JPH0292270A - 細胞培養装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は細胞培養装置、特に付性依存性の高い細胞およ
び血液細胞の培養に好適な細胞培養装置に関する。また
、培養肝細胞を用いた人工肝臓装置に関する。

〔従来の技術〕

細胞を大量に培養する方法として、浮遊培養法および分
離膜表面での培養法が従来から行なわれている。しかし
、これら従来の培養法には夫々次のような問題があった
。

例えば繊維芽細胞、平滑筋細胞、脳細胞等の間質系細胞
や、肝細胞、肝細胞、神経細胞、内皮細胞、上皮細胞等
のような高機能細胞は、付着依存性が高いために浮遊培
養法では培養ができない。

このため、これら高機能細胞に対する浮遊培養法は、担
体と称されるビーズ表面に付着させた状態で適用されて
いる。しかし、この場合にも浮遊培養法で必要とされる
攪拌および曝気操作により、細胞の活性が低下する問題
がある。また、潅流液と細胞とが直接接触することにな
る。このため、潅流液を回収してその中に含まれる有用
な代謝産物を回収しようとすると、細胞を分離するため
に複雑な操作が必要になる問題がある。

一方、分離膜表面における培養法では主に中空糸が用い
られ、通常は中空繊維外側に細胞を充填し、内側に培養
液を流す方法が採用されている。

この場合、酸素要求性の細胞を培養するときには、別に
酸素付加を行なうための方法を併用しなければならない
。更に、指摘培養を行なうためには、温度コントロール
を含む厳密な培養条件制御が要求される問題がある。

分離膜表面での細胞培養の例として、中空糸型物質交換
装置の中空糸外面での細胞培養が報告され、実際にも行
なわれている（例えば、Ｋｎａｚｅｌ（ｋ、＾、、ｅｔ
　ａｌ　：　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ｏｎ　ａｒｔ
ｉｆｉｃｉａｌｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ：Ａｎ　ａｐｐ
ｒｏａｃｌ＋　ｔｏ　ｔｉｓｓｕｅ　ｇｒｏｗｔｈ　１
ｎｖｌｔｒｏ、　５ＣＩＥＮＣＩＥ、ｖｏｌ、１７８，
６５．１９７２）　、このような中空糸型項五装置では
、−枚の膜を挟んで細胞と潅流液とが接しているから、
この場合の膜の機能は溶質の移動にどどまる。従って、
細胞培養に必須であるガス濃度を調整するために、培養
器全体を炭酸ガス・インキュベータの中に設置する大が
かりな手段をとるか、或いは培養液に調整ガスを吹送し
、オキシスタット等によりきめこまかなガス供給を行な
うといった手間のかかる方法が行なわれている。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、その課題は
、付着依存性の高い高機能細胞や酸素要求性の細胞の培
養に適し、且つ容易に好適な培養条件を得ることが可能
な培養装置を提供することである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明による細胞培養装置は、第一媒質導入口および第
一媒質導出口ならびに第二媒質導入口および第二媒質導
出口を有するハウジングと、前記第一媒質導入口および
第一媒質導出口に連通して前記ハウジング内に設けられ
た第一媒質流路と、前記第二媒質導入口および第二媒質
導出口に連通して前記ハウジング内に設けられた第二媒
質流路と、前記第一媒質流路を限定する壁の少なくとも
一部を構成する第１の物質交換膜と、前記第二媒質流路
を限定する壁の少なくとも一部を構成する第２の物質交
換膜と、前記第１および第２の物質交換膜にはさまれた
位置に、前記第一媒質流路および第二媒質流路と隣接す
るように設けられた細胞培養室とを真価したことを特徴
とする。

本発明における第一媒質流路および第二媒質流路は、液
体流路またはガス流路の何れに用いてもよい。

本発明において、液体流路を限定する物質交換膜は、平
均孔径５人〜ｔｏｍの貫通孔を有する多孔性膜であるの
が好ましい。このような物質交換膜としては、再生セル
ロース、酢酸セルロースポリアクリロニトリル、ポリメ
チルメタクリレート、ポリスルホン、ポリエチレン、ポ
リプロピレン、ポリフッ化ビニリデン等からなる分離膜
を用いることができる。この分離膜は、溶質透過を効率
良く行なわせるために親水性であることが望ましい。

疎水性のポリオレフィン膜は、親水化されているのが望
ましい。

一方、ガス流路を限定する物質交換膜としては、ポリプ
ロピレン、シリコン、テフロン等からなるガス交換膜を
用いることができる。

本発明においては、培養室内の細胞密度を上げるだめに
、培養室内に連続気泡をもった多孔質スポンジシート、
メツシュを封入してもよい。また、コラーゲン・ゲルを
封入することも可能である。

