JPS62130683A - 哺乳動物細胞を培養する方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野： 本発明は、細胞を生物工学の範囲内で培養する方法およ
び装置に関する。殊に１本発明は。

哺乳動物細胞を試験管内で増殖させることに向けられて
いる。

従来の技術： 生物工学の範囲において、生物学的生成物。

例えばモノクロナール抗体、インターフェロン、接種物
質、プラスミノゲンアクチベーター等は細胞、殊に哺乳
動物細胞を用いて生産される。

この種の方法の経済性は、細胞ができるだけ著しく増殖
し、かつ細胞内で所望の物質のできるだげ高い濃度が達
成されることに本質的に依存する。この目的を達成する
ために、細胞を大工業的に培養する方法および装置につ
いて特殊な要件が課されている。すなわち、殊に十分に
栄養素を供給することおよびガス、殊に酸素を供給する
ことを配置しなければならない。細胞培養の場合に不必
要でありかつ細胞の成長を屡々阻害する老廃物、すなわ
ち細胞の代謝産物は。

除去しなければならない。また１例えば温度および一部
のような全ての残りの環境条件は、できるだけ最適でな
ければならない。

定期刊行物″トレンズ・イン・バイオテクノｏ　シー　
（Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　
）“、１９８３年、第１０２頁〜第１０８頁のグラツケ
ン（Ｍ、Ｗ、　Ｇｌａｃｋｅｎ　）他によるゝゝ哺乳動
物細胞の培養：工学的原理および規模の拡大（ＭａｎＴ
ｎ−ａｌｉａｎ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　：　ｅｎ
ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｐｒｉｎｃ−ｉｐｌｅｓ　ａｎｄ
　５ｃａｌｅｕｐ　）“　の項には、前記問題および細
胞を培養する相当する装置に対する多数の構造原理が示
されている。

この項の記載から認めることができるように懸濁細胞と
、担体に依存する細胞とは区別しなければならない。懸
濁細胞は、細胞培養媒体中で自由に浮遊しかつ成長する
ことができ、付着細胞とも呼ばれる担体に依存する細胞
は、生存しかつ成長することができるためには固体担体
を必要とする。

前記項には、上述した問題とともに特にゝゝ規模を拡大
すること“の問題が示されている。すなわち、実験室規
模で十分に機能する方法は大量生産には不適当であるこ
とが判明した。

伝統的には、哺乳動物細胞は、細菌細胞と全（同様に懸
濁培養よりも先に１発酵装置とも呼ばれる生物反応器中
で培養される。この種の容器の場合には、環境条件は正
確に制御することができる。撹拌装置は、培養媒体を反
応器の内部で運動させ、したがって細胞を均質に分布さ
せるのに役立つ。相当する培養技術は、付着細胞につい
ても、この細胞がゝゝミクロ担体“と呼ばれる小さい担
体小球上に存在することによつて可能である。この付着
細胞は、培養媒体中で浮遊する。

栄養素を細胞に供給することおよび老廃物を導出するこ
とは、懸濁培養の場合に生物反応器中で次の３つの方法
の中の１つにより行なわれる： パッチ運転の場合１反応器は非連続的に運転される。配
合を開始する場合、培養媒体は、常法で血清１例えば胎
児の牛血清（ＦＫＳ）ならびに必要な栄養素、例えばグ
ルコース、ビタミン。

アミノ酸および無機質を含有する。運転中、この栄養素
は消費され、したがって媒体はさらにますます栄養素が
不足する。同時に、老廃物の濃度は増大し、このことは
、最終的に細胞成長を阻害することをまねく。その結果
が細胞密度曲線の経過であり９例えばこの経過は第１ａ
図に図示されている。細胞密度は、１ｄあたり細胞的１
０　個の最大値に達し、その後に再び減少する。従って
、最大の細胞密度が達成されたならば、培養を中断する
。次に１反応器内容物は、後加工に供給される。この方
法は、細胞の環境が絶えず変化する限り、不満足なもの
であり、したがって発酵過程の大部分の時間の開法して
最適であるとは云えない。このことは、実際に培養媒体
を数回新しくすることにより改善することができるが、
この場合には細胞を取出すことはしない。しかし、その
ためには、培養媒体の部分量をそれがなお使用されてい
な〜・とじても繰り返し除去しなければならない。この
種の方法は、極めて費用がかかる。それというのも、公
知の培養媒体は、入手するのが困難であり、したがって
高価であるからである。

