CN112430571A

CN112430571A - 一种标准化脐带血造血干细胞库的构建方法

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Publication number: CN112430571A
Application number: CN202011305672.5A
Authority: CN
Inventors: 邹清雁; 李时悦; 刘海霞; 杜少茵; 钟慧霖; 邹庆剑; 王斌; 吴志军; 丁先风; 梁海燕
Original assignee: Guangzhou Ctd Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Ctd Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-11-19
Filing date: 2020-11-19
Publication date: 2021-03-02

Abstract

本发明公开了一种标准化脐带血造血干细胞库的构建方法。本发明所述的标准化脐带血造血干细胞库的构建方法，包括以下步骤：用自制的干细胞分离液从脐带血中提取脐带血造血干细胞(CBHSC)，所述脐带血在提取前经过ABO/Rh血型、HLA分型、微生物学检测；将所获得的CBHSC进行相关质量检测，将符合质量标准的CBHSC用冷冻保护剂处理，分装于冻存管或冻存袋，进行梯度降温，按其ABO/Rh血型和HLA分型进行液氮冷冻保存，建立可供检索的CBHSC信息档案，即为标准化CBHSC库。相比于常规的脐带血库，采用本发明所述方法构建的标准化CBHSC库细胞复苏存活率高，造血重建功能较好，红细胞残存少，可提高干细胞移植的成功率，指导相关疾病的干细胞治疗方案的制定或干细胞药物的研究。

Description

一种标准化脐带血造血干细胞库的构建方法

技术领域

本发明涉及一种干细胞库的构建方法，尤其是涉及一种标准化脐带血造血干细胞(cord blood hematopoietic stem cells cell,CBHSC)库的构建方法。

背景技术

目前，干细胞治疗主要用于血液病的治疗，按细胞来源分类，可分为三类：骨髓造血干细胞移植(BoneMarrowtransplant，BMT)，外周血干细胞移植(MPST)和脐带血造血干细胞移植(UCBT)。脐带血作为造血干/祖细胞(HSCs/HPCs)的另一来源，已经应用于临床治疗多种恶性和非恶性血液疾病。脐带血中HSCs/HPCs的质与量是决定其临床应用效果的最重要因素。同时，脐带血中还存在多种非造血的干细胞和前体细胞，如间充质干细胞(MSCs)、内皮前体细胞(EPCs)和非限制性体干细胞(USSCs)等。

脐带血来自脐带和胎盘，通常在妇女分娩后扔掉，现存已知脐带血中含有丰富的造血干细胞，临床上发现UCBT比BMT更有优势，脐血干细胞的免疫原性更弱，即使供者和受体者存在1-2个位点差异，也不会发生严重的免疫排斥反应。

近三十年来，脐带血造血干细胞移植治疗血液病的成功(Gluckmanet al.NewEngl J med,1989,321:1174-1178)，极大地促进了脐血干细胞的应用和脐带血干细胞库的发展。至今，全世界脐血干细胞移植治疗白血病已有数万例，但脐血干细胞因数量较少而导致对体重大的成年人效果不太理想，原因是脐血量较少，约为100ml左右，CD34⁺细胞为0.5-5.0×10⁶，导致脐血干细胞造血重建功能较弱。

人们采用很多办法试图解决脐血干细胞数量较少而多发移植不成功的问题。如用2个或多个HLA位点相似脐血联合应用的混合移植，这可以增加一倍以上的脐血干细胞的数量，可临床实践表明，此方法并不能缩短病人无免疫细胞的时间，而且即使存活，也往往是一个配型的脐血造血干细胞形成造血优势，而另一个脐血细胞受到排斥。另一方法就是体外造血干细胞扩增，实验证明，采用各种干细胞剌激因子和适当的培养基可将造血干细胞扩增数万倍，但扩增的同时，干细胞也发生分化，临床应用结果表明，脐血干细胞扩增后其造血重建能力并未增强，对移植成功并无帮助。

目前，再生医学的迅速发展，干细胞悄然用于除血液病以外的疾病的治疗，如脑瘫，心脑血管疾病，糖尿病，骨质疏松，呼吸病，肾脏疾病和肝脏疾病等与细胞衰老相关的疾病，随着干细胞药物研究的兴起，对建立有高质量的标准化脐血干细胞库的需求和呼声也将越来越多。