本発明の細胞培養装置においては、複数の培養室を積層
した状態で構成することもできる。この場合、二つの培
養室の間には第一媒質流路または第二媒質流路が介在す
ることになる。

〔作用〕

本発明の細胞培養装置を使用する際には、培養室内に培
養すべき細胞を収容すると共に、第一および第二媒質流
路には細胞培養に必要な所定の各媒質を流して細胞培養
を行なう。例えば、液体流路には培養液を流し、ガス流
路には培養に必要なガス成分を混合した調整ガスを流す
。これにより、液体流路側では物質交換膜を介して新鮮
な培養液が培養細胞に供給され、且つ培養細胞からの老
廃物は迅速に除去される。他方、ガス流路側では物質交
換膜を介して必要なガス成分が供給されるため、培養室
には常に好適な培養条件が維持される。

従って、従来のように炭酸ガス・インキュベータやガス
付加装置を用いなくても、好適な細胞培養を行なうこと
が可能である。

なお、本発明の細胞培養装置を用い２て肝細胞を培養し
た場合、培養後の装置はそのまま人工肝臓装置として使
用することができる。その際、患者の血液は第一または
第二流路を通して体外循環させればよい。以下、この人
工肝臓装置のにおける作用を説明する。

上記の人工肝臓装置においては、肝細胞と共にコラーゲ
ンゲルを封入する。コラーゲンゲルの主な作用は次の通
りである。

■肝細胞の高密度培養を可能とする。この作用は、人工
肝臓装置のコンパクト化に寄与する。

■その内部に肝細胞を封入して安定化することにより、
肝細胞の長期に亙る活性維持を特徴とする特に、肝臓、
肺、心臓真皮由来の線維芽細胞、血管内皮細胞等の間充
繊細胞を肝細胞と共に封入したときに、より優れた活性
維持効果が得られる。

■その内部に肝細胞を封入することにより、物質交換膜
が破損したときにも、肝細胞の血液中への漏出を防止す
る。

一方、物質交換膜の主な作用は次の通りである。

■反応効率を低下させることなく、脆弱な高含水率のゲ
ルを機械的に補強する。

■脆弱な高含水率のゲルを、極細繊維状または極薄フィ
ルム状に成形することを可能にする。これによりゲルの
表面積／体積比を高め、反応効率を顕著に向上させる。

本発明の人工肝臓装置では多孔質膜内に肝細胞が封入充
填され、解毒処理すべき血液または血漿は多孔質膜を介
した拡散により前記肝細胞と接触し、代謝を受ける構造
になっている。このため、肝細胞と血液との接触を容易
に行なうことができ、且つ肝細胞が血液中に混入する危
険は完全に解消される。また、使用時における繁雑な操
作も解消される。

〔実施例〕

第１図は本発明の一実施例になる細胞培養装置を示す断
面図である。同図において、１は合成樹脂を成形して作
製したハウジングである。ハウジング１の内部には二枚
の物質交換膜２，３が溝方向に張設され、この物質交換
膜によってハウジング内部は三つのコンパートメントに
仕切られている。中央のコンパートメントは細胞培養室
４である。培ｉｔ室の下のコンパートメントは液体流路
５、培養室の上のコンパートメントはガス流路６である
。また、ハウジング１の側壁には各種の導入口および導
出口が設けられている。７．８は細胞充填口で、細１泡
培養室４に連通している。９は液体導入口、１０は液体
導出口で、液体流路５に連通している。１１はガス導入
口、１２はガス導出口で、ガス流路６に連通している。

上記培養装置の使用方法を第２図に示す。

まず、培養すべき細胞を培養室４に充填する。

その場合、細胞を所定の懸濁液とし、これをライン１３
を通して細胞充填ロアに供給するのがよい。

また、タンク１４に満した培養液を、ポンプ１５により
液体流路５を通して循環させる。その場合、熱交換器１
６を循環路に組入れ、培養液を所定の温度に調節するの
が望ましい。一方、ガス流路６には、ボンベ１７から所
定の組成に調整した混合ガス（例えば０２含有ガス）を
流す。これにより、培養装置の内部では第３図に示すよ
うな状態が得られる。図示のように、培養室には培養す
べき細胞が充填され、液体流路５には培養液、ガス流路
６には０２を含む調整ガスが流れる。そして、培養液か
らは細胞の培養に必要な栄養成分等の溶質が、物質交換
膜２を介して培養質内の細胞に供給される。また、ガス
流路を流れる調整ガスからは、培養に必要な０２が物質
交換膜３を介して細胞に供給される。その結果、培養室
４内には望ましい培養条件が維持され、好適な細胞培養
が行なわれる。