これに関連してより良好なのは、所謂ゝゞ供給パッチ法
”であり、この場合発酵過程の間に培養媒体はその全部
が新しくされるのではなく。

使用された栄養素分のみが連続的に供給される。

しかし、この方法は、実地において本質的な利点をもた
らさない。それというのも、老廃物が増大することは、
培養過程の間に純粋なバッチ法の場合と同様に細胞密度
の特徴のある経過な導くからである。

第３の方法は、所謂クモスタットまたはサイトスタラ）
　（Ｃｙｔｏｓｔａｔ　）中での連続的方法である。こ
の場合、環境条件は、均一に調節することができ、した
がって細胞は最適に成長することができる。、しかし、
この方法は、極めて費用がかかる。それというのも、連
続的に培養媒体は供給されかつ導出されるからである。

更に。

この場合にも前記方法の場合よりも高い細胞密度は本質
的に達成されない。それというのも。

流出する細胞培養媒体と一緒に絶えず細胞も反応器から
導出されるからである。

従って、３つの記載した運転法の何れを懸濁培養のため
に選択するのかとは無関係に結果は不満足なものである
。それというのも、殊に価値のある細胞培養媒体の使用
量は高すぎるからであり、かつ最大の細胞密度はより高
いのが望ましいからである。この最大の細胞密度はより
高いのが望ましいという判断基準は１％に重要である。

それというのも、当面の経験によれば細胞中での所望の
生成物の濃度は、細胞密度が増大するにつれて増大する
からである。従って細胞密度が増大することにより、生
成物の収量は過剰な割合で上昇することか生じる。

更に、改善を得るために、新規の方法が提案された。

所謂°“人造毛管を有する系”は、本質的に透析用中空
繊維の束からなり、この透析用中空繊は、中空円筒体の
内部に配置されている。この透析用中空繊維は、付着細
胞を培養する全ての場合に推奨される。この場合、中空
繊維の外面上に付着された細胞は、円筒形ケーシング内
で中空繊維間の中間空間内に存在する。培養媒体は、毛
管の内側を貫流し、空気は、ケーシングの外側を通って
細胞に供給される。この種の方法によれば、栄養素を細
胞に比較的均一に節約するように供給することが達せら
れる。また、細胞密度は、僅かに上昇させることができ
た。

しかし、栄養素が均一に供給されたとしても、細胞は種
々に良好に供給されることが判明する。

このことは、殊にこの細胞が多層中で毛管上に存在する
ことに帰する。それによって、酸素の供給も制限きれ、
このことは、老廃物の生産が高められることを導きうる
。

この種の中空繊維発酵装置は、欧州特許出願第１ｌ２１
５４号明細書および同第１ｌ２１５５号明細書に記載さ
れている。との欧州特許出願第１ｌ２１５５号明細書の
場合、系は、細胞がポンプによシ循環させて培養モジュ
ールによって圧送される限り変えられる。

また、その壁が膜材料からなる中空繊維は、特開昭６０
−２０７５８１号公報に記載された細胞培養法の場合に
も使用される。中空繊維は、発酵器の内部空間内で培養
媒体中に存在する。

中空繊維の内部は、液体の供給ならびに導出に使用され
る唯１つの導管を介して外側空間と結合されている。ポ
ンプを用いて、この導管を介して細胞の老廃物は、中空
繊維の壁体全通して吸引濾過されるか、ないしは時間的
にそれと別個の作業周期で細胞を損々わない滅菌された
水が供給される。この滅菌された水に場合によっては細
胞の念めの栄養素が添加されていてもよい。運転の場合
には、交互に培養液中にポンプで圧送され、この培養液
から吸引濾過される。

この作業周期は、連続的に繰り返される１、非連続的運
転法の欠点を阻止するためには、偶数の中空繊維束を使
用するのが有利であシ、この偶数の中空繊維束は、互い
違いに運転され、すなわち中空繊維束の半分を通して培
養媒体から吸引濾過し、中空繊維の他の半分を通して液
体を供給する。この方法は、比較的費用がががシ、かつ
中空繊維を片側からおよび他の側から絶えず互い違いに
圧力が負荷されることによって損なうという危険をまね
く。

