DE69621790T2

DE69621790T2 - Filtervorrichtung

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Publication number: DE69621790T2
Application number: DE69621790T
Authority: DE
Inventors: Bernard Cerra; Wei-Shou Hu
Original assignee: University of Minnesota
Current assignee: University of Minnesota
Priority date: 1995-03-31
Filing date: 1996-03-21
Publication date: 2003-02-20
Anticipated expiration: 2016-03-22
Also published as: EP0817833B1; JPH11502712A; ATE219140T1; CA2215071A1; EP0817833A1; EP0817833A4; DE69621790D1; JP3692147B2; WO1996030492A1; US5595909A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Zur Zeit ist die Lebertransplantation die einzige Behandlungsart für Patienten mit akutem, fulminantem Leberversagen, die auf unterstützende Therapie nicht ansprechen (Starzl et al. "Liver Transplantation (1)" N Engl J Med (1989) 321: 1092-1099; Langer und Vacanti "Tissue Engineering" Science (1993) 260: 920-926). Der Bedarf an einer Hilfsvorrichtung einer Interims-Leber als Brücke zur Transplantation für Patienten mit Leberversagen ist gut dokumentiert worden (Takahashi et al. "Artificial Liver: State of the Art" Dig Diseases Sci (1991) 36: 1327-1340). Mit der Entwicklung einer künstlichen Leber können Patienten mit Leberversagen unterstützt werden, bis eine Spenderleber verfügbar ist oder bis sich ihre eigene Leber regenerieren kann. Eine solche Vorrichtung würde das Problem des Mangels an Spenderorganen (Busuttil et al. "The First 100 Liver Transplants at UCLA" Ann Surg (1987) 206: 387-402; Vacanti et al. "Liver Transplantation in Children: The Boston Center Experience in the First 30 Months" Transplant Proc (1987) 19: 3261-3266) und begleitende Komplikationen mildern (Walfatne & Cerra "Hepatic Dysfunction in Multiple Organ Failure" In Multiple Organ Failure: Pathophysiology and Basic Concepts of Therapy, Dietch, E. A., Hrsg., (1990) S. 241-260, Thieme Medical Publishers, New York; Shellman et al. "Prognosis of Patients with Cirrhosis and Chronic Liver Disease Admitted to the Medical Intensive Care Unit" Crit Care Med (1988) 16: 671-678).
Tierische Zellen und genetisch veränderte Derivate von ihnen werden oft in Bioreaktoren für die kontinuierliche Produktion von Impfstoffen, monoclonalen Antikörpern und pharmazeutischen Proteinen wie Hormonen, Antigenen, Gewebe-Plasminogenaktivatoren und dergleichen kultiviert. Die Zellen sind im Wesentlichen ein System von Katalysatoren, und das Medium führt zu und entfernt die Nährstoffe und das Wachstum inhibierende Metabolite. Um Nährstoffe zuzuführen und Metabolite zu entfernen, wird das Medium im Bioreaktor entweder periodisch oder kontinuierlich durch einen Flüssigkeitsstrom ausgetauscht. Es werden jedoch wegen der relativ geringen Größe und der kleinen Unterschiede in der Dichte im Vergleich zum Medium unweigerlich Zellen entzogen, wenn das Medium ausgetauscht wird, was in einer relativ niedrigen Zellkonzentration im Bioreaktor resultiert. Als Ergebnis der niedrigen Zellkonzentration ist die Konzentration des gewünschten Zellprodukts im Erntemedium niedrig.
Ein idealer Bioreaktor für tierische Zellen würde die folgenden drei Eigenschaften umfassen:
(1) die Zellen würden in dem Bioreaktor bei hohen Dichten so lange wie möglich in einem lebensfähigen Zustand zurückgehalten werden, mit einer fast unendlichen Verweilzeit;
(2) Verbindungen mit hohem Molekulargewicht, einschließlich teurer Wachstumsfaktoren und der gewünschten Zellprodukte, hätten eine lange, aber endliche Verweilzeit im Bioreaktor, um sowohl die effiziente Nutzung der Nährstoffe durch die wachsenden Zellen als auch die Akkumulation der Zellprodukte auf eine hohe Konzentration zuzulassen; und
(3) Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht einschließlich weniger teurer Nährstoffe und inhibitorischer Verbindungen sollten eine sehr kurze Verweilzeit im Bioreaktor haben, um die Inhibierung des Zellwachstums, der Bildung des Zellprodukts und anderer zellulärer metabolischer Aktivitäten zu reduzieren.
Die Entwicklung einer künstlichen Leber ist ein komplexes Problem. Viele frühere Versuche wie die Plasmapherese, die Hämoperfusion über künstliche Kohle und Harz und die Xenograft-Kreuzzirkulation sind fehlgeschlagen. Anders als das Herz, das eine wichtige physiologische Funktion hat, erfüllt die Leber viele komplexe Aufgaben, die zum Überleben notwendig sind. Es war schwierig, diese Aufgaben in mechanischen Systemen zu entwickeln und aufrechtzuerhalten.
Die Leber ist die metabolische Fabrik, die für die Biotransformation von endogenen und exogenen Abfallmolekülen und für die Synthese von Glucose, Lipiden und Proteinen einschließlich Albumin, Enzyme, Gerinnungsfaktoren und Transportmoleküle für Spurenelemente erforderlich ist. Die Leber hält die geeigneten Plasmakonzentrationen von Aminosäuren und Fettsäuren aufrecht und entgiftet Stickstoffabfälle, Arzneistoffe und andere Chemikalien. Abfallprodukte wie Bilirubin werden konjugiert und über das Gallengangsystem ausgeschieden. Die Proteinsynthese in der Leber und die Biotransformation erhöhen die Komplexität einer Vorrichtung zur Unterstützung der Leber nöch beträchtlich.
Systeme, die Hepatocyten verwenden, um die biochemische Funktion bereitzustellen, sind problematisch, da es schwierig sein kann, Hepatocyten in Kultur zu halten. Unter Standardbedingungen verlieren nicht transformierte Hepatocyten, die auf Plastik kultiviert werden, in etwa 12 bis 24 Stunden den offenen Zellkontakt; flachen ab, werden agranular, verlieren in 3-5 Tagen alle gewebespezifischen Funktionen; und sterben in 1-2 Wochen. (Reid & Jefferson "Culturing hepatocytes and other differentiated cells" Hepatology (1984) Mai- Juni; 4(3): 548-59; Warren et al. "Influence of medium composition on 7-alkoxycoumann Odealkylase activities of rat hepatocytes in primary maintenance culture" Zenobiotica (1988) 18(8): 973-81).
Die Lösung für dieses Problem ist die Verwendung von transformierten Hepatocyten, die viel leichter gezüchtet werden können. Transformierte Hepatocyten werden jedoch oft als schlechte Wahl angesehen, weil selbst gut differenzierte transformierte Zellen ausgeprägte Unterschiede bei den gewebespezifischen Funktionen zum ursprünglichen Gewebe zeigen (Reid & Jefferson (1984) vorstehend). Darüber hinaus werden viele Zelllinien durch Viren transformiert (Aden et al. "Controlled synthesis of HBsAg in a differentiated human liver carcinoma-derived cell line" Nature (1979) S. 615-6; Knowles et al. "Human hepatocellular carcinoma cell lines secrete the major plasma proteins and hepatitis B surface antigen" Science (1980) 209: 497-9). Diese Zelllinien haben das Potential, das transformierende Virus auf den Patienten zu übertragen. Als Resultat ist es zweifelhaft, daß Regulierungsbehörden die Verwendung von transformierten Zellen bei Menschen genehmigen würden, selbst wenn das Risiko der Übertragung nachgewiesenermaßen minimal wäre.
Es wurden viele Wege untersucht, um die Lebensfähigkeit und Funktion von kultivierten Hepatocyten und anderen differenzierten Zellen zu verlängern. Diese Versuche umfaßten die Zugabe von Hormonen und Wachstumsfaktoren zu dem Kulturmedium, die Zugabe von extrazellulären Matrixbestandteilen und das Züchten der Hepatocyten in der Gegenwart einer anderen Zellart. Zellen, die routinemäßig bei den Arbeiten von gleichzeitiger Züchtung mit Hepatocyten verwendet wurden, sind Endothelzellen oder nicht-Parenchym- Leberzellen wie Kupffer-Zellen.
Es ist gezeigt worden, daß die Zugabe von Corticosteroiden zu den Inkubationsmedien das Überleben von kultivierten Hepatocyten verlängert und die Albuminsynthese aufrechterhält, insbesondere in Synergie mit Insulin (Jefferson et al. "Post-transcriptional modulation of gene expression in cultured rat hepatocytes" Mol Cell Biol (1984) 4(9): 1929-34; Dich et al. "Long-term culture of hepatocytes: effect of hormones on enzyme activities and metabolic capacity" Hepatology (1988) 8(1): 39-45). Von DMSO (Dimethysulfoxid) und Phenobarbital ist auch bekannt, daß sie die Lebensfähigkeit und Funktion von Hepatocyten verlängern (Maher, J. J. "Primary hepatocyte culture: is it home away from home?" Hepatology (1988) 8(5): 1162-6). Nicht alle gewebespezifischen Funktionen werden jedoch gleichermaßen unterstützt. Insulin kann einige Funktionen mit einer Wirkung unterstützen, die mit der Konzentration variiert. Wenn nur Insulin zu dem Medium zugegeben wird, wird die Expression von Enzymen des Harnstoffzyklus vermindert. Diesem negativen Effekt kann durch die Zugabe von Glucagon und Dexamethason gegengesteuert werden (Dich et al. (1988), vorstehend).
Hormon-definiertes Medium kann ebenfalls die Funktion und Lebensfähigkeit von Hepatocyten verlängern (Jefferson et al. (1984) vorstehend). Unter Verwendung eines Serumfreien Hormon-definierten Mediums wurde für über 70 Tage eine gute Funktion von Pavian- Hepatocyten gezeigt. Das Medium bestand aus epidermalem Wachstumsfaktor (100 ng/ml), Insulin (10 ug/ml), Glucagon (4 mg/ml), Albumin (0,5 mg/ml), Linolsäure (5 mg/ml), Hydrocortison (10&supmin;&sup6; M), Selen (10&supmin;&sup7; M), Choleratoxin (2 ng/ml), Glycyl-Histidyl-Lysin (20 ng/ml), Transferrin (5 mg/ml), Ethanolamin (10&supmin;&sup6; M), Prolactin (100 ng/ml), Somatotropin (1 ng/ml) und Thyrotropin freisetzendem Faktor (10&supmin;&sup6; M). (Lanford et al. "Analysis of plasma protein and lipoprotein synthesis in long-term primary cultures of baboon hepatocytes maintained in serum-free medium" In Vitro Cell Dev Biol (1989) 25(2): 174-82).
Es ist jetzt klar, daß die extrazelluläre Matrix einen beträchtlichen Einfluß auf die Funktion und das Überleben der Zelle hat. (Bissell & Aggeler "Dynamic reciprocity: How do extracellular matrix and hormones direct gene expression" Mechanisms of Signal Transduction by Hormones and Growth Factors Alan R. Liss, Inc. (1987) 251-62.3) Von Matrixelementen ist gezeigt worden, daß sie den Bedarf an spezifischen Wachstumsfaktoren reduzieren oder ihn überflüssig machen. Unter Verwendung von extrahiertem Bindegewebe der Leber wurden Hepatocyten für über 5 Monate kultiviert und hielten die Albuminsynthese für mindestens 100 Tage aufrecht. Dieser Extrakt repräsentierte etwa 1% des Gewichts der Leber. Ein Drittel des Extrakts bestand aus Kohlenwasserstoffen und Protein vom nicht-Kollagen-Typ; die anderen zwei Drittel waren Kollagene, 43% Typ I, 43% Typ III und der Rest ein undefiniertes Gemisch der anderen, einschließlich Typ IV. (Rojkind et al. "Connective Tissue Biomatrix: Its Isolation and Utilization for Long-term Cultures of Normal Rat Hepatocytes" J Cell Biol (1980) 87: 255-63). Dieses Gemisch muß nicht genau die lokale Umgebung von Hepatocyten widerspiegeln, den peri-sinusoidalen Raum oder den Disse-Raum.
Die Anwesenheit von Matrix im Disse-Raum war kontrovers. Einige Forscher haben anfänglich vorgeschlagen, daß der peri-sinusoidale Raum "leer" sei. Mittlerweile ist anerkannt, daß alle wichtigen Komponenten der Basalmembran in dem oder um den Disse-Raum vorhanden sind. (Bissell & Choun "The role of extracellular matrix in normal liver" Scand J Gastroenterol (1988) 23 (Erg. 151): 1-7).
Heparansulfatproteoglycan bindet sowohl Zellwachstumsfaktoren als auch Zellen. (Saksela et al. "Endothelial cell-derived heparan sulfate binds basic fibroblast growth factor and protects it from proteolytic degradation" J Cell Biol (1988) 107(2): 743-51; Gordon et al. "Heparan sulfate is necessary for adhesive interactions between human early hemopoietic progenitor cells and the extracellular matrix of the marrow microenvironment" Leukemia (1988) 2(12): 804-9). Heparansulfat kann direkt den Hepatocyten-Kern beeinflussen. (Ishihara et al. "Transport of heparan sulfate into the nuclei of hepatocytes" J Biol Chem (1986) 261(29): 13575-80). Hepatocyten sezernieren relativ große Mengen an Heparansulfat in Kultur. (Arenson et al. "Formation of extracellular matrix in normal rat liver: lipocytes as a major source of proteoglycan" Gastroenterology (1988) 95(2): 441-7). Immunologische Untersuchungen identifizierten Typ-I-Kollagen, Typ-III-Kollagen, Typ-1 V-Kollagen, Fibronectin und Laminin im Disse-Raum. (Geerts et al. "Immunogold localization of procollagen III, fibronectin and heparansulfat proteoglycan on ultrathin frozen sections of the normal rat liver" Histochemistry (1986) 84(4-6): 355-62; Martinez-Hernandez, A. "The hepatic extracellular matrix. I. Electron immunohistochemical studies in normal rat liver" Lab Invest (1984) 51(1): 57-74). Normalerweise ist wenig Typ-I-Kollagen im Disse-Raum, obwohl Hepatocyten in Kultur bei der Entdifferenzierung auf Kosten der Typ-III-Kollagen-Synthese eine steigende Typ I-Synthese zeigen. Dieser Effekt dreht sich bei Kulturtechniken um, die die gewebespezifische Hepatocytenaktivitäten unterstützen.
Hepatocyten können auch auf MatrigelTM gezüchtet werden, einer Biomatrix, die von einer Sarkomzelllinie (EHS) produziert wird. MatrigelTM enthält Typ-IV-Kollagen, Laminin, Entactin und Heparansulfat. Auf MatrigelTM behalten Hepatocyten die normale Albuminsynthese 21 Tage bei (Bissell & Aggeler (1987), vorstehend).
Eine nahe Nachbildung der normalen Umgebung des Hepatocyten ist auch mittels der Züchtung von Hepatocyten in einer konfluenten Einzelschicht auf Kollagen versucht worden. Eine zweite Schicht von Typ-I-Kollagen wird zugegeben, um das normale Matrix-"Sandwich" nachzubilden, das sich "oberhalb" und "unterhalb" des Hepatocyten bildet. Diese Technik zeigte für mehr als 42 Tage eine signifikant verbesserte Lebensfähigkeit und Funktion bei der Albuminsynthese (Dunn et al. "Hepatocyte function and extracellular matrix geometry: longterm culture in a sandwich configuration" FASEB (1989) 3: 174-7).