第４図は、本発明による細胞培養装置の他の実施例を示
す説明図である。この実施例では、複数の培養室４１〜
４６が積層されている。これら各培養室は、液体流路ま
たはガス流路を介して隔てられている。この実施例に示
されるように、本発明の細胞培養装置は、任意の数の培
養室を積層したかたちで実施することができる。

なお、上記実施例では第一媒質流路を培養液の流路とし
、第二媒質流路を調整ガスの流路としているが１．場合
によっては両者を培養液の流路に用いてもよく、また両
者を調整ガスの流路に使用してもよい。即ち、二種類の
培養液を潅流し、或いは二種類の２Ｊ！１ガスを供給す
ることも可能である。

以下、具体的な製造例および使用例を説明する。

製造例 ポリプロピレン、流動パラフィン及び添加剤からなる成
膜川原液をＴダイから押出し、流動パラフィン液中で冷
却して固化させた。これを溶剤で処理することにより流
動パラフィンを抽出し、更に熱固定した。これにより膜
久表面にスキン層をもたず、平均孔径０　、４５　ｐ　
、膜厚８０ｍの疎水性多孔質膜Ａを得た。

また、上記と同様にして平均孔径０．０５ＩＥＲ，膜厚
１３０　ｐａの疎水性多孔質膜Ｂを得た。

次に、上記の疎水性多孔質膜Ａを定型に打抜き、これを
容器壁に接触しない状態でプラズマ処理装置の反応容器
（内径３Ｑｒｔｔｒｘ）中に設置した。Ａｒガス０．１
Ｔｏｒｒの条件下に、１３．５６Ｍ１ｌｚの高周波発生
装置に連続した誘導コイルにＬＯＷの電力を印加してプ
ラズマを発生させ、ｌＯ病間このプラズマを疎水性多孔
質膜Ａに照射した。プラズマ照射後の膜ＡをＮ、Ｎ−ジ
メチルアクリルアミドガスを反応容器中に導入し、２０
℃、　１ＴＯｒｒで１０分間グラフト反応を行なった。

得られた膜を、メタノールを用いたソックスレー抽出装
置で５０時間洗浄し、減圧乾爆した。

こうして処理した膜は、内部まで親水化されていた。

上記で親水化された多孔質＋１１ｉ　Ａ　’及び前記の
疎水性多孔質１１％Ｂを、両者の間にポリプロピレン製
の導入口および導出口を挟んで溶着し、袋状の構造物を
作製した。これを第１図に示したようなハウジング成形
物内に固定し、第１図で説明した構造の細胞培養装置を
製造した。

細胞培養例 ５〜８週齢のスブラーグドーリー系ラット（雄）から、
Ｓｅｇｌｅｎ等の方法に準じて肝細胞を分離した。この
肝細胞４ＸＩＯ’個を、３日齢の同種ラット新生児（雄
）の肺からコラ−ゲナーゼ処理により分離して得た線維
芽細胞（継代数２〜８）２Ｘ　１０７個と併せた。この
細胞を、コラーゲン０．２％を加えた培養液５０ＩＩＩ
！中に浮遊させた。培養液としては、ダルベツコ改変イ
ーグル培養液（ＤＥＮ）にハイドロコーチシン０，４尾
／ｌ１ｌｉ、インスリン　５尾／１１１１トランスフェ
リン　５Ｉ！ｇ／ｍ。

トリョードチロニン　２×１０〜９Ｍ、コレラ毒素１０
−”　Ｍ　、アデニン１０−’Ｍ　、ＥＧＦ　ｌＯｎｇ
／ｌ／、牛胎児血清ｌＯ％を加えたものを４℃に冷却し
て用いた。

上記の細胞浮遊液を、第２図で説明した方法により培養
質４内に充填した。また、ＴＳ２図で説明したようにし
て、３７℃に加温した培養液と、０２４０％、ＣＯ２５
％、Ｎ２５５％の組成からなる調整ガスを流すことによ
り、クリーンベンチ内での細胞培養を行なった。