他の新しい技術には、細胞を半透過性膜材料からなる球
状ミクロ体中に介在させることが設けられている。この
ことは、前記刊行物の項中に懸濁細胞を培養するための
唯１つの新しい方法として示されている。この方法は、
小さい球体中で細胞密度を上昇させることを導き、この
ことは、再び生成物の収量が上昇することをもたらす。

細胞を取得することは容易である。それというのも、小
球体は重力のために沈積し、個々の細胞は一般に遠心分
離しなければならないからである。この利点に対しては
、細胞をカプセル封入するために極めて高い費用が対峙
する。更に、酸素を細胞に供給することは制限されてお
り、このことは、また培養の成果を減少させる。

発明が解決しようとする問題点： 前記の背景に対して、本発明は、細胞密度を上昇させ、
その結果生成物の収量を上昇させることができる、細胞
を培養する、簡単で安価な方法および相当する装置を提
供することである。

問題点を解決するための手段： この課題は、培養媒体とは別個に栄養媒体を使用し、こ
の栄養媒体を半透過性膜を通る培養媒体とは別個の流路
内で循環させて流し、この場合この膜は、これが栄養素
および細胞の老廃物に対して透過性であるが、培養媒体
の高分子量成分に対しては不透過性であるように設計さ
れてお９Ｘ この膜の片側に接して培養媒体を細胞と一緒に通過させ
、膜の他の側に接して栄養素を含有する栄養媒体を通過
させ、 したがって栄養媒体からの栄養素を膜を通して培養媒体
中に到達させ、培養媒体からの老廃物を栄養媒体中に到
達させることを特徴とする、細胞を培養する方法、なら
びに半透過性膜が設けられており、この膜が第１の空間
３４と第２の空間３６とを互いに分離しており、 第１の空間３４が栄養媒体４４の貯蔵容器と、供給管４
８および返送管５ｏを介して結合さへ第２の空間３６が
反応器の内部空間と結合されておシ、 栄養媒体４４を栄養媒体の貯蔵容器からの供給管４８を
介して第１の空間３４に供給しかつ第１の空間３４から
返送管５０を介して貯蔵容器に返送するための装置およ
び培養媒体１２を第１の空間の反対側にある膜の側面に
接して通過させる装置が設けられていることを特徴とす
る、細胞を培養する装置によって解決される。

本発明は、その内部空間に細胞が存在する古典的生物反
応器から出発する。本発明は、特に懸濁細胞に好適であ
るが、殊に前記刊行物の項に記載されているように、こ
の細胞がマイクロ担体上に移住している場合には付着細
胞に使用することもできる。細胞は、反応器中で撹拌装
置を用いて十分に均質な懸濁液で保持される。

環境条件、すなわち殊に温度、酸素分圧および声部は、
生物反応器に対して知られた方法で制御され、かつ最適
な範囲内に一定に保たれる。

公知方法との本質的な相違は、本発明の場合に栄養素を
細胞に供給し、かつ老廃物を細胞から導出させることに
ある。このことは、２つの空間を互いに分離している半
透過性膜にょシ行なわれる。

膜の片側には、培養媒体が反応器の内部空間から供給さ
れる。この培養媒体は、細胞とともに殊に公知の培養媒
体中に常に含有されている蛋白質、殊に上述した胎児の
牛血清を含有する。培養媒体と栄養媒体とは別個にされ
ておシ、この栄養媒体は、細胞によって連続的に消費さ
れる比較的低分子量の栄養素を専ら含有する。

半透過性膜は分離壁であシ、この分離壁を通して多数の
分子は通過拡散することができ、他の分子は留められる
。本発明によれば膜の透過性は、この膜が細胞の比較的
低分子量の栄養素およびその老廃物に対して透過性であ
るが、培養媒体の高分子量成分に対して不透過性である
ように設計しなければならない。従って、この膜は、培
養媒体の高分子量の特に価値のある成分子ｔ膜内に保持
する。この成分は、培養過料の間に実際には消費されず
、したがってそれは供給する必要がない。これとは異な
シ、低分子量の栄養素は膜を通過することができ、した
がって膜の両側で近似的にこの物質の同じ濃度が支配す
る。同様のことは、細胞の老廃物にも当てはまシ、この
老廃物は、培養媒体から膜を通して栄養媒体中に到達す
る。

