ES2295465T3 - Procedimiento para el cultivo de celulas, en especial de celulas humanas o de animales. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para el cultivo de células de distintos tipos, en especial de células humanas o de animales, de modo que se disponga, como mínimo, un cultivo de cada tipo determinado de células con unas condiciones del entorno definidas, y de modo que a las células del cultivo correspondiente se les suministren los respectivos medios alimenticios líquidos, factores de crecimiento, gases y similares asignados, de forma que el procedimiento comprende la combinación de las siguientes etapas del procedimiento: a) Colocación, como mínimo, de un cultivo de células dentro, como mínimo, de una cámara de cultivo de células (20) de un sistema de cultivo de células (30); b) Puesta en marcha de un flujo de medios líquidos definidos, que se pueden seleccionar libremente hacia adentro, como mínimo, de una cámara de cultivo de células (20) para el suministro continuo, como mínimo, de un cultivo de células; c) Puesta en marcha de un flujo de distintos gases con concentraciones que se pueden seleccionar libremente hacia adentro, como mínimo, de una cámara de cultivo de células (20) para el aporte constante y continuo de gas, como mínimo, a un cultivo de células; d) Calefacción regulada y controlada, como mínimo, de una cámara de cultivo de células (20) de modo que se garantice en este caso una temperatura constante durante el transcurso de un experimento; f) Medición permanente de todos los parámetros relevantes del cultivo de células por medio de los sensores correspondientes, integrados, como mínimo, en una cámara de cultivo de células (20), caracterizado por la observación microscópica permanente de las cámaras de cultivo de células (20), sin que se tomen muestras mientras transcurra un experimento del cultivo de células, de forma que una cámara con un microscopio integrado se desplace sobre una mesa móvil hacia las cámaras de cultivo de células (20) y se pueda programar la posición de desplazamiento por medio de un software.
Description
Procedimiento para el cultivo de células, en
especial de células humanas o de animales.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para el cultivo de células de distintos tipos, en
especial de células humanas o de animales, de modo que se disponga,
como mínimo, un cultivo de cada tipo determinado de células con
unas condiciones del entorno definidas, y de modo que a las células
del cultivo correspondiente se les suministren los respectivos
medios alimenticios, factores de crecimiento, gases o similares.
Los cultivos del tipo mencionado con
anterioridad se iniciarán por norma general a partir de células
individuales, que o bien proceden de partes de tejidos, de cultivos
primarios, de líneas celulares o bien de clones celulares,
obtenidas por medio de separación enzimática, mecánica o
química.
En los procedimientos de cultivo de células
descritos hasta la fecha se emplearon por norma general para la
realización de los cultivos, recipientes de cultivo hechos de
plástico, que se incuban en incubadoras de CO_{2}. Con ellos se
garantiza una temperatura constante (por ejemplo, 37ºC) y una acción
amortiguadora del medio gracias a un suministro de un gas con una
concentración del 5% al 10% de CO_{2}. El suministro de oxígeno
se realiza por medio de una simple difusión. En los procedimientos y
dispositivos habituales para el cultivo de células no es posible
por norma general la realización de cocultivos ni obtener
condiciones de incubación que se puedan variar libremente.
Para la observación microscópica, o para
realizar experimentos especiales, se deben sacar los recipientes de
cultivo de la incubadora respectiva, con lo que se interrumpe el
proceso de incubación, se enfrían las células, y con ello no se
mantienen constantes las condiciones del experimento.
Los procedimientos de cultivo de células
descritos hasta la fecha ya no se corresponden, por consiguiente,
con las exigencias de la tecnología moderna de cultivo de
células.
En especial, en relación a los puntos centrales
de la investigación dentro de la industria farmacéutica, que están
dentro de los campos de: la inflamación (reuma), la lucha contra el
cáncer, las enfermedades del corazón y circulatorias, el SIDA, la
apoptosis (muerte celular programada) y la coagulación sanguínea, no
es posible renunciar al desarrollo y al ensayo de los nuevos
principios activos y medicamentos con ayuda de un sistema de
cultivo de células que permita realizar las pruebas de sustancias y
efectos en condiciones muy similares a en vivo, es decir,
con una representación casi perfecta de sistemas biológicos
complejos, antes de proceder a los ensayos en fases clínicas
(pruebas sobre pacientes).
