CN114921414A - 一种体外分离培养循环肿瘤细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种体外分离培养循环肿瘤细胞的方法，包括：（1）分离：将癌症患者的外周血或胸水样本稀释，直接采用高密度微孔阵列膜过滤，所述高密度微孔阵列膜上每平方厘米的孔数为90‑100万个孔/cm2，孔径为6‑10μm；然后清洗高密度微孔阵列膜，进行循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell,CTC）镜检及成活细胞检测；（2）培养：将高密度微孔阵列膜转移至培养皿，加入培养液，进行体外培养，建立CTC体外培养的方法。本发明提供了实用可行并简便有效的CTC分离和体外培养的方法系统，可以快速高效分离循环肿瘤细胞并保留其活性，能够大大提高CTC体外培养的成功率，适于多类癌症CTC的体外培养，对CTC的分子特性分析、功能研究及肿瘤靶向药筛选等临床应用具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体地说，涉及一种体外分离培养循环肿瘤细胞的方法。
背景技术
恶性肿瘤严重威胁人类的健康, 恶性肿瘤致死的主要原因是部分肿瘤细胞具有侵袭能力并造成转移。而肿瘤患者在体液（外周血、淋巴液、胸腹水、及脑脊液等）中存在的循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell, CTC）是肿瘤转移的最主要途径。
循环肿瘤细胞（CTC）广义上是表明癌症患者循环系统中恶性细胞的总称，狭义上是指从实体瘤脱落而进入患者循环系统的恶性细胞。CTC参与肿瘤的生长、转移及复发，具有重要的肿瘤生物学研究意义。CTC是完整的肿瘤活性细胞，代表完整的癌细胞突变信息，可提供蛋白质表达、细胞定位以肿瘤异质性的分析，在病理诊断、病程监测、疗效评估、预后判断及复发监控预警等方面具有独特价值。越来越多的临床研究表明，不少毫米级大小的早期实体瘤（2-4 mm）就能形成CTC进入循环系统，这样外周血CTC检测也有早筛的意义。
基于外周血CTC的液态活检技术，具有无创或微创及实时动态分析的优点，克服了放射影像检测及基于活检样本的病理分析的局限性。然而CTC是肿瘤患者血液中异常的稀有细胞，外周血CTC十分稀少，通常每毫升外周血含CTC一至上百个；而且CTC呈高度异质性，既与肿瘤组织的遗传高度异质性密切相关，也与CTC在体液中存在的不同细胞类型（上皮型、间质型及混合型）、不同基因型的CTC亚群、及不同存在状态（以单个游离细胞，或与其它CTC及非CTC形成小细胞团, Circulating Tumor Microemboli, CTM）有关。因此，对CTC检测和培养的要求极高并面临极大的挑战。
此外，患者外周血CTC数量、类型及功能性质，除存在个体差异性外，与肿瘤类型、存在状态及临床分期等因素密切相关，存在一定的动态性及不确定性。从实体瘤脱落的肿瘤细胞，进入血液系统后，受血流剪切力及免疫系统清除等影响，血液中大多数CTC处凋亡及被吞噬或降解状态，仅极少部分生存下来，具肿瘤转移潜能的CTC是真正的治疗靶点，而常规的CTC计数是无法区分这些具有转移活性的CTC与其它失活的CTC。而现在流行的CTC计数研究，存在很大的局限性。如何将极其稀少的具有转移活性的CTC在体外培养成功，是克服CTC临床应用研究瓶颈的关键所在。
如何最大可能地保留所分离富集的肿瘤患者外周血CTC的活性，选择适当的培养条件，是CTC体外培养的关键。现有的CTC培养技术，其分离富集的主要方法为两大类，一是密度梯度离心，然后用抗体去除单核细胞层中白细胞（负筛）或捕获CTC（正筛），间接或直接地分离富集CTC；另一类是应用微流控技术结合带有特异性抗体的基质吸附CTC。第一类方法用外周血量多，步骤多，操作复杂，CTC易损失；第二类方法中理想的抗体常常缺乏，难以满足实验需求，会抓捕带有相应细胞表面抗原的正常上皮细胞，此外多数肿瘤细胞表面的特异性抗原是未知的，实际应用存在很大的局限性。两类方法都容易失去在外周血就存在的CTC细胞群，并对CTC的活性有一定影响。另外，反复的离心、抗体磁珠吸附或微流控技术捕获，除了造成CTM的损失，也会不同程度地损害CTC细胞活性，可能是CTC体外难以高效成功培养的主要原因，也是临床上难以精准检测CTC的瓶颈。最为著名的CTC分离检测系统CellSearchTM[基于上皮细胞粘附分子(Epithelial Cell Adhesion Molecule，EpCAM)抗体磁珠的方法]，要固定血液分离样本，才能有效检测EpCAM阳性CTC，但不能用于细胞培养。为此，多数CTC的体外培养成功率均不高，甚至有些体外培养方法并未统计培养成功率。