Die Wirkung verschiedener Proteoglycane und Glycosaminoglycane auf die Synthese und genetische Expression der Protein des offenen Zellkontakts wurde ebenfalls sorgfältig untersucht. Die wirksamsten Verbindungen waren Dermatansulfatproteoglycan, Chondroitinsulfatproteoglycan und Heparan. Aus der Leber extrahiertes Heparan war am wirksamsten. Auch Lambda-Carrageen, ein Extrakt aus Tang, war wirksam. (Spray et al. "Proteoglycans and Glycosaminoglycans Induce Gap Junction Synthesis and Function in Primary Liver Cultures" J Cell Biol (1987) 105: 541-55). Letztlich wurde Chitosan, ein Polysaccharid, das in der Schale von Krustentieren und in Membranen von Pilzen gefunden wird, als Faktor vorgeschlagen, der die normale Matrix nachahmen und die Funktion und das Überleben von Zellen fördern kann. (Muzzarelli et al. "Biological activity of chitosan: ultrastructural study" Biomaterials (1988) 9(3): 247-52; Scholz & Hu "A two compartment cell entrapment biorector with three different holding times for cells, high and low molecular weight compounds" Cytotechnology (1990) 4: 127-137).
Eine anderes erfolgreiches Verfahren für die Kultur differenzierter Leberzellen umfaßt die Cokultur mit nicht-Parenchymzellen. Kürzlich wurden Cokulturen von Hepatocyten mit verschiedenen Endothel-Linien verglichen. Die Cokultur zeigte eine signifikant verbesserte Albuminsynthese und Erhaltung der offenen Zellkontakte. Die Zellen wurde in der Gegenwart von Insulin und Dexamethason wachsen gelassen. Die Zugabe von Serum verbesserte die Ergebnisse nicht. Das verbesserte Überleben und die verbesserte Funktion, vermittelt durch die Cokultur, traten nur bei Zellen in enger Nachbarschaft auf und wurden nicht durch die Zellüberstände übertragen. (Goulet et al. "Cellular interactions promote tissue-specific function, biomatrix deposition and junctional communication of primary cultured hepatocytes" Hepatology (1988) 8(5): 1010-8).
Es ist noch kontrovers, ob die nützlichen Wirkungen der Cokultur durch Wechselwirkungen mit der Matrix auftreten oder ob Zell-Zell-Kontakte erforderlich sind.
Es gibt auch Hinweise, daß Lipocyten bei der Matrixproduktion eine wichtige Rolle spielen. Von Lipocyten wird berichtet, daß sie so zahlreich sind wie Kuppfer-Zellen, und es wurde vorgeschlagen, daß sie den überwiegenden Teil von Typ-I-Kollagen, Typ-II-Kollagen, Typ-IV-Kollagen, Laminin und Proteoglycanen produzieren, insbesondere Dermatansulfatproteoglycan und Chondroitinsulfatproteoglycan. (Friedman et al. "Hepatic lipocytes: The principle collagen-producing cells of normal rat liver" PNAS (1985) 82: 8681- 5). Es ist von besonderem Interesse, daß diese spezifischen Proteoglycane diejenigen waren, die am besten offene Zellkontakte unterstützen (Spray et al. (1987), vorstehend).
Viele Techniken der künstlichen Unterstützung wurden während der vergangenen dreieinhalb Jahrzehnte verwendet. Diese umfassen einfache Austauschtransfusionen (Lee & Tink "Exchange transfusion in hepatic coma: report of a case" The Med J Australia (1958) 11: 40-42; Trey et al. "Treatment of hepatic coma by exchange blood transfusion" NEJM (1966) 274(9): 473-81); Plasmapherese mit Plasmaaustausch (Sabin & Merritt "Treatment of hepatic coma in cirrhosis by plasmapheresis and plasma infusion [plasma exchange]" Annals of Internal Medicine (1968) 68(1): 1-6; extrakorporale heterologe oder homologe Leberperfusion (Eisemann et al. "Heterologous liver perfusion in treatment of hepatic failure" Annals of Surgery (1965) 162(3): 329-345; Sen et al. "Use of isolated perfused cadaveric liver in the management of hepatic failure" Surgery (1966) 59(5): 774-781; Kreuz-Zirkulation (Burnell et al. "Acute hepatic coma treated by cross-circulation or exchange transfusions" NEJM (1967) 276(17): 943-953); Hämodialyse (Opolon et al. "Hepatic failure coma (HFC) treated by polyacrylonitrile membrane (PAN) hemodialysis (HD)" Trans ASAID (1976) 22: 701-710); Hämoperfusion über aktivierter künstlicher Kohle (Gazzard et al. "Charcoal haemoperfusion in the treatment of fulminant hepatic failure" Lancet i: 1301-1307); und kürzlicher biokünstliche Lebersysteme (BAL's), die kultivierte Hepatocyten enthalten.
Beispiele für biokünstliche Lebersysteme, die gegenwärtig zur Unterstützung bei Leberversagen untersucht werden, umfassen extrakorporale Bioreaktoren (Arnaout et al. "Development of bioartificial liver: bilirubin conjugation in Gunn rats" Journal of Surgical Research (1990) 48: 379-382; Margulis et al. "Temporary organ substitution by hemoperfusion through suspense of active donor hepatocytes in a total complex of intensive therapy in patients with acute hepatic insufficiency" Resuscitation (1989) 18: 85-94); implantierbare Hepatocytenkulturen wie mikroverkapselte Geltröpfchen (Cai et al. "Microencapsulated hepatocytes for bioartificial liver support" Artificial Organs (1988) 12(5): 388-393) und sphärische Aggregate (Saito et al. "Transplantation of spheroidal aggregate cultured hepatocytes into rat spleen" Transplantation Proceedings (1989) 21(1): 2374-77).
Diese biokünstlichen Lebersysteme haben den Vorteil, daß sie die Entgiftung, die Synthese und Bioprozessierungsfunktionen der normalen Leber durchführen. Nur wenige extrakorporale Bioreaktoren wurden im klinischen Aufbau verwendet (Matsumura et al. "Hybrid bioartificial liver in hepatic failure: preliminary clinical report" Surgery (1987) 101(1): 99-103; Margulis et al. (1989), vorstehend). Die implantierbare Hepatocytenkultur bleibt klinisch ungetestet.
Das Verfahren zum Einschluß von Hepatocyten in mikroverkapselte Geltröpfchen (Hepatocyten-Mikroverkapselung) ist ähnlich dem Verfahren, das erfolgreich bei der Verkapselung von pancreatischen Inseln verwendet wird (O'Shea & Sun "Encapsulation of rat islets of Langerhans prolongs xenograft survival in diabetic mice" Diabetes (1986) 35: 943-46; Cai et al. (1988), vorstehend). Die Mikroverkapselung läßt die Nährstoffdiffusion zu den Hepatocyten und die Diffusion von Metaboliten und Syntheseprodukten von den Hepatocyten zu. Die Mikroverkapselung stellt auch intraperitoneale Hepatocyten mit einer "Immunisolierung" von der Abwehr des Empfängers bereit (Wong & Chang "The viability and regeneration of artificial cell microencapsulated rat hepatocyte xenograft transplants in mice" Biomat Art Cells Art Org (1988) 16(4): 731-739).
Von der Plasmaprotein- und Albuminsynthese (Sun et al. "Microencapsulated hepatocytes as a bioartificial liver" Trans ASAIO (1986) 32: 39-41; Cai et al. (1988), vorstehend); die Cytochrom P450- und Konjugationsaktivität (Tompkins et al. "Enzymatic function of alginate immobilized rat hepatocytes" Biotechnol Bioeng (1988) 31: 11-18); der Gluconeogenese (Miura et al. "Liver functions in hepatocytes entrapped within calcium alginate" Ann NY Acad Sci (1988) 542: 531-32); der Harnstoffbildung (Sun et. al. "Microencapsulated hepatocytes: an in vitro and in vivo study" Biomat Art Cells Art Org (1987) 15: 483-486); und der Produktion von die Leber stimulierenden Verbindungen (Kashani & Chang "Release of hepatic stimulatory substances from cultures of free and microencapsulated hepatocytes: preliminary report" Biomat Art Cells Art Org (1988) 16(4): 741-746) wurde bei in Calciumalginat eingeschlossenen Hepatocyten berichtet.
Aggregierte Hepatocyten wurden als Behandlungsmittel für fulminantes Leberversagen vorgeschlagen. Es existieren viele Verfahren für die Aggregation von Hepatocyten (Saito et al. "Transplantation of spheroidal aggregate cultured hepatocytes into rat spleen" Transplantation Proceedings (1989) 21 (1): 2374-77; Koide et al. "Continued high albumin production by multicellular spheroids of adult rat hepatocytes formed in the presence of liver-derived proteoglycans" Biochem Biophys Res Comm (1989) 161(1): 385-91).
Ausführungen für extrakorporale Bioreaktoren zum Zwecke der künstlichen Unterstützung der Leber umfaßten die Perfusion von kleinen Leberwürfeln (Lie et al. "Successful treatment of hepatic coma by a new artificial liver device in the pig" Res Exp Med (1985) 185: 483-494); Dialyse gegen eine Hepatocytensuspension (Matsumura et al. (1987), vorstehend; Margulis et al. (1989), vorstehend); Perfusion von mehrfachen parallelen Platten (Uchino et al. "A hybrid bioartiflcial liver composed of multiplated hepatocyte monolayers" Trans ASAIO (1988) 34: 972-977); und Hohlfaserperfusion. Es wurde von Studien am Menschen unter Verwendung von extrakorporalen Hepatocytensuspensionen berichtet.
Der erste klinische Bericht über künstliche Leberunterstützung mittels Dialyse gegen eine Hepatocytensuspension wurde 1987 veröffentlicht (Matsumura et al. (1987), vorstehend). Die Vorrichtung bestand aus einer flüssigen Suspension von Rattenhepatocyten (1-2 Liter), die mittels einer Celluloseacetat-Dialysemembran vom Blut des Patienten getrennt war. Jede Behandlung verwendete frische Hepatocyten während einer einzelnen Dialyse von vier bis sechs Stunden (Lauf). Mehrere Läufe reduzierten erfolgreich das Serum-Bilirubin und kehrten in einem einzigen Fall die metabolische Enzephalopathie um.
Über eine kontrollierte Studie aus der UdSSR, die die Dialyse gegen eine Hepatocytensuspension mit der medizinischen Standardtherapie zur Unterstützung von akutem Leberversagen verglich, wurde kürzlich berichtet (Margulis et al. (1989), vorstehend). Die biokünstliche Vorrichtung bestand aus einer kleinen Patrone von 20 ml, die mit Schweinehepatocyten in einer flüssigen Suspension gefüllt war, zusammen mit aktivierten Körnchen aus künstlicher Kohle. Die Patrone wurde durch einen arteriovenösen Scribner- Shunt-Zugang perfundiert. Die Patienten wurden täglich sechs Stunden behandelt. Die Hepatocytensuspension wurde über jeden sechsstündigen Behandlungszeitraum stündlich gewechselt. In der Behandlungsgruppe wurde ein verbessertes Überleben (63%) im Vergleich mit der Kontrollgruppe unter medizinischer Standardtherapie (41%) gezeigt.
Die Kultur von Hepatocyten mit einer Hohlfaserpatrone ist ein anderes Beispiel für eine biokünstliche Leberunterstützung. Herkömmlich werden die Hepatocyten in den extrakapillaren Raum der Hohlfaserpatrone geladen, während Medium, Blut oder Plasma durch das Lumen der Hohlfaser perfundiert werden. Die Zellen können frei in Suspension (Wolf & Munkelt "Bilirubin conjugation by an artificial liver composed of cultured cells and synthetic capillaries" Trans ASAIO (1975) 21: 16-27); an Wände gebunden (Hager et al. "A Prototype For A Hybrid Artificial Liver" Trans ASAIO (1978) 24: 250-253); oder an einen Mikroträger gebunden sein, der den Oberflächenbereich im extrakapillaren Raum beträchtlich erhöht (Arnaout et al. (1990) vorstehend).
Von der Aufnahme von Bilirubin, der Konjugation und der Ausscheidung durch Reuber-Hepatomzellen innerhalb einer Hohlfaserpatrone wurde 1975 berichtet (Wolf & Munkelt (1975), vorstehend). Tumorzellsuspensionen wurden mittels einer Spritze in die Schalenseite des Kompartiments injiziert, während das Bilirubin enthaltende Medium durch den intraluminalen Raum der Hohlfaser perfundiert wurde. Über diese Verfahren wurde klinisch nicht berichtet, möglicherweise wegen des Risikos der Tumoransiedlung durch Hepatomzellen.
Eine andere Hohlfaservorrichtung, die zur Unterstützung der Leber entwickelt wurde, verwendet Hepatocyten, die an Mikroträger gebunden sind, die in den extrakapillaren Raum einer Hohlfaserpatrone geladen werden. In dieser Vorrichtung fließt das Blut durch semipermeable Hohlfasern, was den Austausch von kleinen Molekülen zuläßt. Unter Verwendung dieses Systems wurden erhöhte Spiegel an konjugiertem Bilirubin in der Galle von Glucuronosyl-Transferase defizienten (Gunn) Ratten gemessen (Arnaout et al. "Development of Bioartificial Liver: Bilirubin Conjugation in Gunn Rats" J Surg Research (1990) 48: 379-82). Da die äußere Schale nicht perfundiert wird, werden der gesamte Sauerstoff und alle Nährstoffe durch den Blutstrom des Patienten bereitgestellt. Zusätzlich kann das System ein intaktes in vivo-Gallengangsytem für die Ausscheidung der Gallenabfallprodukte und toxischen Abfallprodukte erforderlich machen.
Für klinische Anwendungen ist es jedoch wünschenswert, die Leber-spezifischen Funktionen der BAL zu erhöhen, wofür mehr Zellen oder eine Erhöhung der Leberspezifischen Funktionen pro Zelle erforderlich sind. Der erste Weg wird üblicherweise nicht in Betracht gezogen, weil es schwierig ist, normale Zellen zu erhalten, die Zellen schwierig zu erhalten sind und der Bioreaktor während der ex vivo-Therapie kein großes Blutvolumen handhaben kann.
Primäre Rattenhepatocyten bilden, wenn sie auf einige modifizierte Oberflächen ausplattiert werden, Aggregate, die verbesserte Leber-spezifische Funktionen pro Zelle zeigen (Koide et al. "Continued High Albumin Production by Multicellular Spheroids of Adult Rat Hepatocytes Formed in the Presence of Liver-Derived Proteoglycans" Biochem Biophys Res Commun (1989) 161: 385-391; Tong et al. "Long-Term Culture of Adult Rat Hepatocyte Spheroids" Exp Cell Res (1992) 200: 326-332). Frisch isolierte Rattenhepatocyten breiten sich, wenn sie mit 30-80% Konfluenz auf positiv geladenen Polystyrol-Oberflächen (Koide et al. "Formation of Multicellular Spheroids Composed of Adult Rat Hepatocytes in Dishes with Positively Charged Surfaces and Under Other Nonadherent Environments" Exp Cell Res (1990) 186: 227-35) ausplattiert wurden, anfänglich aus und scheinen sich zufällig zu bewegen. Nach 48 Stunden scheint die Zellbewegung gerichtet zu sein, wenn die Zellen anfangen, sich zu multizellulären Inseln zu aggregieren, die sich schließlich als frei suspendierte Aggregate in die Suspension abscheiden. Auf diese Weise gebildete Aggregate zeigen einen einheitlichen Durchmesser von etwa 100 um und sind 6-8 Zellschichten dick.