Teniendo en cuenta la situación expuesta con
anterioridad existe la necesidad de disponer de una posibilidad de
simulación de procesos reactivos dentro de uno o varios sistemas
orgánicos (por ejemplo, comprobación por medio de una conexión en
serie de cámaras de cultivo de células con hepatocitos y otros tipos
de células de los productos de desecho y los metabolitos), para
que, por un lado, se pueda reducir de forma notable el plazo
transcurrido entre la comprobación de la actividad de la sustancia y
su autorización farmacológica; y por otro lado, se puedan adquirir
los conocimientos necesarios sobre el mecanismo de actividad de la
sustancia dentro de un sistema biológico complejo antes de proceder
a la fase de prueba clínica.
En el sector de la industria cosmética se
presenta, por ejemplo, una situación similar.
Según el estado de la técnica se dispone, por
ejemplo, de: sistemas de cultivo de células multivalentes (ver, por
ejemplo, DE 199 15 178 A1); sistemas de cultivo de células adaptadas
a problemas para desempeñar unas funciones específicas (ver, por
ejemplo, WO 98/17822); un procedimiento para la replicación de
cultivos de células (ver, por ejemplo, WO 97/37001) o un
procedimiento automatizado de cultivo de células (US 5 424 209).
Además, también se describe, por ejemplo, en la
patente WO 99/23206 un procedimiento para la mezcla de un cultivo
celular infectado con varicela en botellas giratorias.
Como conclusión, también se describe en la
patente EP 0 999 266 A1 un procedimiento y un dispositivo para
acoger un cultivo de células, a través de los cuales se deben
conseguir unas condiciones lo más homogéneas posibles para los
experimentos de biología molecular o de tecnología genética llevados
a cabo sobre células.
Teniendo en cuenta la situación expuesta con
anterioridad en el campo de la tecnología moderna de cultivo de
células, la intención fundamental de la presente invención es crear
un procedimiento nuevo y mejorado para el cultivo de células de
distinto tipo, en especial células humanas o de animales, que pueda
suprimir las desventajas de los procedimientos que se conocían
hasta la fecha y que en particular ofrezca la posibilidad de
simular procesos biológicos de elevada complejidad en tiempo real y
con condiciones casi en vivo (es decir, como en un organismo
viviente), de modo que en último lugar ha de ser posible llevar a
cabo el desarrollo del proceso controlándolo por ordenador.
Partiendo de un procedimiento para el cultivo de
células de distintos tipos, en especial de células humanas o de
animales, de modo que se disponga, como mínimo, un cultivo de cada
tipo determinado de células con unas condiciones del entorno
definidas, y que a las células del cultivo correspondiente se les
suministren los respectivos medios alimenticios, factores de
crecimiento, gases o similares, los objetivos descritos con
anterioridad se cumplirán según lo definido en la invención por
medio de la combinación de los siguientes pasos del
procedimiento:
a) Colocación, como mínimo, de un cultivo de
células dentro, como mínimo, de una cámara de cultivo de células de
un sistema de cultivo de células;
b) Puesta en marcha de un caudal de medios
líquidos definidos que se pueden seleccionar libremente, como
mínimo, en una cámara de cultivo de células para el suministro
continuo, como mínimo, de un cultivo de células;
c) Puesta en marcha de un flujo de distintos
gases con concentraciones que se pueden seleccionar libremente,
como mínimo, en una cámara de cultivo de células para el aporte
constante y continuo de gas, como mínimo, a un cultivo de
células;
d) Calefacción regulada y controlada, como
mínimo, de una cámara de cultivo de células de modo que se garantice
en este caso una temperatura constante durante el transcurso de un
experimento;
e) Observación microscópica permanente, como
mínimo, de un cultivo de células dentro, como mínimo, de una cámara
de cultivo de células, sin que se tomen muestras mientras transcurra
un experimento del cultivo de células; y
f) Medición permanente de todos los parámetros
relevantes del cultivo de células por medio de los sensores
correspondientes, integrados, como mínimo, en un cultivo de
células.