迄今为止，CTC体外培养的文献报道较少，且普遍存在成功率低的问题，究其原因可能在于CTC分离富集方法不当及培养方法尚需优化等。而如何采用更能保留细胞活力的CTC分离富集方法以及改善CTC体外培养条件，提高患者CTC体外培养的成功率，是本申请需要解决的主要问题。
有鉴于此特提出本发明。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种体外分离培养循环肿瘤细胞的方法。本发明提供了实用可行并有效的CTC体外培养的方法系统，通过方法的改进，可以很好地分离并保留循环肿瘤细胞的活性，采用合适的培养条件，能够大大提高CTC体外培养的成功率，对CTC临床应用研究具有重要意义。
为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：
本发明提供一种体外分离培养循环肿瘤细胞的方法，包括：
（1）分离：将癌症患者的外周血或胸水样本用无菌生理盐水稀释，直接采用高密度微孔阵列膜过滤，所述高密度微孔阵列膜上每平方厘米的孔数为90-100万个孔/ cm2，孔径为6-10μm；然后用无菌生理盐水或PBS清洗高密度微孔阵列膜，进行CTC镜检及成活细胞检测；
（2）培养：在无菌操作条件下，加入培养液，进行培养，建立CTC体外培养的系统。
在CTC分离和富集过程中如何尽可能地保存其细胞活性是能够培养成功的前提和基础。本发明中发现，将癌症患者的外周血样本稀释后，避免添加含有固定剂的任何试剂，直接采用限定孔数的高密度微孔阵列膜过滤，借助自然重力，能够在短时间内一步法一次性过滤血液样本。一般而言，对于10-20毫升的外周血混合液样本，用8微米孔径的微孔阵列膜（17 mm X 17 mm面积），仅需20-30秒钟，达到快速均衡过滤，从而分离CTC；可以避免现有方法中重力场梯度离心、抗体磁珠吸附和磁化、及微流控流体压力和液压泵等条件下对CTC细胞的损伤及活性影响，能够大大提高CTC体外培养的成功率。
另外，本发明还对多种类型的微孔膜进行了对比，发现沃特曼（Whatman）8微米孔径的微孔膜所含微孔的密度为10万个孔/每平方厘米，其分离富集效果最差，残留白细胞多，甚至存留不少红细胞。细胞过滤活性可能不一定完全取决于孔数，单位面积负压及材料的亲疏水性也可能相关联，Whatman微孔膜用的是醋酸纤维类材料，靠重离子随机穿击形成微孔，微孔分布不太均匀。沃特曼（Whatman）微孔膜需要应用较高的液压。而友芝友及安方的微孔膜，每平方厘米微孔膜分别带有9.47万和22.22万个微孔，由高分子材料制成，能有效去除红细胞及绝大多数白细胞，但由于需要液压泵及微流控液相作用力等条件，仍会影响CTC的活性。与其他微孔膜相比，本发明采用的高密度微孔阵列膜过滤，孔数特多，不需要重力场梯度离心、液压泵及微流控液相作用力，借助自然重力便可快速均衡过滤，实现了一步法过滤，避免了对CTC细胞的损伤，能更好地保留CTC活性。即使每毫升含CTC少至个位数，或几十个也可以培养成功，培养成功率大大提高。例如，肝癌CTC体外培养的成功率达80％。
进一步的方案，步骤（1）中，所述高密度微孔阵列膜上每平方厘米的孔数为92-98万个孔/ cm2，孔径为6-8μm；
进一步的方案，所述高密度微孔阵列膜上每平方厘米的孔数为96万个孔/ cm2；孔径为8μm。
进一步的方案，所述高密度微孔阵列膜的制作材料为派瑞林Parylene。
作为一种具体的实施方式，本发明的高密度微孔阵列膜为微孔阵列膜芯片，型号M-PAC001，杭州佰迈医疗科技有限公司，孔径8微米，每平方厘米孔数96万个，制作材料是派瑞林（Parylene），聚对二甲苯；或译帕利灵（一种新型热塑性塑料，用于制作极薄薄膜或沉积涂层）。
进一步的方案，步骤（1）中，采用高密度微孔阵列膜过滤包括一级过滤或多级过滤；多级过滤时，高密度微孔阵列膜的孔径逐级减小。
作为一种实施方式，采用高密度微孔阵列膜进行两级过滤，一级过滤中高密度微孔阵列膜的孔径为8 µm，二级过滤中高密度微孔阵列膜的孔径为6 µm。由于肿瘤细胞大小一般要大于直径8~10 µm，少于8~10 µm的小肿瘤细胞，可能在一级过滤时而损失掉，用6 µm孔径的再次进行滤膜，可克服这一缺陷。