发明内容

本发明的目的在于提供一种标准化脐带血造血干细胞库的构建方法，所构建的标准化脐带血造血干细胞库可用于指导制定临床干细胞治疗疾病方案或研究干细胞药物的应用。

本发明所述的标准化脐带血造血干细胞库的构建方法，包括以下步骤：

A.用干细胞分离液从脐带血中提取脐带血造血干细胞(CBHSC)，所述脐带血在提取前经过ABO/Rh血型、HLA分型、微生物学检测；

B.将所获得的CBHSC进行相关质量检测，将符合质量标准的CBHSC用冷冻保护剂处理，分装于冻存管或冻存袋，进行梯度降温，按其ABO/Rh血型和HLA分型进行液氮冷冻保存，建立可供检索的CBHSC信息档案，即为标准化CBHSC库。

根据本发明所述的标准化CBHSC库的构建方法的进一步特征，所述的干细胞分离液包括重量比为15：10：1：15的泛影葡胺、羟甲基纤维素、氯化铯和聚蔗糖。

根据本发明所述的标准化CBHSC库的构建方法的进一步特征，所述的质量标准包括：CD34和CD133细胞比例应大于1％，复苏后细胞数大于1.0×10⁸，细胞活率大于80％。

根据本发明所述的标准化CBHSC库的构建方法的进一步特征，所述冷冻保护剂是由5％-10％的DMSO、10％的右旋糖苷和80％-85％的DMEM培养基组成。

根据本发明所述的标准化CBHSC库的构建方法的进一步特征，所述冷冻保护剂是由5％-10％的DMSO、1％-5％的白蛋白和80％-85％的DMEM培养基组成。

根据本发明所述的标准化CBHSC库的构建方法的进一步特征，所述冷冻保存的条件为-86℃至-196℃的液氮；用冻存管分装的脐带血干细胞冷冻保存于液氮中；用冻存袋分装的脐带血干细胞冷冻保存于气相液氮中。

根据本发明所述的标准化CBHSC库的构建方法的进一步特征，所述梯度降温是利用程序降温仪和梯度降温盒进行梯度降温。

相比于常规的脐带血库，采用本发明所述方法构建的标准化CBHSC库，细胞复苏存活率高，造血重建功能较好，红细胞残存少，干细胞复苏后没有血红蛋白存留，治疗后没有任何如肝肾损害的副作用。该标准化CBHSC库可提高干细胞移植的成功率，指导相关疾病的干细胞治疗方案的制定或干细胞药物的研究。

本发明建立了制备脐血干细胞的标准化操作规程，提高了脐带血造血干细胞的生产工艺和质量标准，基于本发明所述方法建设标准化的脐血干细胞库，提高建库质量，提供临床移植时所需的干细胞质量特征和相关数据，对提高脐血干细胞移植的成功率将会有很大的帮助。

具体实施方式

定义：在具体描述本发明时，有必要对本文中所要用到的某些术语进行定义和解释，以利对本发明的理解。

造血干细胞：造血干细胞(Hematopoietic stem cell，HSC)是指骨髓中的干细胞，具有自我更新能力并能分化为各种血细胞前体细胞，最终生成各种血细胞成分，包括红细胞、白细胞和血小板，它们也可以分化成各种其他细胞。它们具有良好的分化增殖能力，干细胞可以救助很多患有血液病的人们，最常见的就是白血病。捐献造血干细胞特别是脐带血对捐献者的身体并无任何伤害。