Systeme zur Herstellung von Aggregaten, über die berichtet wurde, umfassen die Kultur von Aggregaten in einer Matrix von Polyurethanschaum in einem Kultursystem mit gepacktem Bett (Ijima et al. "Application of Three Dimensional Culture of Adult Rat Hepatocytes in PUF Pores for Artificial Liver Support System" In: Animal Cell Technology: Basic & Applied Aspects Murakami et al. Hrsg., (1992) S. 81-86, Kluwer Academic Publishers, The Hague, Niederlande), Kultur von Aggregaten in einem Röhrenreaktor, der mit Pyrex-Glaskügelchen beladen ist (Li et al. "Culturing of Primary Hepatocytes as Entrapped Aggregates in a Packed Bed Biorector: A Potential Bioartificial Liver" In Vitro Cell Dev Biol (1993) 29A: 249-254) Kultur von in Calciumalginat eingeschlossenen Aggregaten in einer Kulturkammer mit stoßendem Fließbett (Takabatake et al. "Encapsulated Multicellular Spheroids of Rat Hepatocytes Produce Albumin and Urea in a Spouted Bed Circulating Culture System" Artif Organs (1991) 15: 474-480; Koide et al. "Hepatocyte Spheroid: Differentiated Features and Potential Utilization for Bioreactor of Artificial Liver Support" Extended Abstract, Japanese Association of Animal Cell Technology Annual Meeting, Nov. 9-12, 1993, Nagoya, Japan) und in Kollagen eingeschlossene Aggregate, die in den extrakapillaren Raum eines Hohlfaser-Bioreaktors inokuliert wurden (Sakai und Suzuki "A Hollow Fiber Type Bioartificial Liver Using Hepatocyte Spheroids Entrapped in Collagen Gel" Extended Abstract, Japanese Association of Animal Cell Technology Annual Meeting, 1993, Nagoya, Japan).
Eine gemeinsame Einschränkung jedes dieser Systeme ist die niedrige Zahl an Hepatocyten, die zur Verwendung in dem Bioreaktor erhalten werden können. Ungefähr 50 Millionen bis 75 Millionen Hepatocyten als Aggregate wurden in diesen Studien verwendet. Der Aggregatbildungsprozeß unter Verwendung von stationären Petri-Schalen oder anderen Oberflächen ist lang und arbeitsaufwendig. Die Aggregatbildung geschieht nur innerhalb eines engen Zelldichtebereichs (ungefähr 3-8 · 10&sup4; Zellen/cm²). Von den ursprünglich ausplattierten Zellen bilden nur 30-40% der inokulierten Zellen nach 2-3 Tagen Kultur Aggregate. Um somit 100 Millionen Hepatocyten als Aggregate bereitzustellen, ist ein Inokulat von etwa 300-400 Millionen Zellen erforderlich. Basierend auf den Erfordernissen der Ausplattierungsdichte übersetzt sich dies auf eine Oberfläche von 8000 cm² oder 200 Petri-Schalen von 60 mm Durchmesser. Somit hängt die Verwendbarkeit von rekonstituierten Hepatocyten (Aggregaten) bei der Anwendung in einer biokünstlichen Leber von der Fähigkeit ab, die Bildung von rekonstituierten Hepatocyten mit einer höheren Rate und höherer Effizienz zu bewerkstelligen.
Die Verfügbarkeit einer höheren Zahl von Aggregaten würde eine Maximierung der lebensfähigen Zellen in der BAL ermöglichen, ohne die Größe der Vorrichtung in nachteiliger Weise zu erhöhen.
S. L. Nyberg et al. (1990) Proceedings of the 12th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society 12, 0443-0444 offenbart einen Hohlfaser-Bioreaktor mit drei Abteilungen zur Verwendung als extrakorporale Unterstützung von Patienten mit Leberversagen (künstliche Leber), bei dem Hepatocyten in einer dreidimensionalen Kollagengel-Matrix eingeschlossen sind und in das Lumen der Hohlfaser geladen sind.
DE-A-43 22 746 offenbart ein Verfahren und ein Gerät zur Behandlung von Zellkulturen. In einem Hohlfaser-Bioreaktor zur Kultur von Hepatocyten werden die Hepatocyten in Sandwich-Form zwischen zwei Schichten von Kollagengel eingeschlossen.
Y. Sakai & M. Suzuki (1994) in Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects, Bd. 6, 417-421 (Kluwer Academic Publishers, Niederlande) offenbaren, daß Hepatocyten- Spheroide, die sich rasch in einer Suspensionskultur großen Ausmaßes bilden, mit Kollagen im extrakapillaren Raum eines kleinen Hohlfasermoduls als Modell für eine biokünstliche Leber immobilisiert wurden.
JP-A-02 071 755 offenbart einen Hohlfaser-Bioreaktor, in dem dispergierte Hepatocytenzellen in Kollagengel versiegelt und in die porösen Membranen geladen sind, die das Hohlsystem bilden.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine künstliche Leber bereitzustellen, die Hepatocyten umfaßt, die Organoide bilden, um die Leber-spezifischen Funktionen pro Zelle zu maximieren. Diese Aufgabe wird mit den Merkmalen der Ansprüche erreicht. Eine Kombination von vorgeformten Organoiden und dispergierten Hepatocyten wird in einer kontrahierten Gelmatrix in einer Hohlfaser eingeschlossen, um die Perfusion mit einem luminalen Nährstoffflüssigkeitsstrom zuzulassen.
Fig. 1 zeigt das Ausmaß der Gelverdichtung, wenn Zellen, Organoide oder eine Kombination davon darin eingeschlossen sind. In der Graphik stellt die Kurve, die mit offenen Quadraten bezeichnet ist, 5 · 10&sup6;/ml dispergierte Zellen dar; die gefüllten Quadrate stellen 1 · 10&sup6;/ml dispergierte Zellen dar; die offenen Kreise 2,5 · 10&sup6;/ml Zellen in Organoiden und 2,5 · 10&sup6;/ml dispergierte Zellen; die gefüllten Kreise je 0,5 · 10&sup6;/ml Zellen in Organoiden und dispergierte Zellen; die offenen Dreiecke 5 · 10&sup6;/ml Zellen in Organoiden; und die gefüllten Dreiecke 1 · 10&sup6;/ml Zellen in Organoiden.
Die Fig. 2A und 2B zeigen die Harnstoffproduktion von Zellen in Einzelschichten und von Kollagengel eingeschlossenen Zellen und von Organoiden. Fig. 2A betrifft Einzelschichtkulturen, und Fig. 2B betrifft in Kollagen eingeschlossene Zellen. Die durch Kreise dargestellten Kurven in beiden Darstellungen beziehen sich auf Organoide, und die durch Quadrate dargestellten Kurven in beiden Darstellungen beziehen sich auf Einzelzellen.
Fig. 3 stellt den Spiegel der Albuminproduktion von in Kollagen eingeschlossenen Organoiden und dispergierten Zellen dar. In der Graphik beziehen sich Kreise auf Organoide und Quadrate auf Einzelzellen.
Fig. 4 stellt das Ausmaß an Gelkontraktion bei Verwendung von Organoiden, Zellen und einer Kombination davon dar. Die Gelscheibe hatte eine Dicke von 1,3 mm. In jede Scheibe wurden eine Million Zellen eingebaut. Die offenen Kreise betreffen Organoide; die gefüllten Kreise dispergierte Zellen; die Dreiecke ein 2 : 1-Verhältnis von Zellen in Organoiden zu dispergierten Zellen; und die Quadrate ein 1 : 1-Verhältnis von Zellen in Organoiden zu dispergierten Zellen.
Fig. 5 zeigt die Albuminproduktion von in Kollagen eingeschlossenen aggregierten und nicht aggregierten Zellen.
Fig. 6 zeigt das Ausmaß der Klärung von Lidocain von in ein Gel eingeschlossenen Zellen und Organoiden. In der Figur betrifft die durch Quadrate dargestellte Kurve Organoide und die durch Dreiecke dargestellte Kurve dispergierte Zellen.
Fig. 7 zeigt das Ausmaß an Albuminproduktion von BAL's, die Organoide oder dispergierte Zellen enthalten. Die durch Quadrate dargestellte Kurve betrifft Organoide und die durch Dreiecke dargestellte Kurve dispergierte Zellen.
Fig. 8 zeigt das Ausmaß an Harnstoffbildung von BAL's, die Organoide oder dispergierte Zellen enthalten. Die durch Quadrate dargestellte Kurve betrifft Organoide und die durch Dreiecke dargestellte Kurve dispergierte Zellen.
Eine Bioreaktorvorrichtung, die für die vorliegende Erfindung geeignet ist, ist in US- A-5 605 835 dargestellt. Ein Bioreaktor gemäß dem erfinderischen Prinzip der vorliegenden Erfindung würde im allgemeinen zwei Kammern in einem Gehäuse umfassen, das ein nahes und ein entferntes Ende hat.
Die zwei Kammern werden von einer porösen Membran gebildet. In einer Kammer sind die Hepatocyten und in der anderen Kammer würde das Blut, Plasma oder Serum fließen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Membran in der Form einer Hohlfaser mit poröser Wand, wobei die Hepatocyten im Lumen der Fasern enthalten sind.
Die bevorzugte Membran erlaubt es selektiv den Verbindungen mit niedrigem und hohem Molekulargewicht wie Nährstoffen und Zellprodukten zwischen der Kammer, die die Zellen enthält, und der anderen Kammer zu kreuzen. Die erwünschte Obergrenze der Membran für das Molekulargewicht ist variabel und kann variiert werden, um für einen spezifischen Zweck geeignet zu sein. Somit kann eine geeignete Membran für eine BAL in der Größenordnung von 100 kD sein, um den freien Durchgang der meisten subzellulären Moleküle zuzulassen. Ultrafiltrations-Membranen, die bei dem Bioreaktorsystem der vorliegenden Erfindung verwendet werden könnten, umfassen diejenigen, die aus Polysulfon, Nylon, Polypropylen, Polyester/Polycarbonat, mit Ionen beladene Membranen, Cellophane®, Nitrocellulose, Polyethylen und Keramik hergestellt sind. Einige kommerzielle Beispiele umfassen Polycarbonat- und Polyester-Nucleopore®-Membranfilter von Nucleopore Corporation in Pleasanton, Kalifornien; Polysulfon-PTGC-Membranen von Millipore in Bedford, Massachusetts; und Nitrocellulose-Collodion®-Membranen von Schleicher und Schuell, Inc. in Keene, New Hampshire.
Zum Zwecke der Modifikation eines Reaktors, um als BAL zu dienen, ist es vorzuziehen, einen Hohlfaser-Bioreaktor zu verwenden. Eine geeignete Hohlfaser-Vorrichtung ist das Amicon PN 5407-Modell DH4 von Amicon, einer Abteilung von W. R. Grace & Co. in Danvers, MA, nach Entfernung des Druckkontrollventils und der Filterfritten. In diesem Fall sind die Hohlfasern aus den verschiedenen porösen Membranmaterialien konstruiert, wobei die innere Abteilung der Fasern als die Stelle dient, wo die Organoide und Zellen untergebracht sind. Eine Amicon H1P3-100-Hohlfasermembran-Anordnung, die eine Obergrenze für das Molekulargewicht von etwa 100 000 hat, kann verwendet werden. Die Hohlfasern dieser Anordnung sind aus Polysulfon gebildet, obwohl auch jede geeignete Membranzusammensetzung erfolgreich angewendet werden kann, wie vorstehend diskutiert.
Weil eine prinzipielle Funktion der vorliegenden Vorrichtung die Entgiftung des Bluts, Plamas oder Serums ist, muß die Porengröße so ausgewählt werden, um den Durchgang der meisten bekannte Toxine in die Hohlfasern zuzulassen. Es ist bekannt, daß viele Toxine und Metabolite in der Zirkulation mit Trägermolekülen konjugiert oder daran gebunden sind. Ein allgemeines Trägermolekül ist Albumin. Es ist zum Beispiel bekannt, daß nicht konjugiertes Bilirubin durch Albumin getragen wird. Daher ist es vorteilhaft, Poren zu haben, die den Durchgang von Molekülen etwa der Größe von Albumin durch die Wände der Faser zulassen würden, welches ein Molekulargewicht von etwa 70 000 hat.
Die Hohlfasern können kommerziell in einer Vielzahl von Längen und Durchmessern erhalten werden. In geeigneter Weise sind die Längen angepaßt an die Größe des Gehäuses. Der Faserdurchmesser ist so ausgewählt, daß die Zahl der darin enthaltenen Zellen maximiert ist, der Fluß an Nährstoffmedium maximiert ist, um eine maximale Zelllebensfähigkeit zu erhalten, die Oberfläche in der Faser und die Fläche auf der Außenseite der Faser maximiert ist und eine geeignete Größe erhalten wird, um die Organoide unterzubringen.
Fasern, die einen Durchmesser von bis zu etwa 1 mm haben, werden routinemäßig verwendet und ein Durchmesser von etwa 100 um stellt wahrscheinlich eine praktische Untergrenze für die Größe der Fasern dar. Fasern von eher dazwischenliegendem Durchmesser können verwendet werden, und es ist oft vorzuziehen, Fasern zu verwenden, die einen Durchmesser von etwa 150-400 um haben, um die Zahl an Fasern zu maximieren, die in dem Gehäuse aufrechterhalten werden können. Somit sind auch Fasern von etwa 200-250 um geeignet.
Eine geeignete Hohlfaser-Anordnung hat ein Gehäuse, das räumlich eingeteilte Endteile hat, die eine Kammer dazwischen festlegen. Das Gehäuse hat eine erste und eine zweite Flüssigkeitseinlassvorrichtung, wobei die zweite Flüssigkeitseinlassvorrichtung im allgemeinen gegen die Innenseite der ersten Flüssigkeitseinlassvorrichtung positioniert ist. Das Gehäuse hat auch eine erste und eine zweite Flüssigkeitsauslassvorrichtung, wobei die zweite Flüssigkeitsauslassvorrichtung im allgemeinen gegen die Innenseite der ersten Flüssigkeitsauslassvorrichtung positioniert ist. Während das Gehäuse im allgemeinen zylindrisch ist, ist die Form nicht so beschränkt. Jedes Gehäuse, in dem Hohlfasern untergebracht sein können, kann erfolgreich angewendet werden.
In dem Gehäuse ist mindestens eine selektiv durchlässige Hohlfaser, die durchlässig für den Durchgang von Nährstoffen und Zellprodukten ist, während sie für den Durchgang von Zellen im Wesentlichen undurchlässig ist, und sich über die Länge des Gehäuses erstreckt. Die Hohlfaser teilt die Kammer in einen intrakapillaren Raum in der Hohlfaser und einen extrakapillaren Raum außerhalb der Hohlfaser. Der intrakapillare Raum und der extrakapillare Raum kommunizieren nur durch die Wände der Hohlfaser. Vorzugsweise stellt der intrakapillare Raum eine Zellkammer für Zellen, die in einer ausgewählten Matrix eingeschlossen sind, und ein zweites Lumen zum Durchgang von Nährstoffmedium bereit, während der extrakapillare Raum Raum für Blut, Plasma oder Serum bereitstellt, um die äußere Oberfläche der Fasern zu benetzen. Die Rollen können, wenn erwünscht, umgedreht sein. Vorzugsweise käme eine Vielzahl an Fasern zur Anwendung. Die inneren Lumina der Hohlfasern sind in Fließverbindung mit der ersten Flüssigkeitseinlassvorrichtung und der ersten Flüssigkeitsauslassvorrichtung. Der extrakapillare Raum ist in Fließverbindung mit der zweiten Flüssigkeitseinlassvorrichtung und der zweiten Flüssigkeitsauslassvorrichtung.