进一步的方案，步骤（1）中，将癌症患者的外周血或胸水样本采用无菌生理盐水稀释2-5倍，轻轻充分混匀，放置于室温3~5分钟，然后进行过滤；
进一步的方案，将癌症患者的外周血样本采用无菌生理盐水稀释3倍。
现有的CTC分离鉴定方法中，为了保持系统稳定，一般都需要加固定剂，例如多聚甲醛或其它含有固定成分的试剂。本发明中发现，加入固定剂后会大幅损伤CTC活性。而若不加固定剂，则容易存在细胞团聚的现象。本发明中发现，采用生理盐水将保存的外周血稀释2-5倍，可以在不加固定剂的情况下避免细胞团聚，还能够非常好的保留CTC的活性。
进一步的方案，步骤（1）中，采用无菌生理盐水或PBS缓冲液清洗微孔膜3~4次，加入PBS缓冲液，进行CTC镜检及成活细胞检测。
本发明中，采用高密度微孔阵列膜对稀释后的外周血一步过滤后，过滤掉红细胞和绝大多数白细胞，循环肿瘤细胞富集于膜上，用无菌生理盐水或PBS缓冲液清洗微孔膜3~4次。将分离膜移至6孔板中，加入PBS缓冲液，进行CTC镜检及成活细胞检测。如此，可以快速实时精准确定成活CTC、单个或CTM细胞群。
进行CTC镜检及成活细胞检测的步骤包括：将过滤后的膜，转移至6孔板，经无菌PBS缓冲液清洗2-3次，加入台酚蓝(Trypan Blue)，至最终浓度为0.05％，在显微镜下观察CTC。细胞着色的为死细胞，活细胞拒染呈无色透明状，可鉴定CTC在外周血样本中的成活率。
经过滤分离后，CTC富集于高密度微孔阵列膜上，呈单个或多细胞群的状态分布于膜上。经台酚蓝活细胞染色检测，若成活CTC≥1，就会进入下一步的体外培养阶段。
进一步的方案，步骤（2）中，带有CTC的膜转移到培养皿，加入培养液，在37℃细胞培养箱中培养，5％CO2饱和度，观察细胞生长，每隔3~4天更换培养液。
CTC培养观察过程中，一般单个CTC经3~5天，长成小细胞团群（数个至数十个细胞），1~2周长成更大的细胞团，期间可能会存在单细胞、细胞团共存，单细胞可呈圆形、椭圆形及不规则形态等，同时存在附着或悬浮状态，悬浮细胞常呈圆球形，而附着细胞成梭形、纺锤形或不规则形态。也有一开始是CTM，记录每个CTM的整体形态及细胞总数，连续观察确定是否有细胞增殖及CTM增长。以单个CTC的是否增殖长成细胞团及CTM的是否增长为标准，能在体外培养扩大并稳定培养2-3周，视为患者外周血CTC体外培养成功。
目前，多数CTC的培养，选用低氧的培养条件，需要特殊的设备及要求。而本发明中可以在常氧（有氧）培养条件下有效培养CTC，可适合大多数实验室的培养需求。
需要说明的是，有氧是指用5％二氧化碳饱和度，为多数动物细胞培养的标准方法。厌氧需特殊装置，一般实验室满足不了。现有方法中肿瘤细胞一般在低氧条件下培养生长，本发明在常氧（有氧）培养条件下可以有效培养CTC。
CTC的体外分离培养，不但需要尽可能保留其活性，而且还要注意起始培养时的接种量（细胞密度的群体效应一定程度上促进细胞生长）。然而外周血中CTC含量稀少，分离后CTC的数目常为个位数，因此造成起始培养的接种量小，培养难度极高，虽可通过采集更多的外周血供富集CTC，但实际操作难度很大。基于此，本发明中还改进了培养条件，通过加大几种添加成分，例如生长因子的用量，并选用合适的范围，适于快速培养多种癌症CTC，取得了较好的效果。本发明的培养液中，所用的胰岛素及上皮生长因子（EGF）分别是常规用量的10倍和25倍。
或许，人们会担心采用如此高浓度的生长因子，会激发不少基因表达，细胞呈不同的生理活性，然而，CTC在基因组层面上的突变，在体外培养、CTC在外周血中及肿瘤细胞在肿瘤组织内（脱落前）均是保留下来的，为此对体外培养的CTC的基因分析及测序，仍具科研意义及临床价值。
进一步的方案，步骤（2）中，培养液包括基本培养基和添加物，所述基本培养基包括体积比为1:1的RPMI 1640和DMEM/F12；所述添加物的组成及含量包括：体积百分比为2%的胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS），质量百分比为0.05%的牛血清白蛋白（BovineSerum Albumin, BSA），非必需氨基酸（Nonessential Amino Acid Solution, NAAS, 1X）,抗生素（1X）, 1-2 μg/mL转铁蛋白，5-50 μg/mL人胰岛素, 20-500 ng/L hEGF, 及5-10ng/L hFGF。
需要说明的是，非必需氨基酸最终用量为1×(NAAS, 试剂母液：100×, 北京索莱宝, 货号：N1250), 抗生素最终用量为1×三类混合抗生素(青霉素，链霉素及抗支原体抗生素，试剂母液：1000×, 北京全式金生物，货号：FM501-02)。
