JPS63240774A - バイオリアクタ− - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、細胞を生育させる為のバイオリアクターに係
り、更に詳しくは大規模に細胞培養を行なう為のバイオ
リアクターに関するものである。

［従来の技術］ 微生物または細胞を培養する培養槽を用いる培養装置に
おいて、培養の容積効率を高めるための手段の一つとし
て、培地への通気ガス供給を増大させることが知られて
おり、この場合、一般に培地の激しい攪拌か行なわれる
。

一方、中空糸膜な用いて細胞を培養する、いわゆるホロ
ーファイバー法と呼ばれる培養方法か知られている。

［発明が解決しようとする問題点コ しかしながら、通気ガス供給を増大させる方法において
は、培地中への通気パブリンクによる泡立ちによって細
胞と気泡とか接触することや、攪拌による機械的なスト
レスか細胞に加わるために、細胞、特に動物細胞などの
脆弱な細胞か死・減損傷する慮れがあるなどの問題かあ
る。

一方、ホローファイバー法と呼ばれる培養方法にあって
は、第３図に示すようにボローファイバーバイオリアク
ターとガス交換器が分離して設けられ７″′るため・０
２及びＰＨ調整用ガスの供給が不十分で、大規模な細胞
培養には適していないという問題がある。この点を説明
すると、ホローファイバーバイオリアクターにおいては
、中空糸膜の外側にいる細胞に厳密に制御される培地を
送る必要があるが、バイオリアクター１４とガス交換器
１７か分離して設けられている場合、第３図に示すよう
に、バイオリアクター１４の前（又は後）において培地
のｐＨ，ＤｏをｐＨセンサー１３及びＤＯＯリング１９
て測定し、その信号に応じてカス交換器１７よりガスを
送り込むが、細胞が急激に増殖した場合、バイオリアク
ター１４に入り込む培地のｐＨ値、Ｄｏ値が異なること
になる。これは細胞により培地中のグルコース等が消費
されるためである。従って、バイオリアクター１４の前
においてｐ　Ｈ値、Ｄｏ値を測定したとしても、巾に目
安程度にしかならず、その値の信号によりガス交換を行
なってもあまり意味かないことになるのである。

さらに、従来のホローファイバー法の場合、０２の供給
が培地だけに行なわれているため、細胞が酸素不足にな
り死滅するという問題もあった。

［問題点を解決するための手段］ そこで、本発明は上記従来技術の欠点に鑑み、なされた
もので、０２ガスの供給が培地たけでなく細胞にも十分
になされる、大規模な細胞培養に適したバイオリアクタ
ーを提供することを目的とするものである。そして、そ
の目的は、本発明によれば、培地供給膜を介して培養液
を供給し、該培地供給膜上及び該培地供給膜の外部空間
で細胞を増殖するバイオリアクターにおいて、該バイオ
リアクター内に前記培地供給膜とともにガス交換用の膜
を配設したことを特徴とするバイオリアクター、により
達成することかできる。

［作用］ 本発明のバイオリアクターにおいては、バイオリアクタ
ー内に配設した培地供給膜の内側に培地を流し、該膜の
細孔を通じて培地供給膜の外側に培地をにじみ出させ、
培地供給膜の外側に植え込んである細胞を増殖させる。

その際、同じく、バイオリアクター内に前記培地供給膜
と共に配設したガス交換膜の内側を通って送られてくる
ガスが、ガス交換膜を介して培地供給膜よりにじみ出た
培地と接触するようになっており、０□が培地に供給さ
れるほか、培地供給膜の外側に植え込まれた細胞に６０
２を供給する。

［実施例］ 以下、本発明を図示例の実施例に基いて詳細に説明する
。

第１図は本発明のバイオリアクターの構造の一例を示し
た縦断面図である。筒状容器７の内部には培地供給膜８
およびガス交換膜９を構成する多数の中空糸膜が配設さ
れており、該筒状容器７の両端部において、該筒状容器
７の内面と前記培地供給膜８およびガス交換膜９の外面
か、ポリウレタン樹脂等のボッチインク材からなる支持
部材ｌＯにより気密に支持されるとともに、培地供給膜
８およびガス交換膜９の両端部は、該筒状容器７の両端
側に開口している。