胎盘：胎儿血液与母亲血液交换营养物质的场所。

脐带：连接胎盘与胎儿之间的纽带，有脐带静脉、动脉和中间的结缔组织。

脐带血：孕妇产后脐带和胎盘的血管中含有的血液。

脐血干细胞：从脐带血中分离造血干细胞，称脐带血造血干细胞或脐血干细胞。

细胞质量标准：根据国内外有关干细胞文献资料，自行制定或与国内有关权威机构共同制定的能反映细胞特征和指导临床应用的一系列指标的组合。

以下结合本发明的技术方案，以实施例的方式说明本发明的实施内容。

实施例一：脐带血造血干细胞的制备。

一、材料

1、原料：医疗机构采集并保存在细胞制备中心的脐带血。

2、设备：超净工作台，水平离心机，倒置显微镜和普通显微镜。离心管和平衡天平，采血袋。

3、试剂：泛影葡胺(Sigma公司)，羟甲基纤维素(Sigma公司)，氯化铯(Sigma公司)，聚蔗糖(Ficoll-400，Phamacia公司)，磷酸二氢钾、氢氧化钠(均为广州化学试剂厂)。

4、淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)，比重为1.076g/ml。

5、细胞培养基：含10％小牛血清的高糖DMEM培养基(Gibco公司)。

6、干细胞分离液，自制，包括重量比为15：10：1：15的泛影葡胺、羟甲基纤维素、氯化铯和聚蔗糖。

二、方法

1、细胞制备：在10ml脐带血中加入每管加10ml自制的干细胞分离液。20℃以1500r/min离心15分钟，离心管中液体分为四层，吸取血清层和分离层之间的白色云雾状有核细胞层。以PBS洗涤，800r/min常温离心4分钟，细胞计数。

2、细胞存活率分析：胎盘蓝染色，活细胞计数。瑞氏染色和有核细胞分析。

3、流式细胞仪检测：PBS洗涤细胞后，将PE-CD34，PE-CD133、PE-CD90，PE-CD44、PE-CD45、单克隆抗体分别加入PBS悬浮的细胞悬液中，4℃孵育40min，洗涤细胞，流式细胞仪检测。同时设PE-IgG1及FITC-IgG1标记的阴性对照抗体，并用加入单克隆抗干细胞作为空白对照。

三、结果

所得细胞经胎盘蓝染色显示，细胞存活率均达95％以上。

细胞计数：

计算公式：

注：本实验中，每离心管所加脐带血量为10ml。

经计算后细胞计数结果，分离脐带血所获细胞数：每ml脐带血所获有核细胞数为3.46×10⁶个。

流式细胞仪检测表明，UC-MNCs中CD34+、CD133+细胞比例应大于1.0％。

实施例二：脐带血干细胞分离方法效果比较

脐血(UCB)中含有丰富的造血干细胞，目前的方法主要采用羟乙基淀粉法(鲍建芳，林敏，杨仁儿，等，脐血造血干细胞分离方法的比较，浙江医科大学学报，1999，28(3)：114-116)进行分离，本实验比较了本发明所采用的方法和羟乙基淀粉法分离造血干细胞的效果。

一、材料和方法

1、肝素抗凝新鲜UCB(广东省五邑中医院妇产科提供)，淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)，DMEM培养基(GIBCO)，藻红蛋白(PE)-CD34单克隆抗体，藻红蛋白(PE)-CD44单克隆抗体，藻红蛋白(PE)-CD90单克隆抗体，藻红蛋白(PE)-CD133单克隆抗体，藻红蛋白(PE)-CD45单克隆抗体(BD公司)，羟乙基淀粉(HES，Sigma)。琼脂(Sigma公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)。

2、肝素抗凝新鲜脐带血(UCB)，经白细胞计数后，用DMEM培养基按1：2进行稀释，分成2份，每份10ml，按常规方法和干细胞分离液法分离有核细胞(MNC)。

2.1 6％羟乙基淀粉法：按1：5的比例将6％的HES和稀释的UCB混合，室温静置60min，收集上层富含白细胞的血浆层，重复以上步骤三次，将收集的细胞用DMEM培养基洗涤三次，悬于10mlDMEM培养基中，测NC数和细胞活力。

2.2干细胞分离液法：用干细胞分离液，离心法分离单个核细胞，用DMEM培养基洗涤三次，细胞悬于10mlDMEM培养基中，计数NC细胞数和细胞活力。

3、细胞冻存

细胞必须使用符合标准的程控降温仪或-80℃冰箱进行冷冻降温。

4、细胞复苏和脐血干细胞移植：当临床需要脐带干细胞库中的某个细胞时，取出冻存管，于37℃水浴锅快速解冻，并立即加30mL复苏清洗液，小心混匀，离心去除二甲基亚砜，用生理盐水重悬细胞。