培養７日目における細胞の状態を観察したところ、肝細
胞はゲル内全体でネットワークを形成し、細胞間胆管様
構造を形成していた。

人工肝臓装置としての使用例 上記の細胞培養例で肝細胞の培養を行ない、培養室に肝
細胞が高密度で培養されている装置を人工肝臓装置とし
て使用し、次のようにして模擬患者血液の循環解毒実験
を行なった。

即ち、模擬患者血液を第２図の容器１４に満し、ポンプ
１５により模擬血液を液体流路５に送給し、循環させた
。その際、マグネティックスクーラー２３を用いること
により、容器１４内の模擬血液を攪拌しながら実験を行
なった。

使用した模擬血液、血液の循環条件は次の通りである。

〈模擬患者血液〉 ・ヘパリン加牛血　　　　　５００ｍ１（ヘパリン３単
位／献） ・ヘマトクリット値　　　　　３５％ ・塩化アンモニウム　　　　５００Ｉ４：／旧く循環条
件〉 ・模擬血液流量　　　　　　１００Ｍ／分・酸素吹送量
　　　　　　　　１５０ＪｌｉＦ／分上記の実験におい
て、模擬患者血液中における塩化アンモニウム濃度およ
び尿素濃度を経時的に測定したところ、下記第１表に示
す結果が得られた。

第 表 循環開始前　　　　５３０　　　　　１５循環後３０分
　　　　５００　　　　　１７００分　　　　４８０　
　　　　　１９１２０分　　　　４５０　　　　　　２
２１８０分　　　　４２０　　　　　　２５上記の結果
に示されるように、この人工肝臓では活発な細胞活性が
維持され、人工肝臓装置としての有効性を有していた。

〔発明の効果〕

以上詳述したように、本発明によれば細胞培養装置は付
着依存性の高い高機能細胞や酸素要求性の細胞の培養に
適し、且つ容易に好適な培養条件を得ることが可能な培
養装置を提供することができる。また、本発明の培養装
置で肝細胞を高密度に培養したものは、そのまま人工肝
臓装置として使用できる。その際、肝細胞の活性を長期
に亙って安定に且つ高く維持でき、連続的に長期間の血
液浄化を行なうことができる等、顕著な効果を奏するも
のである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例になる細胞培養装置の断面図
、第２図は第１図の実施例になる細胞培養装置の使用方
法を示す説明図であり、第３図はその際の培養状態を示
す説明図、第４図は本発明の他の実施例になる細胞培養
装置の説明図である。 １・・・ハウジング、２．３・・・物質交換膜、４・・
・培養室、５・・・液体流路、６・・・ガス流路、７．
８・・・細胞充填口、９・・・液体導入口、１０・・・
液体導出口、１１・・・ガス導入口、１２・・・ガス導
出口、１３・・・細胞充填ライン、１４・・・培養液タ
ンク、１５・・・ポンプ、１６・・・熱交換器、２０・
・・導管、１７・・・調整ガスボンベ。 出願人代理人　弁理士　鈴江武彦 第４図

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）第一媒質導入口および第一媒質導出口ならびに第
   二媒質導入口および第二媒質導出口を有するハウジング
   と、前記第一媒質導入口および第一媒質導出口に連通し
   て前記ハウジング内に設けられた第一媒質流路と、前記
   第二媒質導入口および第二媒質導出口に連通して前記ハ
   ウジング内に設けられた第二媒質流路と、前記第一媒質
   流路を限定する壁の少なくとも一部を構成する第１の物
   質交換膜と、前記第二媒質流路を限定する壁の少なくと
   も一部を構成する第２の物質交換膜と、前記第１および
   第２の物質交換膜にはさまれた位置に、前記第一媒質流
   路および第二媒質流路と隣接するように設けられた細胞
   培養室とを具備したことを特徴とする細胞培養装置。
2. （２）血液導入口および血液導出口ならびに酸素含有ガ
   ス導入口および酸素含有ガス導出口を有するハウジング
   と、前記血液導入口および血液導出口に連通して前記ハ
   ウジング内に設けられた血液流路と、前記酸素含有ガス
   導入口および酸素含有ガス導出口に連通して前記ハウジ
   ング内に設けられた酸素含有ガス流路と、前記血液流路
   を限定する壁の少なくとも一部を構成する物質交換膜と
   、前記酸素含有ガス流路を限定する壁の少なくとも一部
   を構成するガス交換膜と、夫々の交換膜にはさまれた位
   置に、前記血液流路および酸素含有ガス流路と隣接する
   ように設けられた肝細胞収容室と、コラーゲンゲルに封
   入された状態で前記収容室内に充填された肝細胞とを具
   備したことを特徴とする人工肝臓。