作为优选的实施方式，培养液中，人胰岛素的浓度为25-50 μg/L, hEGF 的浓度为250-500 ng/L。更优选的实施方式，培养液中，人胰岛素的浓度为50 μg/mL, hEGF的浓度为500 ng/L。
目前大多数CTC的培养采用无血清培养基（B27无血清添加剂混合物），这类培养基较昂贵（50X 母液，10 mL，GIBCO：2196元，配制1升完全培养液，B27的费用约4400元）。本发明中应用低浓度血清培养基，添加适当的细胞生长因子，提高人胰岛素、hEGF等的用量并保持在合适范围，不仅取得了较好的CTC培养效果，而且降低了培养成本。本发明的培养方法不但可以用于肝癌CTC培养，而且适用于其它多类癌种，包括淋巴瘤细胞，可以适用泛癌种类的CTC培养。
本发明中，在步骤（1）之前需获取癌症患者的外周血样本。对已确诊的癌症患者，釆用常规的外周血静脉取血法，选用乙二胺四乙酸二钠(EDTA)或枸橼酸钠抗凝管留存外周血。采样后，若在2~3小时内可进行CTC过滤分离，则可以直接用生理盐水稀释外周血，采用高密度微孔阵列膜进行过滤分离。采样后，若不在2~3小时内处理血样，血小板则会迅速活化，造成CTC活性的降低。为了最大程度保留CTC的活性，本发明还提供一种外周血体外短期保存的方法，加入CPDA-1抗凝剂，从而维护采集的外周血样本的稳定性。加入CPDA-1抗凝剂的外周血，可在4℃保存样本3-5周，这样便于CTC外周血样本的短期运输及保存。
作为一种实施方式，采集癌症患者的外周血后，加入CPDA-1抗凝剂，轻轻混匀，可在4℃下保存3~5周；外周血与CPDA-1抗凝剂的体积比为1：0.15。例如，每毫升外周血中加入0.15 mL的CPDA-1抗凝剂。
进一步的方案，外周血与CPDA-1抗凝剂混合后，还向混合液中加入抗生素和/或血小板抑制剂盐酸替罗非班Tirofiban；
进一步的方案，混合液中，抗生素为1×抗生素(抗生素为青霉素，链霉素及抗支原体抗生素三类混合，试剂母液：1000×, 北京全式金生物，货号：FM501-02)。
优选的，血小板抑制剂盐酸替罗非班Tirofiban在混合液中的质量浓度为2-10μg/mL。
进一步的方案，所述外周血或胸水取自患有癌症的患者，所述癌症包括肝癌，胃癌，结直肠癌，宫颈癌，肺癌，淋巴癌，乳腺癌以及造血系统肿瘤。
经多次试验验证，本发明的体外分离培养循环肿瘤细胞的方法，可以成功地用于肝癌、胃癌、结直肠癌、宫颈癌、淋巴癌、乳腺癌等患者的外周血CTC及肺癌患者胸水CTC的体外培养；此外不但用于实体瘤CTC培养，还可以用于血源性肿瘤细胞的体外培养，适用范围广泛，具有重要的临床意义。
另外，一般癌症CTC的体积远远大于普通的淋巴细胞（如白细胞），且具有肿瘤细胞的典型特征（核质体积比相对大，核仁一般多个且不规则，染色质着色较深）。经膜过滤分离的CTC，或者经体外扩大培养的CTC，可用常规细胞染色法鉴别细胞的形态。例如，可用银染观察CTC的细胞形态，该方法需要固定细胞。需要指出的是，观察CTC细胞形态的方法除了银染法还可以采用现有技术中可行的其他任何方法，并不限定。不经固定处理的带成活CTC的微孔阵列膜，可进行CTC体外培养。
银染的方法包括：经PBS清洗2次的微孔膜，用固定液（甲醇／乙酸，95／5，v／v）处理5-10分钟，水洗3次，加入150微升30％AgNO3，150微升2％明胶溶液，加上10微升20％的甲酸，置37度恒温箱处理15-25分钟，避光，水洗洗去深黑色反应液。在显微镜下观察CTC的细胞形态。
进一步的方案，经膜过滤分离的CTC，或者经体外扩大培养的CTC，可以通过免疫荧光显微术（IFM）进行检测，进一步鉴别是否为CTC。方法包括：
剪取部分过滤后的膜、或者扩大培养的附着CTC细胞或悬浮细胞甩片于载玻片，先用4％的多聚甲醛固定10分钟，然后经甲醇／乙酸（95：5）固定，PBS洗3次，加入细胞通透处理液，室温处理5-10分钟，PBS快速洗2次，加入封闭液，室温处理30分钟，然后加抗体混合液，室温一小时，或4度过夜处理。PBS（加Tween-20 (吐温20), 0.05％洗3次，Dapi（DNA染料）染核5-10分钟，PBS洗2次，镜检。
所述的细胞通透处理液为：1× PBS，0.25％Triton-X-100 (曲拉通X-100)。
所述的封闭液为：2％BSA，1%正常山羊血清(Normal Goat Serum)，0.05％Tween-20，1×PBS；
