多和骨髓基质细胞接近，贴壁生长，呈梭形。
非黏附细胞经离心换液，继续培养7天，可见成团细胞生长。其中以干细胞分离液所得的细胞，细胞成团生长活跃。
四、结论
采用本发明所述的干细胞分离液(比重为1.081-1.092)均可成功分离猪骨髓干细胞。该干细胞分离液所得骨髓细胞数比淋巴细胞分离液多5倍，而CD34+细胞比例增加13.6倍，两者相乘，干细胞分离液所得的干细胞数为淋巴细胞分离液所得干细胞数的80倍。说明该干细胞分离液能有效地分离和富集骨髓血中的干细胞。
实施例四：干细胞分离液对骨髓干细胞分离回收率的影响
本实施例测定干细胞分离液对骨髓血中有核细胞回收率。
本实施例利用实施例一所得的干细胞分离液。
一、材料
1、设备：超净工作台，水平离心机，普通显微镜。离心管，骨髓穿剌针和采血袋。
2、试剂：泛影葡胺(Sigma公司)，羟甲基纤维素(Sigma公司)，氯化铯(Sigma公司)，聚蔗糖(Ficoll-400，Phamacia公司)，磷酸二氢钾、氢氧化钠(均为广州化学试剂厂)。
3、淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)，比重为1.076g/ml。
4、细胞培养基：含10％小牛血清的高糖DMEM培养基(Gibco公司)。
5、实验用的试验猪为雌性，体重10kg，由广州市芳村屠宰场提供。
二、方法
1、实验猪进行骨髓抽取手术，其步骤如下：
按每公斤实验猪体重使用30mg/kg量的戊巴比妥钠，对实验猪进行腹腔麻醉，对所有手术器械进行高压灭菌，手术间紫外消毒，用电推剪将实验猪腿部体表的毛发剪去，用75wt％酒精对实验猪进行体表消毒，铺巾，利多卡因局部麻醉后抽取猪髂骨内骨髓30ml。
2、将骨髓血加入到磷酸盐缓冲液(PBS)中轻匀，常温离心机中以1500r/min离心15分钟，弃上清，将沉淀物用磷酸盐缓冲液(PBS)轻轻悬浮，细胞悬液按2∶1比例缓慢加入到比重为1.12的干细胞分离液中，20℃以2500r/min离心10分钟。离心管中液体分为四层，小心吸取富含有核细胞的中间细胞层，以PBS洗涤，800r/min常温离心4分钟。
3、将沉淀物再用15ml磷酸盐缓冲液(PBS)轻轻悬浮，细胞计数。将干细胞分离液浓缩液(实施例一)配成比重为1.080、1.083、1.086、1.089和1.092的肝干细胞离心液(工作液)。将细胞悬液按2∶1比例缓慢加入到上述不同比重的干细胞分离液和淋巴细胞分离液中，每管加细胞悬液2ml，20℃以1500r/min离心10分钟后，用2mlPBS收集管底细胞，细胞计数，计算细胞损失率。瑞氏染色和有核细胞分析。
三、结果
1、不同比重干细胞分离液对骨髓有核细胞回收率的影响(表6)
回收率＝(悬液细胞数-管底细胞数)/所加细胞悬液细胞数×100％
表6：干细胞分离液对猪骨髓细胞回收率的影响
| 管号 | 干细胞分离液比重(g/ml) | 回收率(％) |
| 1 | 1.076 | 46 |
| 2 | 1.080 | 54 |
| 3 | 1.083 | 61 |
| 4 | 1.086 | 68 |
| 5 | 1.089 | 85 |
| 6 | 1.092 | 96 |
管1为淋巴细胞分离液
管2-6为本发明所述的干细胞分离液(配制方法见实施例一)
2、管底细胞涂片检查，主要为小核细胞，细胞数随干细胞分离液的比重增加而减少，至比重为1.089和1.092的干细胞分离液的管底有核细胞很少见。
四、结论
采用本发明所述的干细胞分离液可有效地提高骨髓造血干细胞的回收率。
实施例五：人骨髓干细胞的分离
本实施例利用实施例一所得的干细胞分离液。
一、材料
1、设备：超净工作台，水平离心机，倒置显微镜和普通显微镜。离心管和平衡天平，骨髓穿剌针和采血袋。流式细胞仪，干燥箱，手套和手术衣。
2、试剂：泛影葡胺(Sigma公司)，羟甲基纤维素(Sigma公司)，氯化铯(Sigma公司)，聚蔗糖(Ficoll-400，Phamacia公司)，磷酸二氢钾、氢氧化钠(均为广州化学试剂厂)。
3、细胞培养基：含10％小牛血清的高糖DMEM培养基(Gibco公司)。
4、淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)，比重为1.076g/ml。
二、方法
1、采集临床志愿者髂骨内骨髓，按临床常规骨髓穿刺操作每次取得红骨髓200ml。
2、将20ml骨髓加入到磷酸盐缓冲液(PBS)中轻匀，常温离心机中以1500r/min进行离心15分钟，弃上清，将沉淀物用磷酸盐缓冲液(PBS)轻轻悬浮，细胞悬液按2∶1比例缓慢加入到比重为1.089的干细胞分离液(配制方法见实施例一)和淋巴细胞分离液中，20℃以2500r/min离心10分钟。离心管中液体分为四层，小心吸取富含有核细胞的中间细胞层，以PBS洗涤，800r/min常温离心4分钟。细胞计数。胎盘蓝染色，活细胞计数。瑞氏染色和有核细胞分析。
3、用罗丹明拒染实验鉴定骨髓干细胞
罗丹明染色步骤如下：新鲜分离的细胞以1×106接种在培养板上培养2小时，加入1μg罗丹明123，37℃孵育1小时后，用PBS洗去细胞外罗丹明123，流式细胞仪观察罗丹明123在细胞内的分布情况。