En el procedimiento referido en la invención se
sembrará, de forma preferente dentro de un número predefinido de
cámaras de cultivo de células, la cifra correspondiente de cultivos
de células al mismo tiempo, y se llevarán a cabo a continuación las
medidas adicionales del procedimiento del modo que se ha descrito
con anterioridad.
En este caso se pueden disponer las cámaras de
cultivo de células bien en serie o en paralelo.
Por medio del procedimiento referido en la
invención para el cultivo de células se garantiza en especial que a
las células de todos los cultivos se les suministren de forma
continua medios alimenticios, factores de crecimiento, gases o
similares, sin que se tengan que extraer las células de un cultivo
de su entorno habitual y definido, mientras que al mismo tiempo se
pueden observar todos los cultivos de células, sin que sea necesario
interrumpir el suministro de gas, de forma permanente con ayuda de
un microscopio.
Según una configuración adicional del
procedimiento referido en la invención se pueden variar durante el
transcurso de un experimento el tipo de los medios líquidos y/o sus
direcciones de flujo y/o su distribución y/o sus caudales de flujo,
a la vez que también se puede variar el tipo de los gases y/o sus
direcciones de flujo y/o su distribución y/o su concentración de
gases, lo que conlleva en última instancia que el procedimiento
referido en la invención se pueda configurar de un modo
extraordinariamente flexible.
En especial en el caso de cámaras de cultivo de
células dispuestas en serie dentro de un sistema de cultivo de
células, se pueden llevar los medios líquidos desde una cámara de
cultivo de células a otra cámara de cultivo de células de forma
continua.
Del modo correspondiente también se pueden
llevar de forma continua los gases desde una cámara de cultivo de
células a otra cámara de cultivo de células.
Para poder garantizar en el procedimiento
referido en la invención para el cultivo de células una temperatura
constante durante el transcurso de un experimento en las cámaras de
cultivo de células individuales, se medirán de forma permanente las
temperaturas existentes en los cultivos de células individuales y se
transmitirán como entrada de valor real de temperatura al
correspondiente ciclo de control o regulación de la temperatura, de
modo que se pueda controlar o regular la calefacción del cultivo de
células respectivo del modo que corresponda.
Tal como se explica con más detalle a
continuación, cada cultivo de células individual está dotado para
este fin de una calefacción propia, mientras que en la parte
superior de cada una de las cámaras de cultivo de células
correspondientes se encuentra situado un sensor de temperatura
infrarrojo que mide la temperatura existente en el cultivo de
células correspondiente y transmite este valor medido de la
temperatura a un sistema de control y de vigilancia. En caso de que
varíe la temperatura indicada en un principio, como mínimo, en una
de las cámaras de cultivo de células, entonces el ciclo de control o
regulación de la temperatura actuará para aumentar o reducir la
potencia de la calefacción de la cámara de cultivo de células
respectiva. La medición de la temperatura se puede realizar también
con ayuda de otro tipo de sensores de temperatura.
Tal como se explicará de modo similar a
continuación, las temperaturas en las cámaras de cultivo de células
individuales se pueden regular y modificar libremente durante el
transcurso global del experimento por medio del sistema de control
y de vigilancia por motivos de flexibilidad.
Una configuración adicional y especialmente
ventajosa del procedimiento consiste en que en el interior, como
mínimo, de una de las cámaras de cultivo de células se puedan
establecer, a cada uno de los lados de una membrana permeable a los
gases que se ha colocado en la cámara, un cultivo de células de
distinto tipo, con el fin de obtener un cocultivo directo de ambos
cultivos de células.
Un cocultivo de este tipo se lleva a cabo de
forma preferente gracias a que a un lado de la membrana, es decir,
a las células que crecen en el lado apical de la membrana del primer
cultivo de células, se les suministra un primer caudal de medio,
mientras que por el contrario al otro lado de la membrana, es decir
a las células que crecen en el lado basolateral de la membrana del
segundo cultivo de células, se les suministra un segundo caudal de
medio que es distinto del primer caudal de medio. De este modo, las
células de la parte apical funcionan como capa superficial,
mientras que las células de la parte basolateral funcionan como
células internas. Las células del primer cultivo de células y las
células del segundo cultivo de células muestran en este caso un
contacto entre sí muy intenso, gracias a la membrana, de forma que
se presenta la posibilidad de investigar los procesos de
intercambio dentro de las capas del lado apical y del lado
basolateral.