Ein Bioreaktorgerät unter Verwendung der Prinzipien der vorliegenden Erfindung stellt eine hohe Sauerstoffübertragung an die eingeschlossenen Zellen bereit, um die Lebensfähigkeit der Zellen in dem Bioreaktor bei niedrigem Scherfluß zu erhalten. Die Ergebnisse zeigen weiterhin, daß ein rasches Anlaufen des Bioreaktorgeräts möglich ist ebenso wie schrittweise Veränderungen von Medium, das Serum enthält, zu Medium, das serumfrei ist und in vielen Fällen sogar zu proteinfreiem Medium. Eine "schrittweise Veränderung" bedeutet, daß die Veränderung eher unmittelbar als graduell ist.
Im allgemeinen wird die zellbiokompatible Matrix oder das zellbiokompatibel Gel hergestellt, wenn die ausgewählten Zellen bei niedrigeren Temperaturen (z. B. 0ºC bis 30ºC), bei niedrigeren pH-Werten (z. B. 2 bis 5,5), bei sowohl niedrigeren Temperaturen als auch niedrigeren pH-Werten oder in einer Lösung von verschiedenem Ionenaufbau mit einer Matrixvorläuferlösung gemischt werden. Der ausgewählte Matrixvorläufer ist vorzugsweise ursprünglich in einer löslichen Form, um eine Zellsuspension zu bilden. Die Zelle- Matrixvorläufer-Suspension wird dann durch eine Einlaßvorrichtung in die Zellkammer eingeführt. Wenn der pH-Wert, die Temperatur oder die Ionen-Charakteristik oder die Wechselwirkung der Polymerkette vom ursprünglichen Wert verändert wird, tritt Polymerisation oder Aggregation ein, wobei die resultierenden Polymerketten unlösliche Aggregate bilden (z. B. der pH-Wert wird auf den Bereich von 6,8 bis 7,4 angehoben, die Temperatur wird auf den Bereich von 37ºC bis 45ºC angehoben). Im allgemeinen werden die unlöslichen Aggregate weiter aggregieren, um Fasern zu bilden. Die Fasern wiederum schließen die Zellen ein und schaffen damit das, was als die im Wesentlichen unlösliche, zellbiokompatible Matrix bezeichnet wird.
Es ist wünschenswert, daß der ausgewählte Matrixvorläufer die Fähigkeit hat, rasch in situ eine im Wesentlichen unlösliche, biokompatible Matrix zu bilden, um die Zellen einheitlich einzuschließen, bevor sich die Zellen absetzen. Der ausgewählte Matrixvorläufer sollte die Fasermatrix vorzugsweise bei einer physikalischen oder chemischen Veränderung in der Zelle-Matrixvorläufer-Suspension bilden. Eine solche Veränderung könnte das Resultat einer Verschiebung des pH-Werts oder der Temperatur sein, oder beides, die Zugabe eines Comonomers oder eines anderen Initiators der Polymerisation oder der Vernetzung oder irgendeine Kombination dieser Verfahren. In Abhängigkeit von dem ausgewählten Matrixvorläufer könnte die gebildete Matrix das Resultat von Polymerisation, Aggregation, ionischer Komplexierung, Wasserstoffbindung oder dergleichen sein.
Zum Zwecke der Vereinfachung sollte verstanden werden, daß, wo immer der Ausdruck Polymer oder Aggregat im Zusammenhang mit Matrixkonstruktion verwendet wird, die Matrix nicht auf Verbindungen mit diesen Charakteristika beschränkt ist. Jede biokompatible, im Wesentlichen unlösliche Matrix, die sich in situ bildet und Zellen einschließt, zumindest anfänglich, wird als im Umfang der vorliegenden Erfindung liegend betrachtet. In ähnlicher Weise sollte der Matrixvorläufer so verstanden sein, daß er alle Verbindungen umfaßt, aber nicht darauf beschränkt ist, die zur Polymerisation oder Aggregation oder Assoziation oder dergleichen tendieren, um die Matrix in situ zu bilden.
Aufgrund der Kontraktion, die möglicherweise von den lebenden Zellen verursacht wird, die darin enthalten sind, wird sich die zellbiokompatible Matrix in einigen Stunden oder Tagen kontrahieren, manchmal bis zu etwa einem Viertel des ursprünglichen Volumens, das von dem Gemisch eingenommen wurde. Für die vorliegende Erfindung ist es für die zellbiokompatible Matrix notwendig, in der Faser zu kontrahieren, um darin ein Lumen für den Durchgang der Nährstoffe bereitzustellen. Eine Zellmatrix, die sich auf etwa 90% des ursprünglichen Volumens kontrahiert, das von dem Gemisch eingenommen wurde, ist erwünscht. Eine Zellmatrix, die sich auf etwa 75% des ursprünglich eingenommen Volumens kontrahiert hat, ist sogar noch besser. Eine Zellmatrix, die sich auf etwa 50% des ursprünglichen Volumens kontrahiert hat, wird sogar noch mehr bevorzugt. Die am meisten gewünschte Zellmatrix wird sich jedoch auf etwa ein Drittel des ursprünglichen Volumens kontrahieren, das von dem Gemisch eingenommen wurde.
Eine Verbindung, von der gefunden wurde, daß sie eine besonders geeignete Matrix bildet, ist Kollagen. Steriles, natives Ateleopeptid Kollagen Typ I von hoher Reinheit ist kommerziell bei Collagen Corporation in Palo Alto, Kalifornien unter dem Handelsnamen VitrogenTM 100 erhältlich. Teleopeptid Kollagen Typ I hat sich auch als nützlich herausgestellt und ist in einer relativ reinen Form erhältlich bei Gottefosse Corporation in Elmsford, New York unter dem Handelsnamen Pancogene STM. Wann immer der Ausdruck Kollagen in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, sollte er so verstanden werden, daß er jeden Typ von Kollagen oder modifiziertem Kollagen umfaßt, das unter optimalen Zellkulturbedingungen wenigstens zum Teil unlöslich ist. Zum Beispiel kann Kollagen gemäß den Verfahren des Patents der Vereinigten Staaten Nr. 4,559,304 von Kasai et al. modifiziert werden, dessen Offenbarung durch Bezugnahme hier eingeschlossen wird.
Die Kollagen-Zell-Lösung wird in die Fasern eingeführt, um sich durch Erhöhung der Umgebungstemperatur auf mehr als etwa 25ºC, vorzugsweise etwa 35-45ºC und idealerweise etwa 37-43ºC in situ abzusetzen.
Ein Kollagen-Chitosan-Gemisch kann auch verwendet werden. Ein geeignetes Chitosan, welches ein Derivat von Chitin ist, bei dem viele der N-Acetyl-Bindungen hydrolysiert wurden, um das freie Amin zu ergeben, kann von den Protan Labs in Redmond, Washington, in einem trockenen Zustand unter der Bezeichnung Ultrapure Chitosan erhalten werden. Wie im Falle von Kollagen sollte erkannt werden, daß auch das Chitosan chemisch modifiziert werden kann und immer noch ein wirksames Mittel zur Bildung der Matrix sein kann. Zusätzlich wurde die in situ-Polymerisation eines Gemischs von Fibrinogen und Thrombin zur Bildung von Fibrin erfolgreich verwendet.
Andere Materialien, die den Erfordernissen dieses Systems entsprächen, umfassen: (1) Polyamine, bei denen die Untereinheiten, die das Polymer bilden, einen pKa-Wert haben, der im allgemeinen von 7 bis 10 reicht, wie Kollagen und Chitosan. Solche Polyamine sind in einem Zellkulturmedium bei pH-Werten löslich, die im allgemeinen im Bereich von 2 bis 5,5 liegen, wenn sie in einer protonierten Form sind, und teilweise unlöslich in einem Zellkulturmedium bei pH-Werten, die im allgemeinen im Bereich von 6,8 bis 7,4 liegen, wenn sie in einer teilweise unprotonierten Form sind; (2) ein Gemisch von wasserlöslichen polyanionischen Polymeren und polykationischen Polymeren. Dieses Gemisch würde mittels Jonenbindungen assoziieren und aus der Lösung ausfallen; und (3) Polymere wie Celluloseether, die in einem Zellkulturmedium bei Temperaturen löslich sind, die von 0ºC bis 30ºC reichen, aber in einem Zellkulturmedium bei höheren Temperaturen unlöslich sind, so wie die auch in Betracht gezogenen, die im allgemeinen von 32ºC bis 45ºC reichen.
In Betrieb wird das ausgewählte Zellnährmedium mit einer peristaltischen Pumpe von einem Mediumvorratsgefäß durch die erste Flüssigkeitseinlassvorrichtung und den/die ersten Mediumkanal/Mediumkanäle zu dem/den Nährmedium-Plattenfenster(n) gepumpt. Eine geeignete Pumpe ist eine Masterflex mit variabler Geschwindigkeit, Kat. Nr. 7533-30, mit Masterflex Silikonschläuchen, Größe 16, von Cole Palmer in Chicago, Illinois. Das Medium bewegt sich weiter durch das/die Nährmedium-Plattenfenster zu dem/den zweiten Mediumkanal/Mediumkanälen und anschließend durch die erste Flüssigkeitsauslassvorrichtung aus dem Bioreaktor heraus.
Hepatocyten können mittels einer Vielzahl von im Stand der Technik anerkannten Verfahren erhalten werden. Eine vorsichtige Behandlung der Organe und Zellen wird empfohlen, um die Lebensfähigkeit zu verbessern. Zum Beispiel ist die Perfusion mit einer Lösung, die ein Verdauungsenzym wie Kollagenase enthält, ein geeignetes Verfahren. Das Tier wird anästhesiert und das Gefäßsystem der Leber isoliert. Die. Leber wird mit einem Puffer perfundiert, vorzugsweise einem Calcium-freien Puffer, der einen Chelator für zweiwertige Kationen enthält, um den Ersatz von Blut in dem Organ zu erhöhen und mit der Auflösung der interzellulären Matrix zu beginnen.
Die Leber wird ausgeschnitten und dann mit einem Puffer perfundiert, der Kollagenase enthält. Die Kapsel wird freigelegt und das Organ wird manipuliert, um die Zellen freizusetzen. Die Zellen werden gewaschen und unter Verwendung von Standardverfahren wie Ausschluß von Trypanblau auf ihre Lebensfähigkeit getestet.
Organoide werden erhalten, indem man die Einzelzellsuspension der Hepatocyten in ein hormonell definiertes serumfreies Medium gibt, das Insulin, Dexamethason, Glucagon, epidermalen Wachstumsfaktor, Leberwachstumsfaktor, Transferrin, Linolsäure, Kupfer, Selen und Zink enthält. Die Zellen werden in eine siliconisierte Spinner-Flasche gegeben und mit etwa 40-120 UpM, vorzugsweise etwa 70-90 UpM und mehr bevorzugt bei 80 UpM in einer angefeuchteten 5%-igen CO&sub2;-Umgebung gerührt. Das Medium kann nach 24 Stunden gewechselt werden und danach alle 2-3 Tage.
Im allgemeinen ist die Dynamik der Organoid-Bildung bezüglich des Artenursprungs der Zellen einheitlich. Man sollte jedoch festhalten, daß der Zeitrahmen, innerhalb dessen sich Organoide bilden, von Art zu Art variieren kann. Üblicherweise häufen sich die Zellen zunächst in Klumpen von Zweien, Dreien, Vieren und dergleichen an. Dann werden im Laufe der Zeit die Klumpen größer, da sich entweder Klumpen verbinden oder einzelne Zellen an größeren Klumpen anheften. Somit können zu einem frühen Zeitpunkt Organoide einen Durchmesser in der Größenordnung von etwa 20-30 um haben, zu einem nächsten Zeitpunkt können die Organoide ihre Größe zu einem Durchmesser von etwa 35-40 um vergrößert haben, bei einer folgenden Messung zu etwa 100-140 um und so weiter. Organoide mit einem Durchmesser von etwa 150-300 um werden routinemäßig beobachtet.
Hinsichtlich der bevorzugten Größe der Organoide, die in die Hohlfasern eingebaut werden sollen, ist festzuhalten, daß eine maximale Lebensfähigkeit mit Organoiden kleinerer Größe gesichert werden kann; jedoch ist es erwünscht, daß eine maximale Zahl an Zellen in dem Bioreaktor enthalten sein soll. Darüber hinaus ist es erwünscht, daß die Zellen Leberspezifische Funktionen behalten, und die Größe der Organoide kann bei der Beibehaltung dieser erwünschten Aktivitäten eine Rolle spielen.
Die Organoide oder Hepatocytenzellmassen, die in die Hohlfasern eingebaut werden sollen, können sich in einen Durchmesser von etwa 30-300 um bewegen. Gewisse Gelegenheiten können vorschreiben, daß die ideale Größe der Zellmassen sich in der Größenordnung von etwa 35-150 um im Durchmesser zu einem engeren Bereich von etwa 40- 70 um im Durchmesser bewegt.
Vorzugsweise sind die Hepatocyten in einem wäßrigen, porösen Gel eingeschlossen, wie Alginat, Kollagen, Agar, Chitosan, Fibrin und dergleichen. Ein Gemisch von Organoiden und Einzelzellen wird zusammengemischt, um die erforderliche Kontraktion des gebildeten Gels in den Hohlfasern zu erhalten, damit sich ein "sekundäres Lumen" oder das "verschlossene Lumen" der Faser bildet, um den Durchgang des Nährmediums zuzulassen.
Das Verhältnis von Organoiden zu Einzelzellen ist optimiert, um eine adäquate. Gelkontraktion mit der maximalen Zahl an eingeschlossenen Zellen sicherzustellen. Ein Verhältnis an Zellen in Organoiden zu Einzelzellen von 1 : 3 bis 3 : 1 kann verwendet werden. Ein bevorzugtes Verhältnis von 1 : 2 bis 2 : 1 ist bevorzugt. Ein Verhältnis von 1 : 1 kann auch vorteilhaft verwendet werden.
Die Matrix-Zell-Lösung wird über die hier vorstehend beschriebenen Öffnungen in die Fasern infundiert. Die Größen der Organoide und die Gesamtzahl an Zellen, die im Lumen der Faser enthalten sein sollen, werden durch Manipulation der Zellzahl in der Matrixlösung vor dem Gelieren angepaßt. Die Zahl an Zellen in Organoiden wird geschätzt, und diese Zahl wird zu der Zahl an Einzelzellen addiert, um die Gesamtzahl an Zellen zu erhalten.
Wie hier vorstehend angedeutet ist es ein Ziel, die maximale Zahl an Zellen in dem Bioreaktor zu erhalten, um eine effiziente Entgiftung des Bluts, Serums oder Plasmas sicherzustellen. Eine geeignete Konzentration der Gesamtzahl an Zellen ist in der Größenordnung von 5-40 · 10&sup6; Zellen pro Milliliter. Eine geeignetere Konzentration ist etwa 20-40 Millionen Zellen pro ml und eine ideale Konzentration ist etwa 30-35 Millionen Zellen pro ml. Es sollte klargemacht werden, daß von dieser idealisierten Zahl an Zellen die Zahl an Zellen, die in Organoiden gefunden wird, dann aufgrund der gewünschten Verhältnisse von Zellen in Organoiden zu Einzelzellen, wie vorstehend diskutiert, berechnet wird. Wenn somit eine Konzentration an Zellen von 30 · 10&sup6; Zellen/ml und ein Verhältnis von 1 : 1 von Organoiden zu Einzelzellen verwendet wird, werden 15 · 10&sup6; Zellen in Organoiden sein und die andere Hälfte der Zellen sind Einzelzellen.
Unter Verwendung der Zellmassen, die Organoide der vorliegenden Erfindung, die durch die hier beschriebenen Verfahren mit einer erhöhten Rate produziert werden, ist es möglich, Leber-spezifische Funktionen zu maximieren und zu erhalten. Wenn man dieses durchführt, erhält man einen verbesserten Bioreaktor, weil die Vorrichtung per se in der Größe reduziert werden kann, das heißt das Gehäuse kann in der Größe reduziert werden und damit das Erfordernis minimiert werden, ein großes extrakorporales Blutvolumen in der Vorrichtung zu haben.
Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden nicht beschränkenden Beispielen beispielhaft dargestellt.