所述的抗体混合液：封闭液中，含抗CD45抗体（1：200，带FICT绿色荧光标记, Abcm公司）；抗pan-CK (pan-cytokeratin, 广谱细胞角蛋白)抗体（1：100，带红色荧光标记,Abcam公司）。
采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
1、本发明提供了经济实用并简便有效的CTC体外分离培养的方法，通过方法的改进，可以很好地分离并保存循环肿瘤细胞的活性，采用合适的培养条件，能够大大提高CTC体外培养的成功率，对CTC临床应用研究具有重要意义。
2、本发明中，采用特定的高密度微孔阵列膜对外周血进行过滤分离，不需要重力场梯度离心、液压泵及微流控液相等作用力，血液只借助自然重力，快速均衡过滤即可，还避免使用细胞固定剂或洗涤活化剂等，最大可能地保持CTC活性。此种一步过滤法，快速、简易、稳定、实用安全、高效经济，CTC活性高，为后续培养提供了良好的前提和基础。
3、本发明中，改进了培养条件，应用低浓度血清培养基，添加适当的细胞生长因子，提高人胰岛素、hEGF等的用量并保持在合适范围，不仅取得了较好的CTC培养效果，还降低了培养成本；另外，本发明的方法还可以在常氧条件下进行有效培养，避免了对低氧条件特殊设备的需求，可适合大多数实验室的培养需求。
4、本发明中，对采集得到的癌症患者的外周血进行了短期的保存，加入CPDA-1抗凝剂等，从而维护采集的外周血样品的稳定性，避免血小板活化、细胞团聚或死亡等，从初始源头便维持CTC活性，为后续分离、培养打下良好基础。
5、本发明的体外分离培养循环肿瘤细胞的方法，可以成功地用于肝癌，胃癌、结直肠癌、宫颈癌等患者的外周血CTC及肺癌患者胸水CTC的体外培养；此外不但用于实体瘤CTC培养，还可以用于血源性肿瘤细胞的体外培养，适用范围广泛，具有重要的临床意义。
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。
附图说明
附图作为本发明的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：
图1是本发明实施例1中采用银染法对体外培养的CTC的检测结果图；
图2是本发明实施例1中体外培养的CTC的免疫荧光检测图；每排最左侧图为其右侧三个图合并形成，显示检测到CTC；每排除最左侧外，从左到右依次为：DAPI染细胞核，细胞角蛋白CK，白细胞标记CD45；
图3是本发明实施例2中采用银染法对体外培养的肝癌CTC的检测结果图；
图4是本发明实施例2中肝癌CTC体外培养后的细胞免疫荧光显微检测结果图；
图5是本发明对比例1中采用不同试剂处理肺癌细胞系的成活率结果柱状图。
需要说明的是，这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
各个试剂厂家类型：CPDA-1抗凝剂（四川南格尔生物），1000×三类混合抗生素（北京全式金生物，货号：FM501-02）和血小板抑制剂Tirofiban（Sigma）。
本发明的实施方式中采用的癌症患者外周血为短期保存的外周血。采集和保存的方法包括：对已确诊的癌症患者，釆用常规的外周血静脉取血法，选用乙二胺四乙酸二钠(EDTA) 或枸橼酸钠抗凝管留存外周血。采集外周血后，每毫升外周血中加入0.15 mL的CPDA-1抗凝剂，轻轻混匀，然后加入抗生素和血小板抑制剂Tirofiban，混合液中，抗生物为1×，血小板抑制剂Tirofiban在混合液中的质量浓度为5 μg/mL，在4℃下保存，备用，保存期限为3~5周。
其它试剂：非必需氨基酸 (NAAS, 试剂母液：100×, 北京索莱宝, 货号：N1250)，抗生素(三类混合抗生素：青霉素，链霉素及抗支原体抗生素，试剂母液：1000×, 北京全式金生物，货号：FM501-02)。
高密度微孔阵列膜(Micropore Array): 杭州佰迈医疗科技有限公司，孔径8微米，型号：M-PAC001；每平方厘米孔数：96万个。
实施例1 一例原发性进展期肝癌患者外周血CTC的体外分离培养
（1）在生物安全柜中操作，取1 mL保存的肝癌患者的外周血，加入3 mL无菌生理盐水，轻轻混匀混合液，采用高密度微孔阵列膜过滤，富集异常CTC稀有细胞；高密度微孔阵列膜的孔数为96万个孔/ cm2；孔径为8微米；
（2）取出高密度微孔阵列膜，在无菌操作条件下，转移至6孔板的培养皿中，用无菌PBS缓冲液洗2次，然加入0.05％台酚蓝／PBS染色液，观察可能存在的单个CTC或CTM，成活或死亡的细胞。