ところで、双方の媒体は、該媒体が膜のそれぞれの側で
連続的に側を流れ過ぎるように運動状態に保持されてい
る。それによって、−面で膜の栄養素媒体の側で絶えず
十分に高い栄養素濃度および十分に低い老廃物濃度が維
持される。

他面、培養媒体も全体で、到る処で細胞に対して十分に
最適な成長条件が支配するように十分に均質である＠詳
細には、栄養媒体中の栄養素の濃度、栄養媒体が透析膜
に接して通過する流速および透析膜の交換面積ならびに
培養媒体が膜に接して通過する流速は、定常の状態で培
養媒体中の栄養素の濃度が最適化されておシ、かつ培養
媒体中の老廃物の濃度が細胞の成長を本質的に損なわな
い程度に僅かであるように相互に定められていなければ
ならない。

意外なことに、こうして透析膜を用いて透析器中の透析
膜の直接の周囲だけでなく、生物反応器の全内部空間に
極めて良好に栄養素を供給することができ、かつ老廃物
をそれが成長を殆んど損なわない程度に僅かな濃度に保
つことができることが判明した。従って、全体的に次に
なお詳細に説明されているように細胞密度および生成物
収量は、古典的な懸濁培養音振かに凌駕していることが
判明した。それにも拘らず、この方法は、簡単で量産す
るのに極めて十分に好適である。

半透過性膜は、２つの相当する室を分離する平面として
構成させることができる。また、この半透過性膜は、管
状に形成させることができるかまたは板状透析器を使用
することができる。

特に有利には、膜中空繊維が使用される。この場合、有
利に栄養媒体は中空繊維の内部中に流入し、培養媒体は
、中空繊維の外側を洗う。

既に存在する生物反応器を変えるのに特に好適な本発明
の第１の実施態様には、膜を生物反応器の外側に配置す
ることが設けられている。

膜は、ケーシング内に存在し、このケーシング内で膜は
２つの空間を分離している。このユニットは、以下透析
器と呼ぶ。この場合、膜の栄養媒体側、有利に中空繊維
透析器の場合には中空繊維の内部は、栄養液用の貯蔵槽
と結合している。この栄養液は、ポンプにより循環させ
て透析器を通して貯蔵容器に戻される。第２の循環路中
で培養媒体は、生物反応器から取出さ粗目様に透析器を
通して、すなわち膜の培養媒体側に前ンプにより送られ
、再び生物反応器中に戻される。

これに比して本質的に有利なのは、膜を生物反応器中に
配置する変形である。膜中空繊維の場合には、このこと
は、両端部に相当する接続頭部を備えている中空繊維束
を生物反応器中に自由に配置するようにして実現させる
ことができる。この場合、培養媒体は、生物反応器中に
存在する撹拌装置によって半透過性膜に接して通過案内
される。この撹拌装置は、培養媒体の循環を媒体との高
い交換率で膜の範囲内で達成するような程度に調節する
のが有利である。

意外なことに、この簡単な方法の場合に栄養媒体と培養
媒体との十分に良好な交換が得られる。膜を生物反応器
の内部で開いて配置することによシ、細胞または媒体の
蛋白質成分による閉塞を生じ、う、る狭い通路は全く存
在しない。

！た、中空繊維透析器の代シに他の膜形成は、あまシ有
利でなくとも適当な方法で生物反応器の内部に配置させ
ることもできる。

本発明は、なかんずく次の利点を達成する゛−細胞密度
は、生物反応器中での古典的な懸濁培養法の場合のほぼ
１０，１ｌＩＦａ度の大きさである。この細胞密度は、
はぼ８日間で達成され、かつ漸近的に最大値に接近する
（第１ｃ図）、すなわち、最大値に達した後には、細胞
密度の減少を生じない。従って、細胞を取得する最適な
時点を確定するために、培養過程を絶えず監視すること
は不必要である。栄養素の濃度および毒性老廃物の濃度
は、殆んど不変であり、かつ極めて良好に最適化するこ
とができる。