Beispiel I. Schweineorganoide, die in einem gerührten Gefäß gebildet werden, zeigen verbesserte Leberaktivitäten

Ernte von Schweinehepatocyten

Hepatocyten wurden von männlichen Schweinen von 8-10 kg mittels eines in situ- Kollagenase-Perfusionsverfahrens in zwei Schritten gewonnen, ein modifiziertes Verfahren von dem ursprünglich für Rattenhepatocyten entwickelten Verfahren von Seglen (Seglen, P. O. "Preparation of Isolated Rat Liver Cells" Meth Cell Biol (1976) 13: 29-38). Das Schwein wurde zunächst mit Ketamin (100 mg/ml): Rompun (100 mg/ml), 5 ml : 1 ml, IM anästhetisiert, um die Intubation und mechanische Beatmung zuzulassen. Das Schwein wurde dann mit Isofluoran (1,5%) mittels endotrachealer Röhre anästhetisiert und mit Succinylcholin (20 mg IV) paralysiert. In den Bauchraum wurde durch einen bilateralen subkostalen Chevron-Schnitt vorgedrungen.
Die venöse Gefäßversorgung zu und von der Leber wurde vollständig isoliert und mit Schleifen umgangen. Die Leberarterie, der allgemeine Gallengang, das gastrohepatische Omentum und die Zwerchfellvenen wurden abgebunden. Die Portader wurde mit einem Pumpenröhrchen kanüliert und die Perfusion mit 300 ml/min mit oxygenierter Perfusionslösung I (Per I) begonnen. Per I ist eine Calcium-freie Lösung mit 143 mM Natriumchlorid, 6,7 mM Kaliumchlorid, 10 mM Hydroxyethylpiperazinethansulfonsäure (HEPES) (Gibco, Grand Island, NY) und 1 g/l Ethylenglycol-bis-aminoethylether (EGTA) bei pH 7,40. Die suprahepatische und infrahepatische Vena cava wurde abgebunden, und in der infrahepatischen Vena cava wurde ein Schlitz gemacht, um den Perfusions-Rückdruck zu modulieren.
Die Leber wurde ausgeschnitten, in ein großes, steriles Becken gelegt und mit 300 ml/min mit oxygenierter Perfusionslösung II (Per II) perfundiert. Per II bestand aus 100 mM HEPES, 67 mM Natriumchlorid, 6,7 mM Kaliumchlorid, 4,8 mM Calciumchlorid, 1% (Vol./Vol.) Rinderalbumin und 1 g/l Kollagenase-D (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN), pH 7,6. Nach 20-30 min wurde bei sichtbarem und tastbarem Befund, daß sich die Leber auflöste, die Kapsel aufgebrochen, und die Lebersubstanz wurde herausgekratzt und mit kaltem Williams-E-Medium (Gibco) gespült, das mit 15 mM HEPES, 0,2 U/ml Insulin (Lilly), 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 100 ug/ml Streptomycin ergänzt war. Die freigesetzten Zellen wurden durch ein Nylon-Netz mit 100 um-Öffnungen gefiltert und in frischem Williams-E-Medium resuspendiert. Die Lebensfähigkeit wurde mittels Trypanblau- Ausschluß bewertet.
Die isolierten Schweinehepatocyten wurden in hormonell definiertem Kulturmedium, als LTE-Medium bezeichnet, mit einer Konzentration von 0,5-1 · 10&sup6; Zellen/ml resuspendiert. Das Medium war eine Modifikation des Serumfreien Mediums von Enat et al. (Enat et al. "Hepatocyte Proliferation In Vitro: Its Dependence on the Use of Serum-Free Hormonally Defined Medium and Substrata of Extracellular Matrix" Proc Natl Acad Sci USA (1984) 81: 1411-1415), das Williams-E-Basismedium enthielt, das mit 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin, 0,2 Einheiten/ml Insulin (Lilly Co., Indianapolis, IN), 1 nMol/ml Dexamethason, 4 ng/ml Glucagon, 25 ug/ml EGF, 20 ng/ml Leberwachstumsfaktor, 6,25 ug/ml Transferrin, 50 ng/ml Linolsäure, 500 ug/ml Albumin, 0,1 uM CuSO&sub4;·5H&sub2;O, 3 nM H&sub2;SeO&sub3;, 50 pM ZnSO&sub4;·7H&sub2;O und 15 mM HEPES (Gibco) bei pH 7,4 ergänzt war. Alle Ergänzungssubstanzen des Medium waren von Sigma, außer anders angegeben. Die Zellsuspension wurde in siliconisierte Spinner-Flaschen von 250 ml gegeben und mit einem aufgehängten Magnetrührer mit 80 UpM in einem feuchten Inkubator mit 5% CO&sub2; bei 37ºC gerührt. Das Medium wurde 24 Std. nach der Zellinokulation gewechselt und danach alle 2-3 Tage, indem die Bewegung gestoppt wurde, die Schwerkraftsedimentation der Organoide zugelassen wurde, gefolgt vom Absaugen des verbrauchten Mediums und Ersatz mit frischem Medium.
Hepatocyten, die unter gerührten Bedingungen kultiviert werden, bilden innerhalb von 24 Std. Organoide. Während des Zeitraums der Bildung agglomerieren die Zellen zuerst, um multizelluläre Aggregate von unregelmäßiger Form und mit "holperigen" Grenzen zu bilden; einzelne Zellen waren noch unterscheidbar. Eine anschließende Umlagerung und Verdichtung der Zellaggregate ergab Strukturen mit relativ glatten, welligen äußeren Oberflächen, und zu dieser Zeit waren einzelne Zellen nicht mehr voneinander unterscheidbar.
Nach 24 Std. waren fast alle aggregierten Zellen in der Form von Organoiden. Der Durchmesser der Organoide wurde unter einem Umkehrmikroskop unter Verwendung einer 10 · Augenlinse bestimmt, die mit einer Feineinstellskala versehen war. Nur Partikel mit mehr als 30 um Durchmesser wurden gezählt. Die durchschnittlichen Längen entlang zweier senkrecht aufeinander stehender Achsen des Organoids wurde als Durchmesser des Organoids definiert. Zwischen 80-100 wurden ausgewertet, um repräsentative durchschnittliche Durchmesser zu erhalten. Die Organoide wuchsen in der Größe von 40-70 um Durchmesser am ersten Tag zu 100-140 um nach fünf Tagen in Kultur.
Zum Vergleich wurden auch Einzelschichtkulturen durchgeführt. Frisch isolierte Hepatocytensuspensionen (5 · 10&sup5; Zellen/ml) in LTE-Medium wurden verwendet, um Polystyrol-Gewebekulturplatten mit 12 Mulden (Falcon Multiwell, Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) mit 2 ml/Mulde zu inokulieren. Das Kulturmedium wurde täglich durch frisches Medium ersetzt, während das verbrauchte Medium gesammelt und bis zum Test gefroren bei -20ºC aufbewahrt wurde. Während des Beobachtungszeitraums wurden keine Organoide gebildet, obwohl sich bei verlängerter Kultur Organoide bilden.

Die Ultrastruktur von Organoiden, die sich unter gerührten Bedingungen bilden, gleicht der von auf Oberflächen gebildeten Organoiden

Die Raster-Elektronenmikroskopie von Organoiden nach fünf Tagen in Kultur zeigte, daß die meisten relativ sphärisch waren außer einigen mit Hantelform, die sich wahrscheinlich durch Vereinigung von zwei Organoiden bildeten. Bei einer höheren Vergrößerung können ausgedehnte Zell-Zell-Kontakte, zahlreiche Mikrozotten und kleine (2-4 um) Löcher auf der Oberfläche des Organoiden gesehen werden. Solche Löcher wurden häufig an Kontaktstellen von drei Zellen gefunden. Man könnte spekulieren, daß diese Poren auf der Organoid- Oberfläche in Bereichen der Verbindung zwischen benachbarten Zellen liegen und Oberflächenöffnungen von differenzierten Gallenkanälchen ähnlichen Strukturen sind.
Transmissions-Elektronenmikroskopie von Hepatocyten in Organoiden zeigte ausgedehnte Zell-Zell-Kontakte und Zellkerne von runder oder ovaler Form. Zahlreiche Mitochondrien und Lipidtröpfchen verschiedener Größe wurden im Cytoplasma mehrerer Zellen beobachtet. Vorherrschende morphologische Charakteristika in Organoiden sind Verbindungskomplexe wie Desmosomen und Gallenkanälchen ähnliche Strukturen zwischen Hepatocyten. Fortlaufende Kanälchenstrukturen von etwa 0,1 um Durchmesser waren über das ganze Organoid verteilt und können als sich öffnende Poren auf der Organoidoberfläche gesehen werden.
Zahlreiche Mikrozotten drangen in die Strukturen ein. Unter gerührten Bedingungen gebildete Organoide erscheinen strukturell identisch mit denen, die sich in Petri-Schalen bildeten.

Leberspezifische Funktionen von Organoiden, die sich unter gerührten Bedingungen bilden

Harnstoffbildung

Die Harnstoffproduktion von Hepatocyten, die als Einzelschichten und als Organoide gezüchtet wurden, wurde unter Verwendung bekannter Verfahren verglichen. Die Zahl an Hepatocyten, die pro Einheitsvolumen Medium inokuliert wurde, war in beiden Fällen dieselbe. Nach der Messung der Harnstoffkonzentration zu jedem Zeitpunkt wurde die tägliche Harnstoffproduktion berechnet. Die Rate der Harnstoffproduktion, dividiert durch die ursprüngliche Hepatocytenkonzentration, wurde als die spezifische Rate der Harnstoffproduktion genommen.
Die spezifische Produktivität in beiden Kulturen nahm über die ersten drei Tage zu und nahm dann schrittweise ab. Hepatocyten, die als freie Organoide kultiviert wurden, waren bei der Harnstoffproduktion zweimal aktiver als Zellen, die als Einzelschichten auf Gewebekulturplatten gewachsen waren.

Albuminproduktion

Die Albuminsynthese von Organoiden in Spinner-Flaschen und Zellen, die als Einzelschichten gezüchtet worden waren, wurde unter Verwendung bekannter Verfahren wie ELISA oder RIA gemessen und als kumulativer Wert über sieben Tage ausgedrückt. Die spezifischen Albuminsyntheseraten wurden mittels einer linearen Regressionsanpassung der Daten bestimmt.
Die Albuminproduktionsraten für Organoide und Einzelschichtkulturen wurde zu 50 ug/10&sup6; Zellen/Tag bzw. 14 g/10&sup6; Zellen/Tag bestimmt. Organoide waren bei der Albuminproduktion mindestens dreimal aktiver als Einzelschichten.

Lidocainmetabolismus

Die Cytochrom P-450-Funktion von in Kollagen eingeschlossenen Hepatocytenorganoiden wurde durch Beobachtung des Lidocainmetabolismus unter Verwendung bekannter Verfahren ermittelt. Das Verschwinden von exogen zugegebenem Lidocain allein war eine nicht ausreichende Darstellung der P-450-Aktivität, da der Arzneistoff von den Hepatocyten ohne weitere Biotransformation aufgenommen werden könnte. Daher wurde die Produktion von Lidocainmetaboliten, d. h. Monoethylglycinexylidid (MEGX), zusätzlich zur Klärung von Lidocain unter Verwendung bekannter Verfahren gemessen, um die Quantifizierung von P-450 zu bestätigen.
Die Klärung von Lidocain blieb über einen Zeitraum von 21 Tagen bei etwa 28 ug/10&sup6; Zellen/Tag relativ konstant. Die für MEGX spezifische Produktion wurde ebenfalls relativ konstant mit einer Rate von etwa 1,2 ug/10&sup6; Zellen/Tag aufrechterhalten, was die kontinuierliche Funktion des Cytochrom P-450-Enzymsystems zeigt.

Konjugation von 4-Methylumbelliferon (4-MU)

Die Fähigkeit von in Kollagengel eingeschlossenen Hepatocytenorganoiden zur Konjugation wurde durch Untersuchung des 4-MU-Metabolismus unter Verwendung bekannter Verfahren untersucht. Die 4-MU-Konzentration nahm innerhalb von 24 Std. von 65 uM auf unterhalb von 0,1 uM ab. Der glucuronidierte Metabolit 4-MUG tauchte in dem Kulturmedium auf. Eine hohe Glucuronidierungs-Aktivität wurde über eine Zeitraum von 21 Tagen in der Kultur aufrechterhalten. Der sulfatierte 4-MU-Metabolit (4-MUS) konnte mit einer Empfindlichkeit von 1 uM nicht nachgewiesen werden. Diese Aktivität stellt die Fähigkeit von Schweinehepatocyten-Organoiden dar, den Metabolismus der Phase II über lange Zeiträume durchzuführen, während sie in Kollagengel eingeschlossen sind.

Beispiel II. Ratten-Organoide, die in einem gerührten Gefäß gebildet werden, zeigen verbesserte Leberaktivitäten

Ernte von Rattenhepatocyten

Hepatocyten wurden von 4-6 Wochen alten männlichen Sprague-Dawley-Ratten mittels eines modifizierten zweistufigen in situ-Kollagenase-Perfusionsverfahrens (Seglen, P. O. (1976), vorstehend; Nyberg et al. "Primary Culture of Rat Hepatocytes Entrapped in Cylindrical Collagen Gels: An In Vitro System With Application to the Bioartificial Liver" Cytotechnology (1992) 10: 205-215) geerntet. Die Lebensfähigkeit der Hepatocyten nach der Ernte bewegte sich von 85-90%, basierend auf Trypanblau-Ausschluß.