（3）显微观察表明血样中存在CTC，吸除台酚蓝染色液，用PBS洗2遍，将微孔膜移入6孔板皿中，加入2 ml培养液，置37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，每天用显微镜观察，每3-4天更换培养液。培养观察数周或2-3个月。
其中，所述培养液中，以体积比为1:1的RPMI 1640和F12的混合物为基本培养基，还包括体积百分比为2%的胎牛血清(FBS)，质量百分比为0.05%的牛血清白蛋白(BSA)，非必需氨基酸(NAAS, 1×), 抗生素(1×), 2 μg/mL转铁蛋白， 40 μg/mL人胰岛素, 400 ng/LhEGF, 及8 ng/L hFGF。
（4）经培养观察，该患者1mL外周血存在6个CTC。培养2-3天后，异常细胞开始出现增殖。采用银染法以及免疫荧光法检测扩大培养的CTC细胞。
银染的方法包括：经PBS清洗2次的微孔膜，用固定液（甲醇／乙酸，95／5，v／v）处理5-10分钟，水洗3次，加入150微升30％AgNO3，150微升2％明胶溶液，加上10微升20％的甲酸，置37度恒温箱处理15-25分钟，避光，水洗洗去深黑色反应液。在显微镜下观察CTC的细胞形态。
免疫荧光法步骤包括：扩大培养的附着CTC细胞或悬浮细胞甩片于载玻片，先用4％的多聚甲醛固定10分钟，然后经甲醇／乙酸（95：5）固定，PBS洗3次，加入细胞通透处理液，室温处理5-10分钟，PBS快速洗2次，加入封闭液，室温处理30分钟，然后加抗体混合液，室温一小时，或4度过夜处理。PBS（加Tween-20, 0.05％）洗3次，Dapi（DNA染料）染核5-10分钟，PBS洗2次，镜检。
银染法检测的相差显微镜结果如图1所示，免疫荧光显微镜观察结果如图2所示。
实施例2 一例原发性肝癌中晚期患者外周血CTC的体外分离培养
（1）取用2 mL保存的患者外周血，与6 mL无菌生理盐水混匀，轻轻混匀混合液，采用高密度微孔阵列膜过滤，富集异常CTC稀有细胞；高密度微孔阵列膜的孔数为96万个孔/cm2；孔径为8微米；
（2）取出高密度微孔阵列膜，在无菌操作条件下，转移至6孔板的培养皿中，用无菌PBS缓冲液洗3次，然后加入无菌0.05％台酚蓝／PBS染色液，观察可能存在的单个CTC或CTM，成活或死亡的细胞。
（3）显微观察表明血样中存在CTC，吸除台酚蓝染色液，用无菌PBS洗3遍，将微孔膜转移至6孔板培养皿中，再加入2 ml培养液，置37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，每天用显微镜观察，每3天更换培养液。培养观察数周或2-3个月。
其中，培养液包括：以体积比为1:1的RPMI 1640和DMEM的混合物为基本培养基，还包括体积分数为2%的胎牛血清(FBS)，质量分数为0.05%的牛血清白蛋白(BSA)，非必需氨基酸NAAS（1X）, 抗生素（1X）, 2 μg/mL转铁蛋白，25 μg/mL人胰岛素，300 ng/L hEGF, 及10ng/L hFGF。
（4）实验结果：该患者2 mL外周血存在4个CTC，2个“CTM”。培养2天后，异常细胞开始出现增殖，每3-4天更换培养液，大约培养2周。银染法以及免疫荧光法检测参照实施例1进行，银染法检测的相差显微镜结果如图3所示，相关的细胞免疫荧光显微镜观察结果如图4所示。
其中，图3中A1、A2、和A3是同一肝癌患者分离后的CTC培养观察结果，用相差镜在10Ⅹ物镜（A1、A2）或40X物镜（A3）的照相结果， CTC有的在网膜上增殖（A1），有的在皿底附着有分化（A2），有的成为悬浮细胞（A3）。
图4为培养后的CTC荧光免疫检测，上一排，同一视野中的细胞，数量少一些，A1:可见光下相差镜照像; A2：Dapi染色显示细胞核；A3：EpCAM阳性细胞，为上皮细胞，而非血细胞；A4：CD45抗体呈阴性, 表明非白细胞细胞。下一排，CTC高密度，B1: Dapi染色示细胞核; B2: 染EpCAM阳性; B3：CD45抗体呈阴性, 表明非白细胞。
实施例3
采用实施例1的方法，本发明对多种以及多个癌症患者的外周血进行了CTC体外分离培养，CTC体外培养结果如表1所示。
表1
从上述表1的结果中可以看出，本发明的体外分离培养循环肿瘤细胞的方法，可以成功地用于肝癌、胃癌、结直肠癌、宫颈癌、乳腺癌、淋巴癌等患者的外周血CTC及肺癌患者胸水CTC的体外培养；适用范围广泛，具有重要的临床意义。本发明的体外分离培养循环肿瘤细胞的方法，培养成功率高，能够达到80%以上，甚至达到100%。