−著しく僅かな培養媒体が使用される。従って、殊に血
清は高度に節約される。また、このことは、部分的に高
い細胞密度と関連する。それというのも、本発明方法の
場合、著しく大量の細胞および細胞生成物を製造するた
めには（、同じ培養媒体量で十分であるからである。

その上、上述したように、血清は、記載された潅注法と
は異な力、配合の間に新しくする必要もないし、補充す
る必要もない。専ら、本質的に安価な栄養素が使用され
る。

一部分的に同様にまさに高い細胞密度を達成する、上述
した新しい方法（人造毛管上での細胞培養、膜カプセル
中への封入）に比して、本発明は、なかんずく生物反応
器中で環境条件を極めて正確に検出することができ、か
っる 制御すンことができることによって卓越している。すな
わち、例えば声部および酸素分圧は、絶えず測定するこ
とができ、かつ相応して補正することができる。懸濁液
が生物反応器中で均質であることによシ、値は、到る処
で近似的に等しい。更に、本発明方法は、簡単であるこ
とが魅力的である。設備投資の費用は比較的僅かであり
、規模を拡大する方法は極めて良好であり、かつ例えば
カプセル封入の際に必要とされるような費用のかかる付
加的な処理過程は不必要である。

実施例： 次に、本発明および本発明により達成しつる利点を第２
図および第３図に示した実施例につき詳説する。７ 第２図に示した生物反応器１０は培養媒体１２で充填さ
れている。この培養媒体は、高分子蛋白質成分、殊に例
えば胎児の牛血清のような血清を含有する。培養媒体を
均質化するために撹拌装置１４が設けられている。この
撹拌装置は、本質的に電動機１６、反応器壁を貫通する
軸１８およびこの軸に固定された撹拌部材２゜からなる
。撹拌部材２０は、有利にプロペラ状に形成されている
（所謂プロペラ羽根車）。丸くされた制限線および外か
ら内向きに連続的に増大する撹拌羽根の迎角の勾配によ
って特徴づけられるこの種の形の撹拌部材は、培地の極
めて敏感な細胞を損なうことなしに培養媒体の本発明に
必要とされる均質化の程度を得るために特に好適である
ことが判明した。

生物反応器１０の内部空間は、導管２２および２４を介
して透析器２６と接続されている。

図面には、中空繊維透析器が図示されており、これは有
利に使用される。この中空繊維透析器は、透析の場合に
血液透析（所謂人工腎臓）に常用されているのと同様に
構成されている。図面において透析器の両端部にそれぞ
れ接続頭部３０が認められる。中空繊維２８は、接続頭
部間を走る。接続頭部は、中空繊維の開いた端部が透析
液用の接続管３２および３３と液圧接続するように形成
されている。すなわち、全部の中空繊維の内部空間およ
び接続管まｔの接続通路は、相互に接続された第１の空
間３４を形成し、この空間は、透析液空間と呼ぶことも
マきる。この透析液空間は、中空繊維の外側に形成され
た第２の空間３６とは全く別個のものフあり、この第２
の空間を培養媒体は貫流する。この第２の空間は、本質
的に透析器２６の有利にほぼ円筒形の壁体３８および中
空繊維２８の外面によって制限されている。この種の透
析器を例えば構成させることがｔきるような同様の記載
は、血液透析器に関する欧州特許出願第３９０５５号明
細書に認めることが１きる。

培養媒体は、ポンプ４０を用いて導管２２を介して透析
器の記載した第２の空間３６に供給され、透析膜の培養
媒体に相互配置された側面に沿って流れ、かつ導管２４
を介して生物反応器１０中に還流される。

栄養媒体槽４２中には、栄養媒体４４が存在する。この
栄養媒体は、適当な担持液と、細胞に栄養を与えるのに
必要とされる種々の低分子量成分とからなる。これには
、グルコース、ビタミン、アミノ酸および無機質が属す
る。栄養媒体は、ポンプ４６を用いて導管４８を介して
透析器２６の透析液空間３４に供給される。そこ〒栄養
媒体は中空繊維２８を貫流し、かつ導管５ｏを介して栄
養媒体槽４２中に還流される。