Bildung von Rattenhepatocyten-Organoiden in einem gerührten Gefäß

Frisch geerntete dispergierte Rattenhepatocyten wurden in siliconisierte Spinner- Flaschen von 250 ml mit einer Enddichte von 0,3-1,0 · 10&sup6; Zellen/ml in 100 ml LTE-Medium inokuliert, das identisch ist zu dem für die Bildung von Schweinehepatocyten-Organoiden in Spinner-Gefäßen verwendeten Medium. Das Medium ist verschieden von dem, das für die Bildung von Rattenhepatocyten-Organoiden in Petri-Schalen verwendet wurde. Die Gefäße wurden mit einem aufgehängten Magnetrührer mit 100 UpM in einem feuchten Inkubator mit 5% CO&sub2; bei 37ºC gerührt. Das Medium wurde alle 3-4 Tage gewechselt, indem die Bewegung gestoppt wurde, die Schwerkraftsedimentation der Organoide zugelassen wurde, gefolgt vom Absaugen des verbrauchten Mediums und Ersatz mit frischem Medium.
Rattenhepatocyten, die unter gerührten Bedingungen kultiviert werden, bildeten innerhalb von 72 Std. nach der Inokulation Organoide. Während des ersten 8 Std.-Zeitraums wurde beobachtet, daß die Zellen meistens Dubletts und Tripletts bilden. Nach 24 Std. agglomerierten die Zellen zu Massen von über 30 Zellen. Eine anschließende Umlagerung und Verdichtung der Zellen ergab Populationen von sphärischen Zellstrukturen oder Organoiden, welche einen relativ einheitlichen Durchmesser von 100-140 um und glatte äußere Oberflächen zeigten.
Um die Effizienz der Organoidbildung zu bewerten, wurde die Lebensfähigkeit der Zellsuspensionen während des Bildungszeitraums bestimmt. Einzelzellen und Zellen in gruppierten Massen, die unter Trypanblau-Ausschluß blau erschienen, wurden als nicht lebensfähig und als unfähig betrachtet, an der Organoidbildung teilzunehmen. Es wurde angenommen, daß nur lebensfähige Zellen Organoide bilden können.
An jedem Sammelpunkt wurden 2,5 ml Zellsuspensionen in Zentrifugenröhrchen von 15 ml gegeben und durch Schwerkraftsedimentation in zwei Fraktionen getrennt. Die Zellaggregat-Fraktion bestand hauptsächlich aus Organoiden und Zellaggregaten, die sich innerhalb der ersten zwei Minuten am Boden des Zentrifugenröhrchens von 15 ml absetzten. Diese Fraktion wurde in phosphatgepufferter Salzlösung resuspendiert, mit Ultraschall behandelt und bis zum Test auf Gesamtprotein bei -20ºC aufbewahrt. Die Überstandsfraktion enthielt das Kulturmedium und die meisten der nicht lebensfähigen und nicht aggregierten Zellen, die sich innerhalb der ersten zwei Minuten nach der Probennahme nicht abgesetzt hatten. Alle Fraktionen wurden bei -20ºC aufbewahrt, bis die leberspezifischen Funktionstests durchgeführt wurden.
Nach 72 Std. waren nahezu alle Einzelzellen in dem Spinner-Gefäß nicht lebensfähig und alle Organoide schienen lebensfähig, basierend auf der Fluoreszenzfärbung mit Ethidiumbromid und Fluoresceindiacetat. Ethidiumbromid färbt die Kerne von nicht lebensfähigen Zellen orangerot, und Fluoresceindiacetat färbt das Cytoplasma von lebensfähigen Zellen grün. Die Bestimmung der Ansammlung von nicht lebensfähigen Zellen und dann die Durchführung eines Ausgleichs aller Zellen um das Gefäß herum zeigen an, daß ungefähr 50-80% der inokulierten Zellen Organoide bildeten. Übereinstimmend betrug die Fraktion von Gesamtprotein in der Organoid- und aggregierten Zellfraktion auch etwa 50-80% des Gesamtproteingehalts in dem ursprünglichen Inokulum.

Die Raster-Elektronenmikroskopie zeigt, daß der Durchmesser der Organoide sich im Bereich von etwa 50-200 um bewegte, daß aber die Mehrzahl von etwa einheitlicher Größe mit einem Durchmesser von etwa 120 um und sphärischer Form war. Einzelne Zellen innerhalb der Organoide waren nicht unterscheidbar. Bei einer höheren Vergrößerung können ausgedehnte Zell-Zell-Kontakte, zahlreiche Mikrozotten und kleine Poren auf der Oberfläche des Organoids gesehen werden, die offensichtlich Gallenkanälchen ähnlichen Strukturen entsprechen. Die Transmissionsmikroskopie zeigt klare Hinweise auf offene Zellkontakte zwischen Zellen und ein umfangreiches Netzwerk von mit Mikrozotten ausgekleideten Gallenkanälchen ähnlichen Kanälen. Die Cytoarchitektur und Ultrastruktur von Organoiden scheint die eines in vivo-Leberläppchens nachzuahmen. Die Elektronenmikroskopie zeigt, daß in Spinner-Flaschen gebildete Organoide in der Struktur ähnlich sind zu Organoiden, die sich auf flachen Oberflächen bilden.

Harnstoffbildung

Nach der Messung der Harnstoffkonzentrationen wurde die tägliche Produktion von Harnstoff durch Ratten-Organoide in Spinner-Kulturen berechnet. Die Rate an Harnstoffproduktion, dividiert durch die anfängliche Hepatocytenkonzentration, wurde als die spezifische Harnstoffproduktionsrate genommen.
Die spezifische Produktivität nahm in den ersten 72 Std. ab, vermutlich wegen des 50%-igen Verlusts der Lebensfähigkeit während der Bildung der Organoide. Nach der Bildung der Organoide blieb die spezifische Rate konstant bei etwa 24 ug/106 Zellen/Tag. Durch Normalisierung der Produktionsrate auf Gesamtprotein war die spezifische Produktivität ungefähr 120 ug/mg Protein/Tag.

Albuminsynthese

Die Albuminkonzentrationen in Spinner-Flaschen wurden gemessen, und es wurden kumulative Werte für sieben Tage bestimmt. Die spezifischen Albuminsyntheseraten wurden mittels einer linearen Regressionsanpassung der Daten bestimmt.
Die Albuminsyntheserate für Organoide war 28 ug/10&sup6; Zellen/Tag. Die spezifischen Syntheseraten von Organoiden, die sich auf Petri-Schalen bildeten, waren ähnlich zu denen von Organoiden, die sich in Spinner-Kulturen bildeten.

Beispiel III. In Kollagen eingeschlossene Schweineorganoide von gerührten Kulturen

Kollagengelkontraktion

Die Beobachtung der Gelkontraktion ist für die Anwendung von Organoiden in dem BAL-System wichtig, da die Gelkontraktion für die intraluminale Perfusion von Kulturmedium zu den in einem Hohlfaser-Bioreaktor eingeschlossenen Hepatocyten notwendig ist. Um die Rate an Gelkontraktion zu untersuchen, wurden sowohl Organoide als auch dispergierte Hepatocyten in scheibenförmigen Kollagengele von 22 mm Durchmesser und etwa 1,3 mm Dicke eingeschlossen.
Die Organoide wurden von einer 6 Tage-Spinner-Kultur erhalten, während die dispergierten Zellen unmittelbar nach einer getrennten Hepatocytenernte verwendet wurden. Der Geleinschluß wurde durch die Suspension von Zellen in einem Kollagengemisch, das aus einem 3 : 1 (Vol./Vol.)-Gemisch von Vitrogen 100 und einem vierfach konzentrierten Williams-E-Medium, auf pH 7,4 eingestellt, bestand und dann Ausplattieren der Suspension in eine 12 Mulden-Platte mit 0,5 ml/Mulde durchgeführt.
Die sechs untersuchten Bedingungen waren: (1) 1 · 10&sup6; Zellen als Organoide pro ml Kollagengemisch, (2) 1 · 10&sup6; dispergierte Zellen pro ml Kollagengemisch, (3) 0,5 · 10&sup6; Zellen als Organoide und 0,5 · 10&sup6; dispergierte Zellen pro ml Kollagengemisch, (4) 5 · 10&sup6; Zellen als Organoide pro ml Kollagengemisch, (5) 5 · 10&sup6; dispergierte Zellen pro ml Kollagengemisch, (6) 2,5 · 10&sup6; Zellen als Organoide und 2,5 · 10&sup6; dispergierte Zellen pro ml Kollagengemisch. Als Kontrolle wurden Hepatocyten vor dem Einschluß in Kollagen durch eine 15 Minuten-Behandlung mit 50%-igem Ethanol abgetötet. Die Zahl der Zellen als Organoide wurde basierend auf dem Gesamtprotein pro ml in der 6 Tage-Spinner-Kultur abgeschätzt.
Nach 20 Minuten Inkubation bei 37ºC wurde das Gel gebildet. Anschließend wurde 1 ml an LTE-Medium zu jeder Mulde zugegeben, und die Gele wurden vom Boden der Mulde gelöst, um dem Medium das Erreichen der Unterseite des Gels zu erlauben. Der Geldurchmesser wurde mit einem Lineal entlang von zwei senkrecht aufeinanderstehenden Achsen für jedes Gel gemessen. Jeder Datenpunk in Fig. 1 stellt den Mittelwert von drei Messungen dar. Die Resultate zeigen, daß lebensfähige Hepatocyten für die Kontraktion des Kollagengels erforderlich sind.
Sowohl Organoide als auch dispergierte Zellen waren in der Lage, Kollagengel zu kontrahieren. Die Kontraktionsrate des Gels durch dispergierte Hepatocyten ist jedoch höher als die durch in Organoide eingeschlossene Hepatocyten. Die Kontraktionsrate durch eine Kombination von Einzelzellen und Organoiden fällt zwischen die Raten der separat eingeschlossenen. Die Kontraktion scheint von der Zellkonzentration beinflußt zu sein (Scholtz & Hu Cytotechnology (1990) 4: 127-137; Nyberg et al. Biotechnol Bioeng (1993) 41: 194-203), da das Ausmaß der Kontraktion in Scheiben mit einer dichteren Zellkonzentration höher war. Es ist auch zu erwarten, daß die Kontraktion von der Verteilung der Zellen in dem Gel beeinflußt wird und zu dem Unterschied in der Kontraktionsrate beitragen kann.

Leberspezifische Funktionen von in Kollagengel eingeschlossenen Organoiden

Harnstoffbildung

Dispergierte Zellen und Organoide wurden getrennt in Kollagengelscheiben mit derselben Zellkonzentration eingeschlossen, in Medium eingetaucht und in Platten mit 12 Mulden gezüchtet.
Ein Vergleich der zwei Kultursysteme zeigt, daß die Harnstoffproduktion in der Organoidkultur nach dem Einschluß in Kollagen höher war. Darüber hinaus war die Harnstoffproduktion bei in Kollagen eingeschlossenen Organoiden und dispergierten Zellen stabiler als bei denen, die in freier Suspension oder als Monoschicht vorhanden waren. Nach einem anfänglichen Anwachsen der Aktivität in den ersten drei Tagen erniedrigte sich die Harnstoffproduktionsrate auf ein Niveau ähnlich dem ersten Tag und blieb bis zum Tag 21 relativ unverändert. Der Einschluß von Organoiden und nicht aggregierten Zellen in Kollagengele erweiterte somit diese Aktivität (Fig. 2).

Albuminproduktion

Die Albuminproduktion durch in Kollagen eingeschlossene Organoide und dispergierte Hepatocyten wurde 21 Tage gemessen. Die spezifischen Aktivitäten wurden berechnet und sind in Fig. 3 gezeigt.
Nach einer anfänglichen Periode von anwachsender Aktivität stabilisierten sich die Proben bei ungefähr 50 ug/10&sup6; Zellen /Tag bzw. 18 ug/10&sup6; Zellen /Tag. Die Spiegel wurden für mindestens 21 Tage gehalten. Die Albuminsyntheseaktivität von in Kollagen eingeschlossenen Organoiden war nicht signifikant unterschiedlich von der in freier Suspension oder in Einzelschichten. Dieses Produktionsniveau ist ähnlich der in vivo- Albuminproduktion, die für menschliche Leber berichtet wird (Peters, P. "Proteins and Plasma Protein Metbolism" In Molecular and Cell Biology of the Liver 9 S. 31-64 LeBouton, AV. (1993) Hrsg. CRC Press, USA).

Beispiel IV. In Kollagen eingeschlossene Organoide von Rattenhepatocyten

Kollagengelkontraktion

Organoide von Rattenhepatocyten von einer 48 Std.-Spinnerkultur und frisch geerntete Rattenhepatocyten wurden in verschiedenen Verhältnissen gemischt und in Kollagenscheiben eingeschlossen, die 22 mm Durchmesser hatten und ungefähr 1,3 mm dick waren. Der Einschluß im Gel wurde durch Suspension von Zellen in einem 3 : 1 (Vol./Vol.)-Gemisch von Vitrogen 100 und einem vierfach konzentrierten Williams-E-Medium, auf pH 7,4 eingestellt, und dann Ausplattieren des Zell-Kollagen-Gemischs in eine 12 Mulden-Platte mit 0,5 ml/Mulde durchgeführt. Die vier untersuchten Bedingungen waren: (1) Organoide mit 10&sup6; Zellen/ml ohne dispergierte Zellen, (2) Organoide und dispergierte Zellen mit jeweils 10&sup6; Zellen/ml, (3) Organoide mit 10&sup6; Zellen/ml und dispergierte Zellen mit 0,5 · 10&sup6; Zellen/ml, (4) dispergierte Zellen mit 10&sup6; Zellen/ml. Nach 20 Minuten Inkubation bei 37ºC wurde das Gel gebildet. Anschließend wurde 1 ml an LTE-Medium zu jeder Mulde zugegeben, und die Gele wurden vom Boden der Mulde gelöst, um dem Medium das Erreichen der Unterseite des Gels zu erlauben. Der Geldurchmesser wurde mit einem Lineal entlang von zwei senkrecht aufeinanderstehenden Achsen für jedes Gel gemessen. Jeder Datenpunk in Fig. 4 stellt den Mittelwert von drei Messungen dar.
Ohne die Zugabe von dispergierten Zellen kontrahierte das Gel, das Organoide enthielt, nur zu einem kleinen Ausmaß. Die Anwesenheit von dispergierten Zellen in dem Gel erleichterte die Kontraktion. Der Enddurchmesser war zu etwa 30% kleiner als am Anfang.

Leberspezifische Funktionen von in Kollagengel eingeschlossenen Organoiden, die sich in Petrischalen bilden

Albuminsynthese

In Falcon-Primaria-Kulturschalen (60 · 15 mm) wurden frisch geerntete Rattenhepatocyten mit 1,2 · 10&sup6; Zellen/Platte ausplattiert und in 5 ml Organoid-Medium in einem feuchten Inkubator mit 5% CO&sub2; bei 37ºC inkubiert. Das zur Herstellung von Organoiden auf Primaria-Petrischalen verwendete Medium bestand aus Williams-E-Medium (Gibco Laboratories, Grand Island, NY), das mit 0,2 U/ml Rinderinsulin (Lilly Research Laboratories, Indianapolis, IN), 2 mM L-Glutamin, 15 mM N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2- ethansulfonsäure (HEPES), 100 U/l Penicillin und 100 ug/l Streptomycin (Gibco Laboratories) ergänzt war, wobei zusätzlich 50 ng/ml epidermalem Wachstumsfaktor (EGF), 50 ng/ml Linolsäure, 0,1 uM CuSO&sub4;·5H&sub2;O, 3 nM H&sub2;SeO&sub3; und 50 pM ZnSO&sub4;·7H&sub2;O (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) vorhanden waren. Die Bildung von Organoiden wurde am Tag 4 beobachtet.
Der zelluläre Inhalt von jeder Petrischale, die eine Kombination von nicht aggregierten Zellen, Klumpen bildenden Zellen und Organoiden enthielt, wurde durch vorsichtiges Pipettieren entfernt. Der Inhalt von jeder Platte wurde in eine Pipette von 10 ml aufgezogen, und man ließ ihn 1 Minute infolge der Schwerkraft absetzen. Das untere Viertel von jeder Probe, daß zumeist aus Organoiden und aggregierten Zellen bestand, wurde als die Organoid- Fraktion betrachtet. Die oberen Dreiviertel, die zumeist aus nicht aggregierten Zellen bestanden, wurden als die dispergierte Zellen-Fraktion betrachtet.
Basierend auf dem Gesamtproteingehalt wurden gleiche Zahlen an Hepatocyten in der Organoid-Fraktion und der dispergierten Zellfraktion in zylindrische Kollagengele eingeschlossen und in frischem Organoidmedium inkubiert. Eine nicht getrennte Zellsuspension, die aus einem Gemisch aus aggregierten und nicht aggregierten Zellen bestand, wurde ebenfalls 4, 5 Tage nach dem Ausplattieren in zylindrischen Gelen in Kollagen eingeschlossen.
Medium von den drei verschiedenen Zuständen wurde 7 Tage nach dem Ausplattieren oder 2,5 Tage nach dem Einschluß gesammelt und auf die Albuminkonzentration analysiert. Die Resultate sind in Fig. 5 gezeigt. Die Daten wurden auf das Gesamtzellprotein normalisiert, das anfänglich in jeder Kultur vorhanden war. Eine ungefähr zweifach höhere Aktivität der Albuminsynthese wurde bei den in Kollagen eingeschlossenen Organoidkulturen im Vergleich mit den in Kollagen eingeschlossenen dispergierten Zell-Kulturen beobachtet.
Die Beiträge von den zwei Zellfraktionen waren ungefähr gleich dem Niveau des von dem nicht getrennten Zellgemisch produzierten Albumins.
Die drei in Kollagen eingeschlossenen Kulturen wurden auch mit Zellen verglichen, die Organoide gebildet hatten und die in für die Dauer desselben Experiments in Primaria- Schalen gehalten worden waren. In Übereinstimmung mit den in Kollagen eingeschlossenen Kulturen wurden die Schalen 4,5 Tage nach der Modulation mit frischem Organoidmedium versehen, und die Albuminsynthese wurde nach 7 Tagen Inkubation gemessen. Die Resutate zeigen, daß selbst bei Einschluß in Kollagengel die nicht getrennte Zelleinschlußkultur in der Lage war, ein hohes Niveau an Albuminsynthese aufrechtzuerhalten. Das Gemisch an Organoiden und nicht aggregierten Zellen, das in Petrischalen aufrechterhalten worden war, zeigte vergleichbare Niveaus an Albuminsynthese.