5、细胞复苏后细胞计数和活力检测。

6、细胞计数和细胞活力

仪器设备：细胞活力计数仪，厂家：Thermo scientific，型号：

原理：可自动执行的台盼蓝染色排除法和图像分析。台盼蓝染色排除法:即当细胞死亡时，细胞膜破裂，从而使台盼蓝染料能够透过，死细胞或已失去活力的细胞颜色会比活细胞要深一些，因此其灰度值较低，而具有高灰度值的细胞可视为活细胞。同时，该仪器结合最新的视频捕获技术和样品处理法，会将抽取的细胞样品转移到流动池，并用照相机对其进行拍照。最后再通过对所得照片色调的分析测量，便可检测到细胞活力。

7、细胞表面标记检测分析

流式细胞仪检测：PBS洗涤细胞后，将PE-CD34，PE-CD133、PE-CD90，PE-CD44、PE-CD45、单克隆抗体分别加入PBS悬浮的细胞悬液中，4℃孵育40min，洗涤细胞，流式细胞仪检测。同时设PE-IgG1及FITC-IgG1标记的阴性对照抗体，并用加入单克隆抗体作为空白对照。

8、统计学检验：使用SPSS统计软件25.0进行统计学分析，当P＜0.05时认为差异有统计学意义。

二、结果

1、二种方法分离脐血干细胞效果比较：脐血分离后脐血有核细胞(NC)浓度和造血功能的比较

本实验共收集10份细胞，平均血量为100ml±20ml，脐血有核细胞浓度为(2.40±0.41)×10⁶/ml。将二种分离方法分离10ml脐血所得细胞置于10ml的DMEM培养基中，测得细胞活力均大于95％，二者没有明显差异。收集的细胞数和造血功能的比较见表1。

表1：二种方法分离脐血有核细胞数、CFU-GM数和活力比较

**：同6％HES沉降法比较，p<0.01。

比较两种不同方法分离脐血造血干细胞的结果：采用干细胞分离液法和HES法分离CBHSC。结果显示，干细胞分离液法明显优于HES法，造血干/祖细胞的回收率较高，可提高造血重建的功能。

2、细胞冻融复苏后细胞存活率和造血功能的比较。

2.1细胞冻存复苏后一般情况观察：

常规方法制备的脐血细胞，细胞冻融后，为含较多红细胞的红色液体，离心后上清液中仍有较浓的红色上清，说明细胞冻存后红细胞溶解严重。

用干细胞分离液制备的脐血单个核细胞，细胞冻融后，为白色液体，离心后上清液清晰，未见红色上清。

2.1收集上述细胞进行有核细胞计数，存活率和CFU-GM数检测。结果见表2。

表2：两种方法冻融复苏后脐血有核细胞数、CFU-GM数和活力比较

**：同6％HES沉降法比较，p<0.01。

说明常规法制备的干细胞在冻存过程中损失较严重，细胞总数，存活率和造血重建功能均明显减弱。干细胞分离液组，细胞冻存复苏后，细胞总数约有一半的损失，但细胞存活率和造血重建功能影响不明显。

三、结论

干细胞分离液制备的CBHSC，相比常规法制备的干细胞，CBHSC得率高，细胞中残存的红细胞少，在干细胞冻存和复苏的过程中不会产生红细胞溶血的现象，冻融后细胞存活率高，且造血重建功能保存较完好。

实施例三：脐带血的磁珠法分离纯化

免疫磁珠法分离细胞是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。

制备脐带血单个核细胞，先用CD34磁珠标记细胞，用免疫磁珠分选分离和纯CD34+的细胞，用流式细胞仪进检测纯化后细胞活力。结果：用免疫磁珠法分离纯化CD34+细胞百分率平均为3.12％，分离纯化后CD34细胞百分率为91.3％(p<0.001)；分离纯化前细胞活力平均为92.6％,纯化后平均活力为95.6％(p>0.10)。分离后CD34+细胞回收率为61.8％。结论：免疫磁珠法可有效富集脐带血细胞中的CD34+细胞，且细胞活力不受到影响。