Además de ello también existe la posibilidad de
que en el caso de que se usen membranas permeables a los gases con
tamaños de poro distintos y seleccionables con total libertad, se
pueda investigar el posible intercambio de moléculas con actividad
biológica (por ejemplo, factores de crecimiento, hormonas, etc.) en
el transcurso de un cocultivo de este tipo. Estas posibilidades de
investigación son especialmente importantes en el caso de secciones
de tejidos que están constituidas por distintos tipos de células,
por ejemplo, la transición entre células del endotelio y
fibroblastos (arterias) o células de las membranas mucosas y
fibroblastos (intestinos, estómago).
Además se dispone de otra configuración de la
invención especialmente ventajosa en la aplicación del procedimiento
referido en la invención para el cocultivo indirecto, de forma que
se pueden disponer distintos sistemas biológicos (es decir, tipos
de tejidos y de células) en las cámaras de cultivo de células
correspondientes uno detrás del otro. De este modo se pueden
simular sistemas orgánicos prácticamente completos e investigar los
correspondientes procesos de intercambio de sustancias. Estas
medidas se pueden explicar con más detalle por medio de un ejemplo:
Una sustancia que no es tóxica por sí misma se absorbe en el tracto
digestivo y llega al hígado a través del torrente sanguíneo. Las
células del hígado descomponen la sustancia en productos de desecho
que en ciertos casos pueden tener efectos tóxicos. Para poder
comprobar este extremo se introduce la sustancia "sospechosa"
en una cámara de incubación en la que se han sembrado hepatocitos
(células del hígado). Por medio de un suministro de medio
alimenticio definido (caudal de medio = "arteria") se llevan
los productos de descomposición potencialmente tóxicos a una cámara
de cultivo de células que se encuentra a continuación, de forma que
en ella se pueda determinar, por ejemplo, a partir de células
nerviosas que estén muriendo, la presencia de una sustancia
neurotóxica.
Según una configuración adicional y
extremadamente ventajosa del procedimiento referido en la invención
se ha dispuesto una observación microscópica con un sistema de
vídeo incorporado, como mínimo, de uno de los cultivos de células,
como mínimo, en una de las cámaras de cultivo de células, como del
mismo modo se explica con más detalle a continuación.
El procedimiento referido en la invención se
puede configurar además de forma adicional de modo que todos los
datos que se adquieran por medio de:
- observación permanente por medio de un
microscopio, como mínimo, de un cultivo de células, como mínimo, en
una cámara de cultivo de células y/o
- medición permanente de los parámetros
relevantes de los cultivos de células y/o
- medición permanente de la temperatura
existente, como mínimo, en uno de los cultivos de células dentro,
como mínimo, de una de las cámaras de cultivo de células;
se transfieran a un sistema de control y
vigilancia controlado por un ordenador para su procesado
posterior.
En este caso la medición permanente de los
parámetros relevantes del cultivo de células se llevará a cabo en
especial con ayuda de un procedimiento de medición controlado por un
ordenador.
Se puede llevar a cabo una medición continua de
los parámetros de un cultivo de células de forma preferente por
medio de sondas o sensores, por ejemplo, para el valor del pH,
lactato, potencial eléctrico y otros similares, de forma que estas
medidas se puedan evaluar y representar por medio del software
correspondiente. Este tipo de medidas proporciona con respecto a
los métodos anteriores unos resultados más exactos, a través de los
cuales se pueden analizar unas cuestiones determinadas que no era
posible llevar a cabo con los procedimientos de medida que se
empleaban hasta la fecha. Con ayuda de un procedimiento de medida de
este tipo controlado por un ordenador se pueden sustituir en gran
medida, por ejemplo, ciertas pruebas sobre animales en la fase
preclínica.