对比例1 固定剂对细胞成活的影响:
方法：贴壁培养的肺癌细胞系，经胰蛋白酶处理，悬浮于生理盐水或磷酸缓冲液（PBS）中（对照组），用血球计数板测细胞浓度。处理组：细胞悬液加入8％的PFA（多聚甲醛，一种固定剂），最终PFA浓度为0.2％；另一处理组是将细胞悬液与ISET工作液[广州安方生物提供，内有固定剂，上皮性肿瘤细胞过滤技术（Isolation by Size of EpithelialTumor Cells，ISET）]，以1：1（v／v）比例的体积混匀，放置室温，30分钟后，用台酚蓝（最终浓度0.05％）检测细胞活性，死细胞将染成蓝色，检测每100个细胞中的活细胞，重复三次。
成活率＝活细胞总数÷细胞总数。
结果如图5所示，对照组中，生理盐水处理的细胞成活率平均值为95％；磷酸缓冲液处理的细胞成活率平均值为96％。而处理组中，经过PFA处理后肺癌细胞成活率平均值为78％；ISET处理后肺癌细胞成活率平均值为51％。将经过PFA和ISET处理后的细胞进行培养，一天后，未检测到成活细胞。说明固定剂会损伤细胞，降低细胞的活性。本发明中不采用任何固定剂或者类似试剂，采用生理盐水稀释合适的倍数，可以在不加固定剂的情况下避免细胞团聚，还能够非常好的保留CTC的活性。
对比例2 分离采用不同过滤膜的比较
本对比例中，将同一保存的癌症患者的外周血，采用不同类型的微孔膜对稀释后的外周血进行过滤，其它方法均与实施例1相同。微孔膜分别为：
（1）Whatman (沃特曼)微孔膜（代理商：罗氏公司)，产品#：110614，Nuclepore径迹蚀刻膜 NUC PC 25MM 8.0um 100/PK；孔径8微米，每平方厘米孔数：10万。
（2）广州安方生物微孔膜，孔径8微米，型号是FS01，每平方厘米孔数：22.22万。
（3）武汉友芝友微孔膜，CTCBIOPSY纳米微筛, 孔径8微米，型号是YZY-CTC-F100，每平方厘米孔数：9.47万。
（4）高密度微孔阵列膜(Micropore Array): 杭州佰迈医疗科技有限公司，孔径8微米，型号：M-PAC001；每平方厘米孔数：96万个。
分离和活性结果如下表2中所示。
表2
由以上结果可以看出，与其他微孔膜相比，采用本发明高密度微孔阵列膜，不需要控制额外的条件，能够很好的过滤分离CTC，还能够很好的保留CTC的活性，为提供CTC培养的成功率奠定了基础。
对比例3 不同浓度的hEGF的影响
本对比例中各组采用的培养液包括：以体积比为1:1的RPMI 1640和F12的混合物为基本培养基，还包括体积百分比为2%的胎牛血清(FBS)，质量百分比为0.05%的牛血清白蛋白(BSA)，非必需氨基酸(NAA，1×), 抗生素(1×)， 2 μg/mL转铁蛋白，8 ng/L hFGF以及hEGF，其中，各实验组的培养液中hEGF的含量不同，分别为20，100及500 ng／mL，考察CTC培养的成功率，结果如表3所示。
其中，每组中控制相同的接种量（都接种100个CTC，来自我们建立的肝癌CTC初生代细胞系），培养2天后，计算每组增殖的细胞数，得到相对的细胞增殖率。
表3
对比例4 不同浓度的人胰岛素Insulin的影响
本对比例中各组采用的培养液包括：以体积比为1:1的RPMI 1640和F12的混合物为基本培养基，还包括体积百分比为2%的胎牛血清(FBS)，质量百分比为0.05%的牛血清白蛋白(BSA)，非必需氨基酸(NAA, 1×), 抗生素(1×), 2 μg/mL转铁蛋白，人胰岛素, 8ng/L hFGF。各实验组的培养液中人胰岛素Insulin浓度不同， Insulin的浓度分别为5，25及50 μg／mL，考察CTC培养的成功率，结果如表4所示。
其中，每组中控制相同的接种量（都接种100个CTC），培养2天后，计算每组增殖的细胞数，得到相对的细胞增殖率。
表4
对比例5 不同浓度的Insulin和EGF组合对CTC培养的影响
本对比例中各组采用的培养液包括：以体积比为1:1的RPMI 1640和F12的混合物为基本培养基，还包括体积百分比为2%的胎牛血清(FBS)，质量百分比为0.05%的牛血清白蛋白(BSA)，非必需氨基酸(NAA, 1×), 抗生素(1×), 2 μg/mL转铁蛋白，8 ng/L hFGF,人胰岛素以及hEGF，各实验组的培养液中Insulin和EGF的浓度不同，Insulin和EGF的浓度及组合如下表所示，考察CTC培养的成功率，结果如表5所示。