实施例四：脐带血造血干细胞质量标准的制定。

1、无菌检测

常规在冻存细胞前取细胞离心后上清，进行微生物培养检测

2、病毒检测

用ELISA试剂盒法检测脐血离心后的血清和细胞冻存前的细胞制剂，检测病毒八项。病毒检测结果需符合内控标准。如有可疑，须再次取样作病毒检测。

3、内毒素检测

凝胶法，通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素。

4、支原体检测

4.1.样本处理

1)用1000μL移液枪吸取0.5mL标本至标记好的1.5mL EP管中，13000rpm×10min室温离心。

2)离心后弃上清至剩20μL沉淀，加灭菌水至100μL，置于旋涡振荡器上混匀，97℃循环水浴锅中水浴3min；12000rpm×5min室温离心待用。

4.2.PCR

1)配制PCR反应体系

2)PCR扩增

将PCR管在微型离心机上离心3s使反应成分集于管底，然后放入PCR仪中扩增；

95℃5min

95℃30s

55℃30s 32循环

72℃50s

72℃10min

4.3.琼脂糖凝胶电泳

1)量取40ml的1×TAE溶液至锥形瓶；称取0.6g的琼脂糖倒入锥形瓶；

2)混匀，至微波炉内高温2-3min，直至琼脂糖溶解，溶液变透亮；倒至模具内，冷却30min；取出琼脂糖凝胶至电泳仪内；

3)PCR产物扩增完后，每管取3μL与1μL 6×上样缓冲液混匀后上样，以2000bp DNALadder作对照Marker，130V×30min电泳检测；

4)EB浸泡10min。

4.4.凝胶成像系统成像，处理图片

结果应为阴性

5、细胞数和细胞活力

仪器设备：细胞活力计数仪，厂家：Thermo scientific，型号：

结果：冻存前细胞活力应为95％以上；临床移植的细胞活力应大于80％。

6、细胞表面标记检测分析

1)试验材料

(1)磷酸缓冲盐溶液(PBS)；

(2)藻红蛋白(PE)-CD34单克隆抗体，藻红蛋白(PE)-CD44单克隆抗体，藻红蛋白(PE)-CD90单克隆抗体，藻红蛋白(PE)-CD133单克隆抗体，藻红蛋白(PE)-CD45单克隆抗体(BD公司)。

2)流式细胞仪检测

PBS洗涤细胞后，将PE-CD34，PE-CD133、PE-CD90，PE-CD44、PE-CD45、单克隆抗体分别加入PBS悬浮的细胞悬液中，4℃孵育40min，洗涤细胞，流式细胞仪检测。同时设PE-IgG1及FITC-IgG1标记的阴性对照抗体，并加入单克隆抗体干细胞作为空白对照。流式细胞仪检测表明，UC-MNCsCD34+、CD133+细胞比例应大于1.0％。

7、集落培养指标

CFU-GEMM：粒细胞－红细胞－巨噬细胞－巨核细胞集落形成单位。一个多潜能祖细胞能生成包含有成红细胞和至少其它两系细胞的集落。由于它的原始性，CFU-GEMM倾向于产生>500个细胞的大型的集落，能够向单核细胞、粒细胞、红细胞、血小板方向分化，故将此指标作为多潜能细胞质量参考指标。CFU-GEMM集落培养数据值达到22(该指标为新鲜样本指标，实验样本为冻存复苏后样本)，证明细胞冻存复苏后仍能维持较强的增殖能力。