La invención se explicará a continuación con más
detalle con ayuda de ejemplos de realización, ilustrándose en
la:
Figura 1, representación esquemática de un
sistema de cultivo de células completo y cerrado que se emplea para
llevar a cabo el procedimiento referido en la invención para el
cultivo de células, en el que se ha utilizado un número
predeterminado de cámaras de cultivo de células; y
Figura 2, representación esquemática de una
disposición de cámaras de cultivo de células una detrás de la otra
del sistema de cultivo de células representado en la Figura 1.
La Figura 1 muestra un sistema cerrado de
cultivo de células (30), en el que, por ejemplo, se han dispuesto
seis cámaras de cultivo de células (20) como grupo A sobre la
correspondiente base (21) asignada a ellas. La base (21) constituye
en especial un sistema de calefacción E para la incubación, que
durante el periodo de operación del sistema de cultivo de células
(30) garantiza una temperatura constante dentro de cada una de las
cámaras de cultivo de células (20) de la agrupación de cámaras de
cultivo de células A.
De modo preferente, con ayuda de este sistema de
calefacción E se llevará a cabo un calentamiento eléctrico de la
cámara de cultivo de células (20) respectiva, con lo que se consigue
un control de la temperatura muy exacto. Este sistema de
calefacción E estará dispuesto en especial de tal forma que cada
cámara de cultivo de células (20) individual del agrupamiento de
cámaras de cultivo de células A disponga de una calefacción propia,
que está integrada en la base (21).
El sistema de calefacción E se puede controlar,
de forma ventajosa, por medio de un software asignado al mismo. Con
este fin se ha instalado en la parte superior de la agrupación de
cámaras de cultivo de células A un sistema compuesto de sensores de
temperatura por infrarrojos (25), de tal modo que cada una de las
cámaras de cultivo de células (20) tenga asignado su
correspondiente sensor de temperatura por infrarrojos (25). El
sensor de temperatura por infrarrojos (25) respectivo detecta con
ayuda de una radiación infrarroja (25'), que sale de cada una de
las cámaras de cultivo de células (20) correspondiente, la
temperatura que tiene cada cultivo de células y transmite de forma
permanente el resultado correspondiente de la medida a un sistema de
control y de vigilancia G, controlado por un ordenador, que en lo
fundamental se compone de un equipo de procesado de datos (37) y de
su monitor (36) correspondiente. Los sensores de temperatura por
infrarrojos (25) individuales están conectados por medio de un
cable de unión (45) común al sistema de control y de vigilancia G.
Cuando se modifican las temperaturas predeterminadas en un primer
momento para las cámaras de cultivo de células (20) de la
agrupación de cámaras de cultivo de células A, el sistema de control
y de vigilancia G asume de forma automática el control o la
regulación del sistema de calefacción E, es decir, la temperatura
que tiene cada una de las cámaras de cultivo de células (20) se
ajusta de forma permanente para tener una temperatura
constante.
En vez de por medio de sensores infrarrojos de
temperatura (25), se puede realizar también la medición de
temperatura en las cámaras de cultivo de células (20) respectivas
con ayuda de otros sensores de temperatura.
Además de ello, con ayuda del software
disponible en el sistema de control y vigilancia G es posible
configurar de forma libre y seleccionar las temperaturas de las
cámaras de cultivo de células individuales (20) de la agrupación de
cámaras de cultivo de células A durante el transcurso global del
experimento, en caso de que ello fuera necesario por motivos
determinados.
Con el fin de poder observar de forma permanente
con un microscopio con vídeo integrado el interior de la cámara de
cultivo de células (20) respectiva, se ha dispuesto un sistema de
vídeo B con el correspondiente sistema de microscopio incorporado.
Este sistema de vídeo se explica con más detalle a continuación.
Por debajo de cada una de las correspondientes
cámaras de cultivo de células individuales (20) de la agrupación de
cámaras de cultivo de células A, que en el ejemplo de ejecución
presentado comprenden en total seis cámaras de cultivo de células,
se ha dispuesto una cámara de vídeo (22) con un microscopio
incorporado (22') y colocado en una mesa móvil (23) que se puede
ajustar de forma mecánica, con lo que en total se dispone de seis
cámaras de vídeo (22) con su correspondiente microscopio (22'). Con
ello cada una de las cámaras de vídeo (22) con microscopio (22') se
emplea para la observación de una cámara de cultivo de células (20).