三、结果
1、各种分离液所得细胞经胎盘蓝染色显示，细胞存活率均达90％以上，均未显示对骨髓细胞有毒性作用。细胞计数：
计算公式：
注：本实验中，每离心管所加骨髓血量为5ml。
经计算后细胞计数结果如表7所示：
表7：干细胞分离液分离骨髓细胞所获细胞数
| 管号 | 干细胞分离液比重(g/ml) | 每ml骨髓所获细胞数(×10<sup>6</sup>) |
| 1 | 1.076 | 0.24 |
| 2 | 1.089 | 1.80 |
管1为淋巴细胞分离液。
管2为本发明所述的干细胞分离液(配制方法见实施例一)。
结果显示：比重为1.089的干细胞分离液所得的细胞数比淋巴细胞分离液的细胞数多6倍。
2、用瑞氏染色法鉴定，淋巴细胞分离液获得的细胞主要为淋巴细胞，细胞核较大，而用干细胞分离液分离所得细胞主要为干细胞，细胞小，如红细胞大小，核染色深，胞质很少。
3、罗丹明123拒染试验结果
根据干细胞不主动吸收荧光染料罗丹明123的特点，可用罗丹明123拒染试验鉴定骨髓血中的干细胞。
用不同比重干细胞分离液分离骨髓细胞中罗丹明123拒染细胞的比例见表8。
表8：骨髓细胞罗丹明123拒染细胞比例
| 管号 | 干细胞分离液比重(g/ml) | 所获拒染细胞比例(％) |
| 1 | 1.076 | 0.16 |
| 2 | 1.089 | 3.62 |
管1为淋巴细胞分离液。
管2为本发明所述的干细胞分离液(配制方法见实施例一)。
结果显示：用比重为1.089的干细胞分离液所得的罗丹明123拒染细胞比例为3.62％，而淋巴细胞分离液所得细胞罗丹明拒染细胞仅为0.16％。比重为1.089的干细胞分离液所得的罗丹明123拒染细胞数为淋巴细胞分离液所得细胞罗丹明拒染细胞的22倍。
四、结论
采用本发明所述的干细胞分离液(比重为1.089)可成功分离人骨髓干细胞。该干细胞分离液所得骨髓细胞数比淋巴细胞分离液多6倍，而罗丹明123拒染细胞比例增加20倍，两者相乘，干细胞分离液所得的干细胞数为淋巴细胞分离液所得干细胞数的120倍。说明干细胞分离能有效地分离和富集人骨髓血中的干细胞。
实施例六：人的脐血干细胞的分离
本实施例利用实施例一所得的干细胞分离液。
一、材料
1、设备：超净工作台，水平离心机，倒置显微镜和普通显微镜。离心管和平衡天平，采血袋。
2、试剂：泛影葡胺(Sigma公司)，羟甲基纤维素(Sigma公司)，氯化铯(Sigma公司)，聚蔗糖(Ficoll-400，phamacia公司)，磷酸二氢钾、氢氧化钠(均为广州化学试剂厂)。
3、淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)，比重为1.076g/ml。
4、细胞培养基：含10％小牛血清的高糖DMEM培养基(Gibco公司)。
二、方法
采集健康足月顺产新生儿脐带血20ml。分别缓慢加入20ml淋巴细胞分离液和20ml自制的干细胞分离液(实施例一)之上，每管加10ml。20℃以1500r/min离心15分钟，离心管中液体分为四层，吸取血清层和分离层之间的白色云雾状有核细胞层。以PBS洗涤，800r/min常温离心4分钟，细胞计数。胎盘蓝染色，活细胞计数。瑞氏染色和有核细胞分析。
三、结果
两种分离液所得细胞经胎盘蓝染色显示，细胞存活率均达90％以上，均未显示对细胞有毒性作用。细胞计数：
计算公式：
注：本实验中，每离心管所加骨髓血量为10ml。
经计算后细胞计数结果如表9所示：
表9：干细胞分离液分离脐带血所获细胞数
| 管号 | 干细胞分离液比重(g/ml) | 每ml脐带血所获有核细胞数(×10<sup>5</sup>) |
| 1 | 1.076 | 0.85 |
| 2 | 1.083 | 3.46 |
管1为淋巴细胞分离液。
管2为本发明所述的干细胞分离液(配制方法见实施例一)。
四、结论
采用本发明所述的干细胞分离液(比重为1.083)均可成功分离脐带血干细胞。该干细胞分离液所得脐带血有核细胞数比淋巴细胞分离液多3倍。
Claims (6)
1、一种干细胞分离液，其特征在于，按重量份数包括以下组分：
泛影葡胺 0-10份，
羟甲基纤维素 0-10份，
氯化铯 0-1.0份，
聚蔗糖 0-10份；
由以下方法制备浓缩液：将上述成分混合，加入0.01mol/L磷酸盐缓冲液配成所述的干细胞分离液的浓缩液；
由以下方法制备工作液：将所述的浓缩液用0.01mol/L磷酸盐缓冲液稀释至所需的比重，比重范围为1.080-1.120g/ml。
2、根据权利要求1所述的干细胞分离液，其特征在于：所述的泛影葡胺为3份。
3、根据权利要求1所述的干细胞分离液，其特征在于：所述的羟甲基纤维素为2份。
4、根据权利要求1所述的干细胞分离液，其特征在于：所述的氯化铯为0.2份。
5、根据权利要求1所述的干细胞分离液，其特征在于：所述的聚蔗糖为3份。
6、一种用于配制根据权利要求1至5之一所述的干细胞分离液的干粉。
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