实施例五：人脐带血造血干细胞的储存。

一、材料

1、设备：超净工作台，冻存盒、低温冰箱、程序降温仪、平衡天平。

2、耗材:离心管、巴氏管、冻存管。

3、试剂：DMSO(Sigma公司)，右旋糖苷(Sigma公司)，DMEM(Hyclone)，白蛋白(武汉禾元)。

二、方法

1、冻存液(1)的配制：将5％-10％DMSO，10％右旋糖酐，80％-85％DMEM在超净工作台中配制，并取样进行内毒素、支原体、无菌、渗透压等项目检测。

冻存液(2)的配制：将5％-10％DMSO，1％-5％白蛋白，85％-94％DMEM在超净工作台中配制，并取样进行内毒素、支原体、无菌、渗透压等项目检测。

2、利用配制好的冻存液将分离好的脐血干细胞重悬，分装于1.8ml冻存管中，放置梯度降温盒中，将梯度降温盒放置于-80℃的低温冰箱过夜，然后移放在液氮罐中。

3、利用配制好的冻存液将分离好的脐血干细胞重悬，分装于1.8ml冻存管中，放置程序降温仪，进行程序降温，然后移放在液氮罐中。

4、细胞存活率分析：细胞复苏后存活率检测。

5、流式细胞仪检测：PBS洗涤细胞后，将PE-CD34，PE-CD133、PE-CD90，PE-CD44、PE-CD45、单克隆抗体分别加入PBS悬浮的细胞悬液中，4℃孵育40min，洗涤细胞，流式细胞仪检测。同时设PE-IgG1及FITC-IgG1标记的阴性对照抗体，并用加入单克隆抗干细胞作为空白对照。

三、结果

所得细胞经胎盘蓝染色显示，细胞存活率均达80％以上。

流式细胞仪检测表明，UC-MNCs中CD34+、CD133+细胞比例大于1.0％。

实施例六：标准化脐带血造血干细胞库的构建。

Gluckman等人于1989年用脐血治疗地中海贫血(Gluckman E,Broxmeyer HA,Auerbach AD,Friedman HS,Douglas GW,Devergie A,et al.Hematopoieticreconstitution in a patient with Fanconi's anemia by means of umbilical-cordblood from an HLA-identical sibling.N Engl J Med.1989；321:1174–8)和1992年Robinstein等人(H E Broxmeyer,G Hangoc,S Cooper,R C Ribeiro,V Graves,M Yoder,JWagner,S Vadhan-Raj,L Benninger,P Rubinstein,et al.Growth characteristics andexpansion of human umbilical cord blood and estimation of its potential fortransplantation in adults..Proc Natl Acad Sci U S A.1992May 1；89(9):4109–4113.doi:10.1073/pnas.89.9.4109)建立脐带血库以来，脐血干细胞移植在临床上已经治疗了3.5万例白血病患者(Umbilical cord blood quality and quantity:Collection upto transplantation.SeyedHadi Mousavi,MortezaZarrabi,SaeidAbroun,MonaAhmadipanah,Bahareh Abbaspanah.Asian J Transfus Sci.2019Jul-Dec；13(2):79–89.Published online 2019Dec 3.doi:10.4103/ajts.AJTS_124_18PMCID:PMC6910041)。因为分离方法或脐血库技术方面的局限性，导致脐带血在临床应用中存在诸多缺陷：1.脐血中的干细胞数量有限，对“体重较大的病人”疗效不佳；2.脐血细胞在复苏时，干细胞数量明显减少，细胞存活率不高，也是脐血造血干细胞移植失败的原因之一。因此，优化脐血干细胞的生产工艺，提高成品干细胞的质量标准，保证干细胞复苏的存活率和提高造血重组能力，对CBHSC库的构建提出了更高的要求。因此，有必要建设一个高质量标准的CBHSC库显得尤其重要。

以下是标准化干细胞库的构建过程：

1、建设CBHSC信息管理系统，必要时可建设电脑互联网系统，以便国际国内查询。

2、建立干细胞条形码系统，保证所储存的个体CBHSC信息的唯一性。

3、与有相关资质的医院或医疗机构合作，在征得供者同意并签署知情同意书的前提下，收集孕妇家庭相关的遗传病信息和各项检测指标，在保证无明显遗传病史、病毒性疾病和性病史的前提下，按脐血采集标准操作规程收集脐带血。

4、CBHSC分离前复检：从医院收集的脐带血，需医院提供供者体检报告，进行下一步操作前需再做一次病毒学，微生物检测，支原体、内毒素检测，确认符合标准再进行干细胞的分离纯化。同时取样送第三方检测，检测病毒学指标和遗传病学指标，在第三方检测报告未出来前，所有样品均在-80℃低温冰箱中临时保存，检测报告结果符合标准要求后才能进行入库保存。