Tras el comienzo del experimento y una vez que hayan aparecido
zonas que ofrezcan datos en el correspondiente cultivo de células
contenido en las cámaras de cultivo de células (20), se establece un
sector de observación en la cámara de cultivo de células (20). Este
sector de observación se alcanzará entonces por medio de la mesa
móvil (23) que se puede ajustar mecánicamente por medio de los
tornillos de ajuste (no representados), deteniéndose en este
momento la mesa móvil (23) con lo que a continuación quedará el
sistema de vídeo B durante la totalidad del transcurso del
experimento en la misma posición. Además se ajustará al inicio del
experimento la definición de la escala del microscopio respectivo
(22'). Este proceso de ajuste en el microscopio (22') respectivo se
realiza para la totalidad de las seis cámaras de cultivo de células
(20) y permanece desde ese momento fijo hasta la conclusión del
experimento.
De forma preferente el sistema de vídeo B
también se controlará por medio del software incluido en el sistema
de vigilancia y de control G. En este caso se controlará cada una de
las cámaras de vídeo (22) provistas de microscopio (22'). Esto se
lleva a cabo especialmente de modo que a intervalos de tiempo que se
pueden configurar con total libertad (por ejemplo, a intervalos de
un minuto) se tomen imágenes del cultivo de células respectivo
dentro de las cámaras de cultivo de células (20), de modo que en el
momento respectivo en el que se toma la imagen, una fuente de luz
(24) dispuesta sobre la cámara de cultivo de células (20)
correspondiente se ilumina, de forma que se garantiza una
iluminación suficiente en el interior de la cámara de cultivo de
células (20) para las capturas de vídeo. Cuando se haya finalizado
la captura de vídeo, el control pasará la fuente de luz (24)
correspondiente a un estado de espera en el cual queda con una luz
tenue, hasta que se vaya a realizar la siguiente captura de vídeo.
El rayo de luz o esfera de luz que sale de cada una de las fuentes
de luz (24), que entra a través de la placa de cristal (no
representada) correspondiente en el interior de una cámara de
cultivo de células (20), se representa en la figura 1 con la
denominación (24').
Todas las fuentes de luz (24) están conectadas
por medio de un cable de unión (46) común al sistema de control y
de vigilancia G.
Por medio de cada uno de los rayos de luz o
esferas de luz (24) se ilumina toda la superficie del cultivo de
células correspondiente que está dentro de la cámara de cultivo de
células (20).
El sistema de vídeo B también está del mismo
modo conectado por medio de un cable (47) al sistema de control y
de vigilancia G, de modo que de él parte el cable (47) hasta un
punto de unión (48) al que están también conectadas las cámaras de
vídeo (22) por medio de los correspondientes cables asignados a
ellas.
El sistema de vídeo B tal como se ha explicado
con anterioridad, con el sistema de microscopio, representa sólo
una posibilidad de ejecución. Otra forma de ejecución posible de un
sistema de este tipo para la observación permanente del interior de
las cámaras de cultivo de células se compone de un sistema de
observación único, compuesto de una cámara de vídeo y un
microscopio, que están instalados sobre una mesa móvil y de forma
que esta mesa móvil se desplaza a cada una de las seis cámaras de
cultivo de células (20) de la agrupación de cámaras de cultivo de
células A a intervalos que se pueden configurar con total libertad.
El ajuste del sistema de observación se lleva a cabo para los
cultivos de células individuales al inicio de los experimentos; es
decir, de forma preferente en el momento en el que haya zonas que
ofrezcan datos significativos en el cultivo de células
correspondiente; por medio del respectivo software incluido en el
sistema de vigilancia y de control G, es decir, por medio del
correspondiente programa informático se programan las seis
posiciones de desplazamiento de la mesa móvil, sobre la que está
motado el sistema de observación. Debido a las tolerancias mecánicas
de la mesa móvil se debe sin embargo capturar un sector mayor del
que se deba observar dentro de cada cámara de cultivo de células
(20) individual. Dentro de este sector mayor se definirá a
continuación por medio del software el sector que se pretende
observar. El software tiene la capacidad de guardar los contornos y
de volver a reconocerlos, es decir, al volver a desplazarse a una
de las cámaras de cultivo de células se reconocerán el contorno y
la disposición de las células y se guardará una zona de observación
que se habrá definido en un principio.