培地供給膜８とガス交換膜９は、筒状容器７内において
、中心部にガス交換膜９、その外側に培地供給膜８が配
置され、各々気液が通過し得る多数の透孔１２を有する
隔壁１１によって分離されて設けられている。

また、ボート５は、使用済みの栄養培地と細胞産生物を
バイオリアクターから取り出すボートであり、ボート６
は、ガスの供給量及び濃度を制御するセンサーの導入口
である。尚、Ｏリング１９は、外部との気密性保持およ
びガスと培地とを混合させないために設けられている。

以上の構成において、培地Ａは培地人口２より培地供給
膜８の中空糸膜内に入り、膜にかかる圧力により、少量
培地供給膜８の外側ににしみ出し、残りの培地は培地出
口３より筒状容器７を出る。一方、空気などのガスＢは
、ガス入口１よりガス交換膜９の中空糸膜内に入り、ガ
ス交換膜９を介し隔壁１１の透孔１２を通して培地にガ
スを供給し、残余のガス及び交換したガスかガス出口４
より筒状容器７を出る。

本発明のバイオリアクターを構成している培地供給膜８
としては１種々の重合体よりなるものであればよく、そ
の重合体としては、例えばセルロースアセテート、ポリ
スルホン、ポリアクリロニトリル、弗素ポリマー、ポリ
オレフオンなどが挙げられる。

培地供給膜８の壁膜には、栄養分及び細胞の老廃物、代
謝生産物などは透過するが、細胞は透過しない大きさの
細孔が多数設けられている。細胞自体を浮遊させて培養
させる場合、細孔の大きさは、細胞の大きさにより決定
されることになるか、一般に、平均孔径が１０ｇｍ以下
、好ましくは８ルｍ以下が適当である。

又、培地供給膜８は、水をある程度透過する能力を有す
ることか望ましい。即ち、培地供給膜８は、水の透過係
数（ｒｌＩｎ　／ｍ２・ｂｒ−ｍｓｌｌｇ）が１０以上
、好ましくは１００以上であることが有利である。一方
、上限は特にないが、２０，０００以下、好ましくはｔ
ｏ、ｏｏｏ以下が望まれる。

さらに、培地供給膜８としては、栄養分や細胞の老廃物
などの分子量の小さい化合物は透過するか、分子量の大
きい化合物は透過しない膜、例えば限外濾過膜を使用す
ることも可能である。

本発明のバイオリアクターを構成しているガス交換Ｉｔ
！Ｓ！９としては、種々の重合体よりなるものであれば
よく、例えばセルロース、ポリアクリルニトリル、ポリ
カーボネート、ポリフッ化ビニリデン、ポリメチルメタ
クリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、シリコー
ンゴム等およびそれらの変成素材などが挙げられる。

又、ガス交換膜９は、ガス透過部を有することが必要で
ある。即ち、ガス交換膜９は、ガスの透過係数（ｔｏ９
．／ｌｓ２・ｈｒ−ｍ１１ｇ）が１０以上、好ましくは
１００以上であることか有利である。

さらに、ガス交換膜９としては、単位体積当りの膜面積
が小さくできる中空糸膜が好ましい。特に、高い透過源
を有する多孔質膜がよく、その中てもポリオレフィン系
多孔質膜が好ましい。

なお、第１図においては、説明の便宜のため同心状で、
その中心部にガス交換膜９、その外側に培地供給膜８を
設け、各々隔壁１１により分離された構成としたが、ガ
スを十分に培地に供給するためには、筒状容器７内にお
いてガス交換膜９および培地供給膜８が混在した構成の
ものがより好ましい。

また、細胞を増殖させるためには、細菌による汚染をな
くすことが絶対的に必要であり、ガス交換膜９としてポ
リプロピレン多孔質膜、培地供給膜８としてポリエーテ
ルサルホン限外濾過膜、筒状容器７としてポリカーボネ
ート製の容器、支持部材１０としてポリウレタン樹脂な
どを用いることにより、バイオリアクター全体が高温高
圧蒸気滅菌が可能である構成とすることがより好ましい
。