栄養媒体槽４２中の栄養媒体４４は、所望の栄養素濃度
が透析膜の栄養媒体側！維持されたままであるように屡
々十分に新しくされるかまたは補充される。このことは
、栄養媒体槽４２が培養過程の進行中に栄養素濃度の生
じる変化が損なわれ力いよう力程度の大きさ！あること
によって実現させることが〒きるか、または培養媒体を
培養過程の間に新しくすることによって実現させること
がフきる。また、栄養素を連続的に供給することは、栄
養媒体槽４２中での濃度を維持し、有利！ある。

また、図示した運転形式の代りに、中空繊維透析器は、
培養媒体が中空繊維の内側を貫流し、栄養媒体が中空繊
維の外側を洗うように、−面ｆ栄養媒体用の循環路、他
面ｆ培養媒体用の循環路の双方に接続させることもフき
る。しかし、この解決は、中空繊維が細胞によって閉塞
される危険があるの！あまり好ましいもの１はない。

また、中空繊維透析器の代りに他の公知の透析器型を使
用することがＴ！きる。いずれにせよ、栄養媒体用の透
析器の第１の空間および培養媒体用の透析器の第２の空
間（但し、これらの空間は、勿論互いに完全に別個にさ
れていなげればならず、したがって交換は、透析膜を介
してのみ可能である。）が必要な交換面績が保証されて
いるように形成されていることは、本質的なことである
。好ましくは、本発明方法のための交換面績は、培養媒
体ＩＡあたり０．０１ｍ〜０’、　３　ｍの間にあり、
特に好ましくは、培養媒体１４あたり０．０３　ｍ　−
０，２ｍ”の間にある。更に、流れの進行は、殊に培養
媒体が貫流される第２の空間３６中で、細胞が殆んど閉
塞を生じることが力くかつ培養媒体が空間をできるだけ
滑らかに貫流することができるような程度でなければな
ら々い。

透析膜は、この種の目的のために知られた多数の材料か
ら製造されていてもよい。知られているのは、殊にセル
ロースアセテート、アクリル共重合体およびポリスルホ
ン繊維である。本発明に特に有利なのは、銅アンモニア
レーヨンからなる繊維である。本質的なことは、低分子
量栄養累月の膜は透過性であるが、培養媒体の高分子量
蛋白質用の膜は不透過性であることである。実際には、
約１００００の分子量の場合に透過限界（分子の遮断）
を有する膜が好適であることが判明したが、使用する場
合に応じて分子量１０００ｏ○の透過限界を有する膜も
有利であることができる。

生物反応器は、細胞に対する環境条件を監視しかつ一定
に保つための装置を培養媒体１２中に備えている。殊に
、声部、酸素分圧および温度のためのセンサーが生物反
応器１０中に存在する。このセンサーは、第２図中にそ
の全体が５２で示されている。更に、環境条件を監視し
かつ一定に保つための装置には、ガス、殊に酸素を供給
するための導管５４ならびに声部を制御する酸および／
またはアルカリ液を供給するための導管５６が属する。

この装置は、一般に生物反応器中１の懸濁培養に知られ
ている。しかし、本発明は、特に公知の生物反応器の場
合と同様に温度、酸素分圧および声部を正確に制御する
ことを可能にするだけでなく、同時に栄養素および細胞
の老廃物の濃度を良好に制御し、かつ最適な細胞成長を
可能にする範囲内で十分に一定に保つことがフきること
によって特徴づけられる。

第３図は、本発明による装置の特に好ましい実施態様を
示し、この装置は、第２図に示した実施態様に比して半
透過性膜が生物反応器中に配置されていることによって
区別される。この第３図の場合、相当する部分は、それ
ぞれ第２図の場合と同じ番号で示されているが、付加的
に符号ａを付しである。