Este sistema de observación explicado en último
lugar no se ha representado de forma individual en las figuras, sin
embargo la iluminación de las cámaras de cultivo de células (20) se
realiza del mismo modo con ayuda de las fuentes de luz (24), como
ya se ha explicado en detalle con anterioridad.
El sistema de cultivo de células (30)
representado en la Figura 1 muestra además un sistema de
dosificación C para líquidos (por ejemplo, medios de alimentación
líquidos y similares) que, por ejemplo, puede disponer de cuatro
recipientes de reserva de líquido (31) con su respectiva toma de
salida de líquido (31') asignada, de forma que después las cuatro
tomas de salida de líquido (31') confluyen en una conducción común
(32). Esta conducción común (32) está por otro lado unida a un
sistema de bombeo (29), a través del cual se suministran los
líquidos que se pueden seleccionar con total libertad, contenidos en
los recipientes de reserva de líquidos (31), a las distintas
cámaras de cultivo de células (20) del agrupamiento de cámaras de
cultivo de células A.
El sistema de bombeo (29) está conectado por su
parte a través de una conducción (33) a un módulo múltiple de
válvulas (30'). El suministro de los líquidos al agrupamiento de
cámaras de cultivo de células A se lleva a cabo desde el módulo
múltiple de válvulas (30') a través de sistemas de tubos estériles
(27) y (28), de modo que estos líquidos se puedan transferir de
forma flexible de las cámaras de cultivo de células (20)
individuales, es decir, de una cámara de cultivo de células a la
siguiente. Tanto el suministro del líquido como la transferencia
del mismo se llevan a cabo a través de sistemas de tubos estériles
que se instalan con elementos de unión de tubos y distribuidores
convencionales al inicio del experimento, es decir, se unen con los
canales correspondientes de suministro de la respectiva cámara de
cultivo de células (20). En este caso se coordinará la conexión de
los elementos de unión de tubos convencionales (no representados de
forma individual en las ilustraciones) con los canales de
suministro asignados de la correspondiente cámara de cultivo de
células, para que se pueda seguir garantizando la esterilidad.
Por motivos de flexibilidad se pueden modificar
o controlar durante el experimento: el tipo de líquidos y/o las
direcciones de flujo y/o la distribución de los líquidos y/o sus
caudales, de forma que un control de este tipo se realice de modo
preferente por medio del sistema de control y vigilancia G
controlado por ordenador. Con este fin se ha conectado el sistema
de bombeo (29) por medio de un cable de unión (38) y el módulo
múltiple de válvulas (30') por medio de un cable de unión (40) al
sistema de control y vigilancia G.
El sistema de dosificación C del sistema de
cultivo de células (30) permite de este modo suministrar a la
agrupación de cámaras de cultivo de células A líquidos de todo
tipo.
El sistema de cultivo de células (30) dispone
además de ello de un sistema de suministro de gases D para todo
tipo de gases. Este sistema de suministro de gases D se emplea para
poder suministrar gas a las distintas cámaras de cultivo de células
(20) de la agrupación de cámaras de cultivo de células A, por
ejemplo, aire, O_{2}, N_{2}, CO_{2}. A partir de los sistemas
de suministro de gases D se lleva a cabo la distribución de gas a
la agrupación de cámaras de cultivo de células A por medio de un
tubo estéril (26). También en este caso se pueden transferir de
forma flexible los gases de las distintas cámaras de cultivo de
células (20) empleando los canales de suministro asignados
correspondientes, es decir, de una cámara de cultivo de células a
la siguiente.