第２図は本発明のバイオリアクターを用いた細胞培養方
式を示したもので、ｐＨセンサー１３及びＤｏ（溶存酸
素）センサー１８を備えたバイオリアクター１４、培地
タンク１５、ｐＨセンサーおよび潅流物の流速を制御す
るポンプ１６から成る系を示している。一方、第３図は
従来のバイオリアクターとガス交換器を用いた細胞培養
方式を示したもので、第２図と相違するのはガス交換器
１７がバイオリアクター１４内に包含されておらず、外
部に設置されている点である。

そこで、以下、本発明を第２図および第３図に基いて行
なった実施結果について、より具体的に説明する。

（実施例） 培地供給膜として、内径３００ｇｍ、外径４００川ｍ、
分画分子量１０，０００のポリスルホン製限外濾過中空
糸膜２，５００本、ガス交換膜として、内径３００ｇｍ
、外径４００μｍ、平均孔径０．２ｇｍ、空隙率６５％
のポリプロピレン多孔質中空糸Ｗ２２，５００木からな
るバイオリアクターを使用した。（有効膜面積はどちら
とも０．５ｍ２である。） バイオリアクター１４およびＰＨセンサー１３、ＤＯ（
溶存酸素）センサー１８、ＣＯ２センサ−（図示せず）
および培地タンク１５、ポンプ１６をシリコーンチュー
ブにて接続し、閉鎖回路とした。回路内をプライミンク
し、全回路をそのまま、２５分間高圧蒸気滅菌を行なっ
た。

滅菌終了後回路を３７°Ｃの恒温槽内に設置し、基礎培
地として、無血清のイークル（Ｅａｇｌｅ’　ｓ）　Ｍ
ＥＭ−Ｅ（Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓ５ｅｎｔｉａｌ　Ｍｅ
ｄｉｕｍ−Ｅａｇｌｅ）培地（ペニシリンカリウム１０
万単位／し、硫酸カナマイシン１００ｍｇ／Ｌを含む）
を８０ｍＭ／ｍｉｎにて４８時間循環した後、ｌＯ％Ｆ
ＢＳ（Ｆｅｔａｌ　ＢｏｖｉｎｃＳｅｒｕｍ）　　（子
牛の血清）を含むＭＥＭ−Ｅ培地に交換した。

ヒーラ（ＩＩｅＬａ）細胞を中空糸膜外側の空間に５Ｘ
ＩＯ６セル（ｃｅｌｌ）／ｍ文を接種（イノキュレート
）した。接種後、４時間は培地を循環させずに、１時間
ごとにバイオリアクターを９０度づつ回転させて、中空
糸膜外側の空間に均一にヒーラ（ｌｌｃＬａ）細胞を分
散させた。その後、培地を４０　ｍ文／ｗｉｎ、４時間
循環した後、８０　ｍｕ／ｗｉｎに流量な上げた。同様
に細胞増殖用の培地のｐＨを７．４に保持するように空
気（１ｏ００ｃｃ／ｕ＋ｉｎ）　、炭酸ガス（５０ｃｃ
／ｍ１ｎ）をガス交換膜の内側に流入した。

２文の培地を３日おきに１５日間交換し、培地槽内のク
ルコース濃度、酸素分圧、炭酸ガス分圧を測定した。１
６６日目り、２日おきに培地交換を行ない、３１日後に
装置を停止した。

装置停止後、培地供給膜内をＰＩＩＳ（リン酸緩衝液”
）（−）、０．２５％トリプシンへと順次置換し、各１
５分３７°Ｃて培養した後、浮遊させて細胞を回収し、
細胞数を算定した。又、同様に培地供給膜内をＰＢＳ（
−）、２％ゲルタールアルデヒドへと順次置換し、２．
５％クルタールアルヒデドにて一昼夜固定した後、ＰＢ
Ｓ（−）にて水洗後、１％オスニウム酸にて染色し、以
後凍結乾燥を行ない、全草着後ＳＥＭ　（走査型電子顕
微鏡）ＯＡ察を行なった。