Lidocainmetabolismus

Die Raten der Klärung von Lidocain wurden als ein Indikator der P-450 Enzymaktivität gemessen. Fraktionen von Organoiden und dispergierten Zellen von einer 4,5 Tage-Kultur in einer Petrischale wurden in zylindrische Kollagengele mit etwa gleichen Mengen an Gesamtprotein eingeschlossen. Einzelzellen, die unmittelbar nach der Ernte von Ratten in zylindrische Kollagengele eingeschlossen wurden, wurden als Kontrolle bei diesem Experiment mit einbezogen. Die zylindrischen Gele wurden in Mulden gegeben, die 2 ml vorgewärmtes Organoidmedium enthielten, das 12 ug/ml Lidocain enthielt. In den folgenden fünf Tagen wurde das verbrauchte Medium gesammelt und täglich durch frisches Medium ersetzt. Die gesammelten Proben wurden auf Klärung von Lidocain analysiert.
Durch Korrelation der Zellzahl mit dem Gesamtproteingehalt wurde ein durchschnittlicher zellulärer Proteingehalt von 2,0 mg/Zelle erhalten und verwendet, um eine spezifische Klärungsrate von Lidocain zu bestimmen. Beim Einschluß in zylindrische Kollagengele zeigten die Fraktionen von Organoiden und dispergierten Zellen eine durchschnittliche Klärungsate von 6,2 ± 0,5 pg/Zelle/h. bzw. 3,2 ± 0,4 pg/Zelle/h (Fig. 6). Die Rate, die bei zylindrischen Kollagengelen mit eingeschlossenem Organoid erhalten wurde, ist ungefähr zweifach höher als bei den Kulturen mit eingeschlossenen dispergierten Zellen und mehr als dreifach höher als die Rate von 1,7 ± 0,2 pg/Zelle bei der Kontrollkultur. Die Rate der Kontrollkultur ist in guter Übereinstimmung mit einer kürzlich berichteten spezifischen Klärungsrate von 2,1 ± 0,2 pg/Zelle/h für statische Kulturen von in Kollagen eingeschlossenen Einzelzellhepatocyten.

Ultrastruktur von eingeschlossenen Organoiden

Organoide wurden in Primaria-Schalen 4, 5 Tage gezüchtet und in Kollagen eingeschlossen. Die in Kollagen eingeschlossenen Organoide wurden zwei Tage in Organoidmedium gezüchtet, dann fixiert und für die mikroskopische Beobachtung gefärbt. Die Rasterelektronenmikroskopie zeigte, daß individuelle Zellen innerhalb des Organoids nicht unterschieden werden konnten. Die Gesamtstruktur der Organoide blieb nach zwei Tagen Einschluß in Kollagen intakt. Wenn sie unter einem Umkehrmikroskop betrachtet wurden, erschienen die Kollagengele kontrahiert, vermutlich weil nicht aggregierte Hepatocyten, die vor dem Einschluß nicht völlig von Organoiden getrennt werden konnten, in der Lage sind, die Kollagenfasern zu kontrahieren.
Ähnlich den Organoiden in Petri-Schalen scheinen in Kollagen eingeschlossene Organoide einen umfangreichen Zell-Zell-Kontakt, reichlich Mikrozotten und kleine 2-4 um- Öffnungen auf der Oberfläche der eingeschlossenen Organoiden zu zeigen. Die Loch- oder Porenstrukturen, die um Zellverbindungen lokalisiert sind, können eine differenzierte und polarisierte zelluläre Morphologie von Hepatocyten in Organoiden anzeigen.
Elektronenmikroskopische Transmissionsaufnahmen von in Kollagen eingeschlossenen Organoiden zeigen eine Ultrastruktur, die ähnlich der ist, die für Organoide in Petrischalen beobachtet wurde. Hepatocyten auf der äußersten Schicht sind abgeflacht, mehr epithelial in der Morphologie und haben ein geringes Cytoplasmavolumen mit großen Zellkernen. Die Zellen, die das Innere der Organoide umfassen, sind kubisch und haben Zellkerne kleinerer Größe mit einem größeren Cytoplasmavolumen. Die Zellmembranen und die perinucleären Strukturen blieben intakt; Mitochondrien mit Matricularkörperchen, Peroxisomen, Lipidtröpfchen, Glycogenkörnchen, intaktem Golgi-Apparat und dekoriertem rauem endoplasmatischem Reticulum waren alle sichtbar. Das umfangreiche Netzwerk von Gallenkanälchen ähnlichen Strukturen zwischen den Hepatocyten wurde beibehalten. Die Organisation der Hepatocyten innerhalb der in Kollagen eingeschlossenen Organoide war ähnlich der innerhalb von suspendierten Organoiden. Ein auffallender Unterschied zwischen Organoiden in Petrischalen und den in Kollagen eingeschlossenen ist, daß die äußersten Hepatocyten der letzteren ausgiebig mit Mikrozotten ähnlichen Auswüchsen bedeckt sind. Bei Organoiden, die in Petrischalen gehalten wurden, waren die Oberflächenmikrozotten auf der äußeren Schicht von Zellen weniger zahlreich und üblicherweise in Bereichen in und um die Verbindungen zwischen benachbarten Hepatocyten lokalisiert.

Beispiel V. Biokünstliche Leber (BAL)

Ein Hohlfaser-Bioreaktor kann durch Aufrechterhaltung von in Matrix eingeschlossenen Hepatocyten und Hepatocytenorganoiden innerhalb der Fasern und Perfusion eines erhaltenden Nährmediums durch das Lumen entlang des Raums, der durch die Kontraktion der Matrix gebildet wird, und Fließen von Blut um die Fasern im extrakapillaren Raum als biokünstliche Leber verwendet werden.
Somit fließt der Strom an Blut, Serum oder Plasma, der entgiftet werden soll, durch die Schalenseite. Statt im extrakapillaren Schalenraum zu verweilen, sind Zellen wie Hepatocyten innerhalb des Lumens der Hohlfaser, eingeschlossen in eine Gelmatrix. Diese Konfiguration wird durch zunächst Suspension von Hepatocyten in einer Lösung von Kollagen oder einem Gemisch von Kollagen und extrazellulären Matrixkomponenten erreicht. Dann wird der pH- Wert auf 7,4 eingestellt und die Zellsuspension in das Lumen der Hohlfasern inokuliert. Eine Temperaturveränderung von 4ºC auf 37ºC induziert die Bildung von Kollagenfaser. Das Ergebnis ist der Zelleinschluß in einem unlöslichen, fasrigen und hoch porösen, zylindrischem Gel.
Nach der Inokulation kann die Querschnittsfläche des Gelmatrix-Zylinders so viel wie 75% kontrahieren. Das ermöglicht die Perfusion des Lumens der Hohlfaser, sogar wenn es zuerst mit der Gelmatrix gefüllt worden war. Der molekulare Austausch geschieht durch die Poren in der Hohlfaser. Medium mit Bestandteilen mit hohem Molekulargewicht fließt durch die Hohlfaser, die einen kontrahierten Kern von Hepatocyten enthält, die in eine Biomatrix eingebettet sind, durch die Einlaßöffnung der Hohlfaser zu der Auslaßöffnung der Hohlfaser.
Diese Technik wurde bei vielen Zelllinien angewandt, einschließlich Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters, Hep2-, HepG2-, Vero-, 293-Zellen und normalen diploiden menschlichen Leberzellen. Die Untersuchung von mit Hämotoxylin und Eosin (H & E) gefärbten Dünnschnitten von menschlichen Hepatoblastom (HepG2)-Zellen innerhalb einer kontrahierten Gelmatrix nach 7 Tagen zeigte, daß die Gewebedichte und die Zellarchitektur der in vivo-Histologie stark gleichen.
Der Bioreaktor bietet klare Vorteile gegenüber anderen Konfigurationen. Zellen können bei einer Dicht nahe der von Gewebe kultiviert werden. Bei hoher Dichte beanspruchen Zellen viel weniger Platz und reduzieren somit die Größe des Bioreaktors. Zellen erhalten auch die Vorteile von engem Kontakt mit nur minimalen Einschränkungen bei Sauerstoff und Nährstoffen. Bei hoher Dichte können Säugerzellen besser die gewebespezifische Funktion erhalten.
Die Bioreaktorkonfiguration ermöglicht auch die Manipulation der lokalen Umgebung der Hepatocyten. Matrixbestandteile, die die differenzierte Hepatocytenfunktion unterstützen, können in das Gel eingebaut werden. Die Möglichkeit der Perfusion des inneren Lumens stellt Wachstumsfaktoren mit hohem Molekulargewicht bei hohen Konzentrationen bereit.
Ein anderer Vorteil eines solchen Systems ist, daß verschiedene Zelltypen gemeinsam in dem Gel eingeschlossen werden können, die mögliche synergistische Wirkungen bereitstellen, die die gewebespezifische Funktion verbessern können.
Die Erfindung ist somit in der Lage, viele Faktoren einzuschließen (Medium, Gelmatrix, gemeinsame Kultur, hohe Zelldichte), die zur Erhaltung von leberspezifischen Funktionen notwendig oder nützlich sind. Sie kann als biokünstliche Leber zur Unterstützung von Patienten bei Leberversagen verwendet werden.

Beispiel VI BAL aus in Kollagen eingeschlossenen Schweineorganoiden

Eine Polysulfon-Hohlfaserpatrone (HIP3-100, Amicon, Danvers, MA) mit einer nominalen Molekulargewichtsausschlußgrenze (MWCO) von 100 Kilodalton (kD), einem inneren Durchmesser von 1,1 mm und einem Gesamtlumenvolumen von 10 ml wurde als BAL verwendet. Die Hohlfaserpatrone wurde 30 Minuten bei 121ºC autoklaviert, während sie in destilliertes Wasser eingetaucht war. Andere Teile der Kulturanordnung einschließlich des Oxygenierapparats, des Vorratsgefäßes für die Medien, der pH-Sonde und der Sonde für gelösten Sauerstoff wurden separat sterilisiert. Der gesamte Aufbau wurde aseptisch zusammengebaut. Der Bioreaktor wurde in einem Hohlfaser-Zellkulturinkubator, Acusyst Maximizer-1000 (Cellex Biosciences Inc., Coon Rapids, MN) aufgebaut, der mit einem Mikroprozessor gesteuert wurde, um den pH-Wert und gelösten Sauerstoff durch Gasmischung zu halten.
Frisch geerntete primäre Schweinehepatocyten wurden in Spinner-Kulturen mit 1 · 10&sup6; Zellen/ml in LTE-Medium inokuliert. Nach 24 Stunden hatten ungefähr 95% der Zellen Organoide gebildet, während die restlichen 5% als Einzelzellen suspendiert blieben. Die meisten der Einzelzellen waren noch lebensfähig, gesehen mittels Färbung mit Ethidiumbromid/Fluoresceindiacetat zur Feststellung der Lebensfähigkeit durch Zweifachfluoreszenz. Zu dieser Zeit wurden insgesamt 120 ml aus dem Spinner-Gefäß entnommen, in 50 ml Zentrifugenröhrchen aufgeteilt und zu einem weichen Pellet zentrifugiert (34 g, 2 min). Nach dem Absaugen des Überstands wurde das Pellet dann in einer vorgemischten Kollagenlösung resuspendiert. Die Lösung wurde bei 4ºC durch Mischen von 15 ml Vitrogen, einem Typ-I-Kollagen, und 5 ml vierfach konzentriertem Williams-E- Medium hergestellt. Der pH-Wert des Gemischs wurde durch tropfenweise Zugabe von sterilem 1 N Natriumhydroxid auf 7,4 eingestellt.
Nach der Suspension des Organoidpellets in der Kollagenlösung wurde das Zell- Kollagen-Gemisch langsam in den Lumenraum der Hohlfaserpatrone injiziert. Insgesamt ungefähr 10 ml Lösung wurden in den Lumenraum injiziert, oder ungefähr 60 · 10&sup6; Zellen. Vor dem Einbringen der Patrone in die Kulturanordnung wurde die gesamte Patrone zunächst bei 37ºC 10 Minuten in einen Inkubator gebracht, um die Gelierung des Kollagengemischs zuzulassen. Ungefähr 400 ml vorgewärmtes LTE-Medium, das mit 4-Methylumbelliferon (4- MU) versehen war, wurden mit 20 ml/min umgewälzt. Nach 24 Stunden wurde die Perfusion des Lumens mit Medium allein mit 9 ml/min gestartet. Das Medium von dem intraluminalen Ausfluß wurde nach einer Passage verworfen. Alle drei Tage ließ man das Medium aus dem extrakapillaren Kreislauf auslaufen und füllte mit frischem Medium wieder auf, das 12 ug/ml 4-MU enthielt. Von dem sterilen Septum des extrakapillaren Kreislaufs und den Lumenauslässen wurden Proben entnommen und bei -20ºC aufbewahrt, bis Messungen von Albumin, Harnstoff, 4-MU und Metaboliten durchgeführt wurden. Lidocain wurde zusammen mit 4-MU zugegeben, aber wegen der Adsorption von exogenem Lidocain an die Kulturanordnung konnte eine Bewertung der Klärung von Lidocain durch die Zellen nicht einfach vorgenommen werden.

Die leberspezifischen Funktionen sind in BAL aus eingeschlossenen Organoiden höher als in BAL aus dispergierten Zellen

Albuminsynthese

Albuminsyntheseprofile wurden für den extrakapillaren Raum und den Lumenauslass für BALs mit eingeschlossenen Organoiden und eingeschlossenen dispergierten Zellen erhalten. Ein Ausgleich von Material, das um den Hohlfaser-Bioreaktor herum entnommen wurde, wurde durchgeführt, und es wurde eine kumulative Gesamtrate von 0,25 mg/Tag für die BAL aus eingeschlossenen Organoiden und von 0,15 mg/Tag für die BAL aus dispergierten Zellen (Fig. 7) erhalten. Durch Division dieser Werte durch die geschätzte Zahl von Hepatocyten in der BAL, bestimmt durch die Gesamtproteinanalyse, wurden spezifische Albuminsyntheseraten von 0,2 pg/Zelle/Std. bzw. 0,1 pg/Zelle/Std. erhalten.