本発明のこの実施態様の場合には、膜中空繊維２８ａが
使用され、この膜中空繊維は、生物反応器１０ａ内で２
つの接続頭部３Ｏａ間１自由に固定され、かつ透析器２
６ａを形成するが、この透析器の中空繊維束は、ケーシ
ング壁によって包囲されていない。接続頭部３０ａは、
適当なホルダー６０ａにより生物反応器１０ａの壁体６
２ａに固定されている。この場合も第２図による実施態
様の場合と同様に、導管４８８、透析液空間３４ａ（但
し、この空間は、接続頭部３Ｏａ中での空隙および中空
繊維２８８の内部空間によって形成されている。）およ
び導管５０ａは、栄養媒体用の閉鎖された循環路を形成
する。生物反応器１０ａ中での栄養媒体４４ａと、培養
媒体１２ａとの交換は、中空繊維２８ａの透析膜として
作用する壁体を介してのみ可能〒ある。

この実施態様の場合、培養媒体は、閉鎖された循環路中
で透析器の培養媒体のために設けられた第２の空間に供
給されずに、生物反応器中で、培養媒体が透析器２６ａ
の周囲の範囲内で絶えず運動状態に置かれかつ透析膜に
接して通過するように循環される。すなわち、透析器の
第２の空間は、この場合には密閉された空間ｆはなく、
生物反応器１０ａの内部空間の仕切られてない部分を形
成する。意外なことに、この種の簡単な構造は、顕著な
結果を導（。−面↑、栄養素と老廃物との透析膜を介し
ての交換は、それらの濃度が生物反応器中で最適な範囲
内で十分に一定に保つことができるような程度に良好ｆ
ある。他面ｆ、第２図による実施態様で場合により培養
媒体のための導管を閉塞させるという観察すべき問題は
、この実施態様〒確実に回避される。

本発明による装置は、有利に次の方法で運転される： 培養媒体を細胞の出発媒体と一緒に生物反応器中に充填
し、この生物反応器を閉塞する。また、栄養素槽を栄養
媒体で充填し、かつ閉鎖する。その後に、？ンプおよび
撹拌装置ならびに環境条件を制御するための装置を運転
状態に置き、したがって培養過程を進行させる。培養過
程の間、装置は、専ら監視はれ、かつ栄養素濃度がさら
に上記方法ｆ維持されるように配慮されかげればならな
い。

運転の間、透析器の膜に接して、−面で栄養媒体、他面
で培養媒体は、制御された速度で通過する。双方の媒体
の低分子量成分は、透析膜を介して交換される。この場
合、−面で栄養素が栄養媒体から培養媒体中へ侵入し、
他面１細胞の老廃物が培養媒体から栄養媒体中へ侵入す
る速度は、周知のように膜の両側および膜表面上の相当
する物質の濃度に依存する。更に、両側上の物質濃度は
、溜め中、すなわち−面１生物反応器中、他面フ栄養媒
体貯蔵容器中１の出発濃度に依存し、ならびに媒体が膜
に接して通過する速度に依存する。この知られた関連性
により、培養の間に培養媒体中の栄養素濃度および老廃
物濃度が生物反応器中１最適な範囲内にあるように詳細
を調節することは、全ての当業者によれば可能である。

開始段階後、相応して同調させる際に定常的状態は、栄
養素濃度も老廃物濃度も本質的に不変であることにより
生じる。

前述したように、残りの環境条件も最適な範囲内〒一定
に保たれるので、細胞培地は、第１Ｃ図に示したように
、細胞密度が公知の培養法の場合よりも遥かに高い最大
値を得るまで成長する。この値は、本質的に一定のまま
である。

この値が得られた場合、生物反応器は開かれ、かつ細胞
培地は公知方法で取得することが１きる。

第１表には、本発明方法および相当する装置を用いて達
成することが１きる結果と、パッチ運転を透析器なしに
運転させた生物反応器−懸濁培養の場合の細胞培養の結
果とが比較されている。結果は、牛つの異なるノ・イブ
リドーマ細胞系統について記載されている。表からは、
細胞型に応じて係数６と、係数１２との間１最犬の細胞
密度に改善することが得られることが認められる。培地
中での最大の抗体濃度は、なお著しく強度に、すなわち
係数１２ないし３ｏよりも多い係数だけ改善される。