培地のグルコース濃度は初期値１００　ｍｇ／ｄｉに調
整した。培養開始後６日間（２回の培地交換）は顕著な
グルコース濃度の減少は認められなかつた。

９日目より徐々にクルコース濃度の減少を認め、１５５
日目は３　［３間でｌ　ＯＯｍｇ／ｄｉか６４０ｍｇ／
ｃＮ１に減少した。以後、１６６日目ら２日おきのΔ１
４定ては、１００　Ｂ／ｄ文から５０ｍｇ／ｄ文へとほ
ぼ一定の減少であった。

酸素分圧、炭酸ガス分圧は終始各々的１５０．２０　ｍ
ｍ１１ｇとほぼ一定値をとり、ｐＨの変動ζよ７．３６
から７．４６の間て安定していた。

３１日間培養の細胞数は３ｘｌＯ８セル（ｃｅｌｌｓ）
／　ｍｌてあった。

ＳＥＭによる観察では、中空糸膜上に付着した細胞は、
膜の内部に入り込んて成長するとともに、外側に向って
も成長していた。膜の内部に入り込んだ細胞には、さほ
ど立体的な成長は認められなかったか、膜の外部に向っ
て成長した細胞では、細胞同士か隣接しあい、生体内に
おいて形成している３次元構造に似た成長を示した。

（比較例） 実施例に用いた培地供給膜及びガス交換膜と同一のもの
を用いて、それぞれ有効膜面積か０．５ｍ２のバイオリ
アクターとガス交換器を使用した。

実施例と同様の操作て減菌、プライミンク、細胞培養を
行なった。

その結果、グルコース濃度は、実施例と同じように９日
目より徐々に低下したか、１５Ｆ１０からグルコース濃
度は、初期値のｌ　ＯＯｍｇ／ｄｉから変化しなかった
。

また、ｐＨの変動は５．８３から８．１４の間て激しく
変動し、酸素分圧も同様に激しく変動した。

１５５日目らグルコース濃度か変化しなかったのは、細
胞か死滅したためてあり、バイオリアクター内の酸素分
圧を測定すると、はとんど０を示していた。

これは、バイオリアクター内の培地中の溶存酸素が、細
胞増殖に伴って消費され、はとんど酸素がなくなり、細
胞が死・滅したものと推定される。

［発明の効果］ 以上詳細に説明したように、本発明のバイオリアクター
によれば、バイオリアクター内に培地供給膜とともにガ
ス交換膜を配設したので、０２ガス及びＰＨ調整用ガス
か培地及び細胞に十分に供給され、細胞の生育、増殖を
何ら支障なく行なうことかでき、大規模な細胞培養にも
十分対応できる。という利点を有する。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のバイオリアクターの構造の一例を示し
た縦断面図、第２図は本発明のバイオリアクターを用い
た細胞培養方式を示す概要図、第３図は従来のバイオリ
アクターとガス交換器を用いた細胞培養方式を示した概
要ＩＡである。 ７・・・筒状容器、８・・・培地供給膜、９・・・ガス
交換膜、ｌＯ・・・支持部材、１１・・・隔壁、１２・
・・透孔、１３・・・ｐＨセンサー、１４・・・バイオ
リアクター、１７・・・ガス交換器、１８・・・ＤＯセ
ンサー。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）培地供給膜を介して培養液を供給し、該培地供給
   膜上及び該培地供給膜の外部空間で細胞を増殖するバイ
   オリアクターにおいて、該バイオリアクター内に前記培
   地供給膜とともにガス交換用の膜を配設したことを特徴
   とするバイオリアクター。
2. （２）ガス交換用の膜が中空糸膜である特許請求の範囲
   第１項記載のバイオリアクター。
3. （３）ガス交換用の膜が多孔質膜である特許請求の範囲
   第１項記載のバイオリアクター。
4. （４）ガス交換用の膜がポリオレフォン系多孔質膜であ
   る特許請求の範囲第１項記載のバイオリアクター。
5. （５）高温高圧蒸気滅菌が可能な材質からなる特許請求
   の範囲第１項記載のバイオリアクター。