Harnstoffbildung

Harnstoffbildungsprofile wurden für den extrakapillaren Raum und den Lumenauslass für BALs mit eingeschlossenen Organoiden und eingeschlossenen dispergierten Zellen erhalten. Ein Ausgleich von Material, das um den Hohlfaser-Bioreaktor entnommen wurde, wurde durchgeführt, und es wurde eine kumulative Gesamtrate von 2,57 mg/Tag für die BAL aus eingeschlossenen Organoiden und von 1,16 mg/Tag für die BAL aus dispergierten Zellen (Fig. 8) erhalten. Durch Division dieser Werte durch die geschätzte Zahl von Hepatocyten in der BAL, bestimmt durch die Gesamtproteinanalyse, wurden spezifische Harnstoffbildungsraten von 1,8 pg/Zelle/Std. bzw. 0,8 pg/Zelle/Std. erhalten.

4-MU-Metabolismus

Die Fähigkeit zur Konjugation von in Kollagen eingeschlossenen Hepatocytenorganoiden in einer BAL-Vorrichtung wurde durch Bewertung des 4-MU- Metabolismus untersucht. Alle drei Tage ließ man Medium vom extrakapillaren Kreislauf auslaufen und füllte mit frischem LTE-Medium wieder auf, das 35 uM 4-MU enthielt. Die tägliche Probennahme zeigte, daß die Konzentrationen an 4-MU innerhalb von 24 Std. von 35 uM auf unter 1 uM abnahmen. Der glucuronidierte Metabolit 4-MUG erschien in dem Kulturmedium. Eine hohe Glucuronidierungsaktivität wurde für über 10 Tage in der Kultur aufrechterhalten. Der sulfatierte 4-MU-Metabolit (4-MUS) konnte mit einer Testempfindlichkeit von 1 uM nicht nachgewiesen werden. Diese Aktivität stellt die Fähigkeit von Schweinehepatocyten-Organoiden dar, Metabolismus der Phase II über lange Zeiträume in einer BAL-Vorrichtung durchzuführen.

Beispiel VII BAL aus in Kollagen eingeschlossenen Rattenorganoiden

Eine Polysulfon-Hohlfaserpatrone (HIP3-100, Amicon, Danvers, MA) mit einer nominalen Molekulargewichtsausschlußgrenze (MWCO) von 100 Kilodalton (kD), einem inneren Durchmesser von 1,1 mm und einem Gesamtlumenvolumen von 10 ml wurde als BAL verwendet. Die Hohlfaserpatrone wurde 30 Minuten bei 121ºC autoklaviert, während sie in destilliertes Wasser eingetaucht war. Andere Teile der Kulturanordnung einschließlich des Oxygeniergeräts, des Vorratsgefäßes für die Medien, der pH-Sonde und der Sonde für gelösten Sauerstoff wurden separat sterilisiert. Der gesamte Aufbau wurde aseptisch zusammengebaut. Der Bioreaktor wurde in einem Hohlfaser-Zellkulturinkubator, Acusyst Junior (Cellex Biosciences Inc., Coon Rapids, MN) aufgebaut, der mit einem Mikroprozessor gesteuert wurde, um den pH-Wert und gelösten Sauerstoff durch Gasmischung zu halten.
Frisch isolierte primäre Rattenhepatocyten wurden auf 60 · 15 mm-Falcon-Primaria- Kulturschalen (Becton Dickinson Laboratories, Oxnard, CA) mit einer Dichte von 5,3 oder 7,4 · 10&sup4; Zellen/cm² ausplattiert und in 5 ml Organoidmedium inkubiert. Nach 4 Tagen wurden die Organoide und die nicht aggregierten Hepatocyten durch vorsichtiges Pipettieren aus den Schalen entfernt. Das Gemisch aus Organoiden mit nicht aggregierten Zellen wurde vorsichtig zentrifugiert (34 g, 2 min), der Überstand wurde abgesaugt und das Pellet in einer vorgemischten Kollagenlösung resuspendiert. Die Lösung wurde durch Mischen von 15 ml Vitrogen, einem Typ-I-Kollagen, und 5 ml vierfach konzentriertem Williams-E-Medium bei 4ºC hergestellt. Der pH-Wert des Gemischs wurde durch tropfenweise Zugabe von sterilem 1 N Natriumhydroxid auf 7,4 eingestellt. Das Kollagen-Zell-Gemisch wurde in den Lumenraum der Hohlfaserpatrone inokuliert. Ungefähr 500 ml vorgewärmtes Organoidmedium wurden mit 200 ml/min auf der extrakapillaren Seite umgewälzt, um die Gelierung der Kollagenmatrix zu induzieren. Nach der Gelierung oder ungefähr 30 Minuten wurde die extrakapillare Umwälzrate des Mediums auf 35 ml/min reduziert. Innerhalb der ersten Stunde wurde das extrakapillare Medium durch Injektion von Lidocain-HCl (Abbott Laboratories, North Chicago, IL) in das extrakapillare Mediumvorratsgefäß mit 12 ug/ml Lidocain versehen. Nach 24 Stunden wurde die Lumenperfusion mit Organoidmedium mit 9 ml/Std. initiiert. Das Medium von dem intraluminalen Ausfluß wurde nach einer Passage verworfen. Nach 48 Stunden wurde das Medium von dem extrakapillaren Kreislauf abgelassen und mit frischem Organoidmedium aufgefüllt, das 12 ug/nil Lidocain enthielt. Von dem sterilen Septum des extrakapillaren Kreislaufs und der Lumenauslässe wurden Proben entnommen und bei -20ºC bis zur Messung von Albumin, Lidocain und seinen Metaboliten aufbewahrt.
Zwei verschiedene Zellkonzentrationen wurden für die Inokulation des Bioreaktors verwendet. Für die Inokulation mit niedriger Zellkonzentration wurden Hepatocytenorganoide von 54 Primaria-Kulturschalen hergestellt, von denen jede mit 1,5 · 10&sup6; Zellen, suspendiert in 5,0 ml Organoidmedium, beimpft worden war. Für die Inokulation mit hoher Zellkonzentration wurden 152 Primaria-Kulturschalen mit jeweils 2,1 · 10&sup6; Zellen beimpft. Nach 2 Tagen Kultur wurde das Medium ersetzt. Organoide und nicht aggregierte Hepatocyten wurden am Tag 4 durch wiederholtes vorsichtiges Pipettieren von den Schalen entfernt und in angereichertem Medium suspendiert. Das Gemisch an Organoiden und nicht aggregierten Hepatocyten wurde pelletiert und wurde vor der Inokulation in den Bioreaktor in einer Kollagenlösung resuspendiert. Die Inhalte von einer Schale von jedem Experiment wurden mittels Gravitation in eine Organoidfraktion und eine Fraktion mit dispergierten Zellen getrennt. Basierend auf dem Gesamtproteingehalt von jeder Fraktion bildeten 35% bzw. 45% der ursprünglich ausplattierten Zellen bei dem Experiment mit niedriger und hoher Inokulation Organoide.

Die Sauerstoffaufnahme, die Albuminsynthese und der Lidocainmetabolismus wurden verwendet, um die Funktion der BAL aus eingeschlossenen Organoiden zu bewerten. Am Ende der Züchtung zeigte die Fluoreszenzfärbung unter Verwendung von Fluoresceindiacetat und Ethidiumbromid (Nikolai et al. "Improved Microscopic Observation of Mammalian Cells an Microcarriers by Fluorescent Staining" Cytotechnology (1991) 5: 141-146) eine gute Lebensfähigkeit für Hepatocyten in Organoiden. Bei den meisten Organoiden wurde beobachtet, daß sie eine sphärische Morphologie beibehalten, ohne in Einzelzellen zu zerfallen.

Sauerstoffaufnahme

Ein Abfall des Partialdrucks von gelöstem Sauerstoff wurde zwischen dem Einlaß und dem Auslaß des Bioreaktors beim extrakapillaren Raum beobachtet, was einen Sauerstoffverbrauch der eingeschlossenen Organoide und Zellen anzeigt. Die Differenz beim Partialdruck, multipliziert mit der Löslichkeit von Sauerstoff in den Medien bei 37ºC (1,29 · 10&supmin;&sup9; Mol O&sub2;/ml/mm Hg) und mit der Fließrate des extrakapillaren Mediums ergab eine mittlere Sauerstoffverbrauchsrate von 24,5 uMol O&sub2;/h bzw. 40,0 uMol O&sub2;/h für die Bioreaktoren mit niedriger und hoher Zellkonzentradon. Beide Reaktoren ergaben ähnliche spezifische Sauerstoffaufnahmeraten (OUR) von 0,6 ± 0,3 pMol O&sub2;/Zelle/h nach der Division der Raten durch die Zahl der in jeden Bioreaktor inokulierten Zellen, bestimmt mittels der Analyse des Gesamtproteins.

Albuminsynthese

Albuminsyntheseprofile wurden für den extrakapillaren Raum und den Lumenausfluß für beide Studien erhalten. Ein Ausgleich von Material, das um den Hohlfaser-Bioreaktor entnommen wurde, wurde durchgeführt und es wurde eine kumulative Gesamtalbuminsyntheserate von 13,0 ug/h bzw. von 80,6 ug/h für die Bioreaktoren mit niedriger und hoher Inokulation erhalten. Durch Division dieser Werte durch die geschätzte Zahl von Hepatocyten in der BAL, bestimmt durch die Gesamtproteinanalyse, wurde eine mittlere spezifische Albuminsyntheserate von 0,54 ± 0,04 pg/Zelle/h erhalten.

Lidocainmetabolismus

Innerhalb der ersten Stunde nach der Beladung am ersten Tag wurde das extrakapillare Medium beider Bioreaktoren mit 12 ug/ml Lidocain beladen. Am dritten Tag wurde das extrakapillare Medium abgelassen und mit frischem Aggregatmedium aufgefüllt, das 12 ug/ml Lidocain enthielt. Lidocain und MEGX wurden für beide Reaktoren am Tag 1 und 3 der Kultur gemessen.
In dem Bioreaktorsystem wurde das zu der Kultur zugegebene Lidocain rasch an der Kulturanordnung (Biorektor, Schläuche, Oxygenator, Mediumvorratsgefäß) adsorbiert. Somit war die Lidocainklärung kein tauglicher Indikator für den Metabolismus. Statt dessen wurde das Erscheinen von MEGX als Indikator für die P-450-Funktion verwendet. Die spezifische Produktionsrate von MEGX war 0,11 ± 0,04 pg/Zelle/h (Tabelle 1).
Kürzlich wurde unter Verwendung eines Bioreaktors mit eingeschlossenen Einzelzellen von einer vergleichbaren spezifischen MEGX-Produktionsrate von 0,08 ± 0,04 pg/Zelle/h berichtet (Shatford et al. "Hepatocyte Function in a Hollow Fiber Bioreactor: A Potential Bioartificial Liver" J. Surg. Res. (1992) 53: 549-557).
Tabelle 1 fasst die metabolischen Aktivitäten der BAL, die eingeschlossene Organoide enthält, gegenüber der BAL mit Einzelzell-Hepatocyten zusammen. Es wurde beobachtet, daß die spezifische Albuminsyntheserate für die BAL mit eingeschlossenen Organoiden höher war im Vergleich mit der BAL mit eingeschlossenen Einzelzellen. Die P-450-Aktivität in der BAL mit eingeschlossenen Organoiden war auch höher, wenn auch in einem geringeren Ausmaß.
Die Resultate zeigen, daß erhöhte spezifische auf eine Zelle bezogene Leberfunktionen für Hepatocyten, die als Organoide gezüchtet werden, bei Kollageneinschluß erhalten bleiben. Wenn sie zwei Tage in Kollagengel eingeschlossenen werden, wurde beobachtet, daß Organoide insgesamt ihre Morphologie beibehalten. Die Bewertung der Ultrastruktur legt nahe, daß Organoide die Fähigkeit besitzen, die Anwesenheit von extrazellulären Matrixproteinen nachzuweisen, angezeigt durch die Anwesenheit von Mikrozotten auf der äußersten Oberfläche des Organoiden. Die Ergänzung der Einschlußmatrix mit Matrigel, wobei Laminin der Hauptbestandteil ist, führte zu einer verbesserten Beibehaltung der Albuminsynthese im Vergleich mit in Kollagen eingeschlossenen Organoiden. TABELLE 1 ZUSAMMENFASSUNG DES VERGLEICHS DER FUNKTION EINER BAL MIT EINGESCHLOSSENEN DISPERGIERTEN ZELLEN UND EINGESCHLOSSENEN ORGANOIDEN
* basierend auf kürzlich veröffentlichten Daten (Shatford et al. (1992), vorstehend)

Claims

1. Filtervorrichtung, umfassend:

(a) ein Gehäuse mit ersten Einlass und Auslassöffnungen, die einen dazwischenliegenden Flüssigkeitsströmungsraum zum Durchfließen von Blut, Serum oder Plasma durch das Gehäuse begrenzen;

(b) wobei der Flüssigkeitsströmungsraum auch eine Vielzahl von Hohlfasern mit porösen Wänden und einem teilweise verschlossenem Lumen umfasst;

(c) wobei die porösen Wände Poren umfassen, die kleiner sind als ein Hepatocyt;

(d) wobei die Lumen der Hohlfasern in Flüssigkeitsströmungsverbindung sind mit zweiten Einlass- und Auslassöffnungen in dem Gehäuse zum Durchfließen eines Mediums zum Unterstützen der Hepatocytenfunktion und -lebensfähigkeit; und

(e) wobei die Lumen der Hohlfasern teilweise mit einer wässrigen Matrix verschlossen sind, umfassend lebensfähige Hepatocyten, wobei die Hepatocyten ein Gemisch aus unaggregierten Zellen und vorgeformten aggregierten Zellmassen sind;

(f) so dass eine Verbindung zwischen dem Flüssigkeitsströmungsraum und dem Innenraum der Hohlfasern ausschließlich durch die porösen Faserwände stattfindet.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Hohlfasern einen Innendurchmesser von 100 bis 1000 um haben, bevorzugt 150 bis 400 um, und am meisten bevorzugt 200 bis 250 um.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Poren einen Durchtritt von Molekülen mit einem Molekulargewicht von bis zu 100 kDa erlauben.

4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Medium ein serumfreies Medium ist.

5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Matrix ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Kollagen, Alginat, Chitosan und Fibrin.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Zellmassen 30 bis 300 um, bevorzugt 35 bis 150 um, und am meisten bevorzugt 40 bis 70 um im Durchmesser sind.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei man die wässrige Matrix als eine Flüssigkeit in die Faser einführt und eine Gelierung in situ ermöglicht, wobei sich das Matrixgel in Gegenwart der lebensfähigen Hepatocyten zusammenzieht.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, wobei die Flüssigkeit Hepatocyten in einer Konzentration von 5-40 · 10&sup6;, bevorzugt 20-40 · 10&sup6;, und am meisten bevorzugt 30-35 · 10&sup6; Zeilen pro ml enthält.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, wobei eine Hälfte der Zellen, bevorzugt zwei Drittel, in Zellmassen vorliegen.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Lumen zu 25 bis 90%, bevorzugt 33 bis 75%, durch die Matrix verschlossen ist.

11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Hepatozyten Schweinehepatocyten sind.

12. Eine künstliche Leber, umfassend die Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11.