【図面の簡単な説明】

第１ａ図、第１ｂ図、第１Ｃ図は、はぼ同じ測定尺度で
生物反応器中で種々の懸濁細胞培地での細胞密度が時間
的に展開していることを示す線図であり、この場合実際
に第１ａ図は、簡単なパッチ運転による方法、第１ｂ図
は、培養媒体を連続的に供給する運転方法（ケモスタッ
ト）、かつ第１Ｃ図は、本発明方法に相当するもの室あ
り、第２図は、膜を有する透析器が生物反応器の外側に
存在するような本発明による装置を示す略図であり、第
３図は、膜が生物反応器中に存在するような本発明によ
る装置を示す略図である。 １０・・・反応器、１２・・・培養媒体、１６．１８・
・・撹拌装置、２０・・・プロペラ羽根車、２８・・・
中空繊維、３４・・・第１の空間、３６・・・第２の空
間、４４・・・栄養媒体、４８・・・供給管、５０・・
・返送管、５２．５４．５６．５７・・・一定の環境条
件に制１０・・・反応器　　１２・・・培養媒り２０・
・・プロ啄う羽根車　　２８・−ζ　　１６．１８・・
・撹拌装置 中空繊維　　３４・・・第１の空間 、２６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、細胞培地を反応器中で培養媒体の環境条件を制御し
   ながら撹拌装置により十分に均質な懸濁液に保持し、栄
   養素を細胞に供給し、かつ細胞の老廃物を導出させるこ
   とにより、細胞を培養する方法において、培養媒体とは
   別個に栄養媒体を使用し、この栄養媒体を半透過性膜を
   通る培養媒体とは別個の流路内で循環させて流し、この
   場合この膜は、これが栄養素および細胞の老廃物に対し
   て透過性であるが、培養媒体の高分子量成分に対しては
   不透過性であるように設計されており、 この膜の片側に接して培養媒体を細胞と一 緒に通過させ、膜の他の側に接して栄養素を含有する栄
   養媒体を通過させ、 したがつて栄養媒体からの栄養素を膜を通 して培養媒体中に到達させ、培養媒体からの老廃物を栄
   養媒体中に到達させることを特徴とする、細胞を培養す
   る方法。 ２、膜を反応器内に配置させ、培養媒体をこの培養媒体
   を反応器空間中で循環させることによつて膜に接して通
   過させる、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、膜は中空繊維の形で構成されており、この中空繊維
   の内部空間を通して栄養媒体をポンプで圧送する、特許
   請求の範囲第１項または第２項に記載の方法。 ４、反応器（１０）を有し、この反応器が一定の環境条
   件を制御するための装置（５２、５４、５６、５７）お
   よび反応器の内部空間内に存在する培養媒体（１２）の
   ための撹拌装置（１６、１８）を有する、細胞を培養す
   る装置において、 半透過性膜が設けられており、この膜が第 １の空間（３４）と第２の空間（３６）とを互いに分離
   しており、 第１の空間（３４）が栄養媒体（４４）の 貯蔵容器と、供給管（４８）および返送管（５０）を介
   して結合され、第２の空間（３６）が反応器の内部空間
   と結合されており、 栄養媒体（４４）を栄養媒体の貯蔵容器か ら供給管（４８）を介して第１の空間（３４）に供給し
   かつ第１の空間（３４）から返送管（５０）を介して貯
   蔵容器に返送するための装置および培養媒体（１２）を
   第１の空間の反対側にある膜の側面に接して通過させる
   装置が設けられていることを特徴とする、細胞を培養す
   る装置。 ５、膜が中空繊維（２８）の形で構成されている、特許
   請求の範囲第４項記載の装置。 ６、膜が反応器（１０）中に配置されており、この場合
   第１の空間は反応器（１０）の内部空間の一部である、
   特許請求の範囲第４項または第５項に記載の装置。 ７、透析器の交換面積が培養媒体１ｌあたり少なくとも
   ０．０１ｍ＾３、最高で０．３ｍ＾３であり、好ましく
   は培養媒体１ｌあたり少なくとも０．０３ｍ＾３、最高
   で０．２ｍ＾３である、特許請求の範囲第４項から第６
   項までのいずれか１項に記載の装置。 ６、撹拌装置が少なくとも１つのプロペラ羽根車（２０
   ）を包含する、特許請求の範囲第４項から第７項までの
   いずれか１項に記載の装置。