5、组织配型和ABO/Rh配型：按常规方法进行。

6、干细胞质量标准检测，所有脐血干细胞均进行实施例四的方法进行干细胞质量检测，符合质量标准的脐血干细胞才归入标准化干细胞库中。

本发明所述的标准化CBHSC库的质量标准包括：CD34和CD133细胞比例应大于1％，复苏后细胞数大于1.0×10⁸，细胞活率大于80％。

7、留样样本

1)脐带血样本：每份保存供临床用的脐带血留样样本必须密封在特定容器中。至少下列脐带血留样样本必须存档，以备检测：

(1)非肝素化血浆样本(至少2管，每管2ml，应保存在-18℃以下)

(2)细胞的冷冻保存能够长期保持其活性(至少2管，每管1-2×10⁶单个核细胞)。

(3)能制备至少50gDNA的原料，可以是提纯的DNA、冷冻细胞材料或印迹。

2)脐带血供者的血液样本：

(1)来自产妇的非肝素化血清或血浆样品(至少2管，每管2ml，应保存在-18℃以下)。

(2)制备来自产妇的不少于50gDNA的原料，可以是冷冻细胞材料或印迹。

8、细胞冷冻

A)细胞必须使用符合标准的程控降温仪或-80℃冰箱进行冷冻降温。

B)冷冻的细胞必须保存在经批准的专门为冷冻保存人类细胞用的冷冻袋或冻存管中，再放入冻存盒中，为冷冻过程起到保存和运输提供保护。

C)每个冷存袋/冻存管在使用前，必须肉眼检查是否有损害、污染及密封性等情况，结果必须记录。

本发明采用的冷冻保护剂是由5％-10％的DMSO、10％的右旋糖苷和80％-85％的DMEM培养基组成，或者是由5％-10％的DMSO、1％-5％的白蛋白和85％-94％的DMEM培养基组成。

本发明采用的冷冻保存的条件为-86℃至-196℃的液氮；用冻存管分装的脐带血干细胞冷冻保存于液氮中；用冻存袋分装的脐带血干细胞冷冻保存于气相液氮中。

本发明采用梯度降温，是利用程序降温仪和梯度降温盒进行梯度降温。

9、细胞复苏和脐血干细胞移植：当临床需要脐带干细胞库中的某个细胞时，取出冻存管，于37℃水浴锅快速解冻，并立即加30mL复苏清洗液，小心混匀，离心去除二甲基亚砜，用生理盐水重悬细胞。

Claims

1.一种标准化脐带血造血干细胞库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

A.用自制的干细胞分离液从脐带血中提取脐带血造血干细胞(cord bloodhematopoietic stem cells cell,CBHSC)，所述脐带血在提取前经过ABO/Rh血型、HLA分型、微生物学检测；

2.根据权利要求1所述的标准化CBHSC库的构建方法，其特征在于：所述的质量标准包括：CD34和CD133细胞比例应大于1％，复苏后细胞数大于1.0×10⁸，细胞活率大于80％。

3.根据权利要求1所述的标准化CBHSC库的构建方法，其特征在于：所述的干细胞分离液包括重量比为15：10：1：15的泛影葡胺、羟甲基纤维素、氯化铯和聚蔗糖。

4.根据权利要求1所述的标准化CBHSC库的构建方法，其特征在于：所述冷冻保护剂是由5％-10％的DMSO、10％的右旋糖苷和80％-85％的DMEM培养基组成。

5.根据权利要求1所述的标准化CBHSC库的构建方法，其特征在于：所述冷冻保护剂是由5％-10％的DMSO、1％-5％的白蛋白和85％-94％的DMEM培养基组成。

6.根据权利要求1所述的标准化CBHSC库的构建方法，其特征在于：所述冷冻保存的条件为-86℃至-196℃的液氮；用冻存管分装的脐带血干细胞冷冻保存于液氮中；用冻存袋分装的脐带血干细胞冷冻保存于气相液氮中。

7.根据权利要求1所述的标准化CBHSC库的构建方法，其特征在于：所述梯度降温是利用程序降温仪和梯度降温盒进行梯度降温。