其中，每组中控制相同的接种量（都接种100个CTC），培养2天后，计算每组增殖的细胞数，得到相对的细胞增殖率。
表5
结果分析：
综合表3-5的培养结果可以看出，培养液中，hEGF或人胰岛素Insulin含量增加时，有利于提高CTC体外培养的成功率。而当培养液中hEGF含量为500ng／mL，Insulin的含量为50μg／mL时，培养成功率能够达到80%，说明两者起到了协同作用，大大提高了培养成功率。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本发明的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出某些更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。
Claims (10)
1.一种体外分离培养循环肿瘤细胞的方法，其特征在于，包括：
（1）分离：将癌症患者的外周血或胸水样本用无菌生理盐水稀释，直接采用高密度微孔阵列膜过滤，所述高密度微孔阵列膜上每平方厘米的孔数为90-100万个孔/ cm2，孔径为6-10μm；然后用无菌生理盐水或磷酸缓冲液PBS清洗高密度微孔阵列膜，进行CTC镜检及成活细胞检测；
（2）培养：在无菌操作条件下，将高密度微孔阵列膜转移至培养皿，加入培养液，进行培养，建立循环肿瘤细胞体外培养的方法。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述高密度微孔阵列膜上每平方厘米的孔数为92-98万个孔/ cm2；孔径为6-8μm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，采用高密度微孔阵列膜过滤包括一级过滤或多级过滤；多级过滤时，高密度微孔阵列膜的孔径逐级减小。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，将癌症患者的外周血样本采用无菌生理盐水稀释2-5倍，轻轻充分混匀，放置于室温3~5分钟，然后进行过滤。
5.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，培养液包括基本培养基和添加物，所述基本培养基包括体积比为1:1的RPMI 1640和DMEM/F12；所述添加物的组成及含量包括：体积百分比为2%的胎牛血清FBS，质量百分比为0.05%的牛血清白蛋白BSA，非必需氨基酸NAAS，1X使用浓度，从100X NAAS母液配制，抗生素，1X使用浓度，从1000X三类混合抗生素母液配制，1-2 μg/mL转铁蛋白，5-50 μg/mL人胰岛素, 20-500 ng/L hEGF及5-10ng/L hFGF。
6.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，在37℃细胞培养箱中培养，5％CO2饱和度，每隔3~4天更换培养液；单个CTC经3~5天，长成小细胞团CTM，1~2周长成更大的细胞团，有的CTC细胞团会脱落或分散开来形成单个悬浮细胞或附着分化细胞。
7.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于，采集癌症患者的外周血后，加入CPDA-1抗凝剂，混匀，可在4℃下保存3~5周，备用；外周血与CPDA-1抗凝剂的体积比为1：0.15。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，外周血与CPDA-1抗凝剂混合后，还加入抗生素和/或血小板抑制剂盐酸替罗非班；混合液中，抗生素为1X；血小板抑制剂盐酸替罗非班在混合液中的质量浓度为2-10 μg/mL。
9.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，采用无菌生理盐水或PBS缓冲液清洗高密度微孔阵列膜3~4次，加入PBS缓冲液，进行CTC镜检及成活细胞检测。
10.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于，所述外周血或胸水取自患有癌症的患者，所述癌症包括肝癌，胃癌，结直肠癌，宫颈癌，肺癌，淋巴癌，乳腺癌以及造血系统肿瘤。
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