El suministro de gas y transferencia del mismo
se realizan en total por medio de tubos estériles, que se instalan
por medio de elementos de unión de tubos y distribuidores
convencionales al inicio de los experimentos. Las uniones de los
elementos de unión de tubos con los canales de suministro asignados
correspondientes de la respectiva cámara de cultivo de células (20)
están coordinadas entre sí de tal modo que se garantiza la
esterilidad. También en los sistemas de suministro de gas D se
pueden modificar o controlar durante el experimento por motivos de
flexibilidad el tipo de gases y/o las direcciones de flujo y/o la
distribución de los gases y/o la concentración de los mismos en el
flujo. Con este fin se ha conectado a su vez el sistema de
suministro de gas a través de un cable de unión (39) con el sistema
de control y vigilancia G controlado por ordenador, que incluye el
software correspondiente para el control del sistema de suministro
de gas D.
Finalmente dentro del sistema de cultivo de
células (30) también se incluye un sistema de vigilancia F, que
está dotado de módulos de sensor (34) predeterminados. Con ayuda de
este sistema de vigilancia F se pueden medir durante la totalidad
de la duración del experimento los parámetros relevantes en la
correspondiente cámara de cultivo de células (20) de la agrupación
de cámaras de cultivo de células A por medio de los correspondientes
sensores asignados, en especial de forma permanente, de modo que
entre estos parámetros se incluyen, por ejemplo, el valor del pH,
la glucosa, el lactato, el oxígeno, el potencial eléctrico, etc. Con
este fin está conectado el sistema de vigilancia F por medio de un
cable (41), a través de un punto de unión (42), y desde ahí por
medio de otros cables (43) y (44) y los cables secundarios
correspondientes asignados con las cámaras de cultivo de células
individuales (20) de la agrupación de cámaras de cultivo de células
A del sistema de cultivo de células (30).
Los parámetros medidos por los sensores (no
representados) se transmiten por parte del sistema de vigilancia F
a través de un cable (35) al sistema de control y vigilancia G
controlado por ordenador para su procesado posterior
correspondiente.
Cada cámara de cultivo de células (20) está
dotada de los correspondientes canales para la conexión de sensores
tal como se explica en detalle a continuación, de modo que los
sensores y los canales respectivos asociados a ellos, están
coordinados entre sí de tal modo que se garantiza la
esterilidad.
De forma especialmente preferente el sistema de
supervisión F en combinación con el sistema de control y vigilancia
G están dispuestos de tal modo, que la medida permanente de los
parámetros relevantes del cultivo de células se puede realizar con
ayuda de un procedimiento de medida controlado por ordenador (como
ya se ha explicado con anterioridad).
En la Figura 2 se puede ver la agrupación de
cámaras de cultivo de células A del sistema de cultivo de células,
según la Figura 1, desde una vista superior esquemática. En esta
agrupación de cámaras de cultivo de células A se encuentran en
total seis cámaras de cultivo de células (20) dispuestas
prácticamente en serie de tal modo que tanto los medios líquidos
como los gases de una cámara de cultivo de células (20) pueden
transferirse de forma continua a la siguiente, es decir, a la
cámara de cultivo de células (20) dispuesta en la posición
siguiente respectivamente.
En cada una de las seis cámaras de cultivo de
células (20) se sembrará, como mínimo, uno de los cultivos de
células que se van a investigar, a pesar de que sin embargo en el
presente ejemplo de ejecución se habla, por motivos de simplicidad,
de seis cultivos de células, a cuyas respectivas células se les
suministran medios alimenticios líquidos definidos, factores de
crecimiento, gases y otras sustancias similares.
Con este fin se pondrá en marcha, por un lado,
un flujo de medios líquidos definidos y seleccionables con total
libertad y, por otro lado, una corriente de distintos gases con
concentraciones que se pueden seleccionar libremente en las seis
cámaras de cultivo de células (20) de la agrupación de cámaras de
cultivo de células A, de forma que, como ya se ha explicado con más
detalle con anterioridad, el aporte de líquidos a la agrupación de
cámaras de cultivo de células A se realiza de forma primaria desde
el módulo múltiple de válvulas (30') según la Figura 1, a través de
un sistema de conducciones por tubos estériles (27) y (28), mientras
que al mismo tiempo el aporte de gases al agrupamiento de cámaras
de cultivo de células A también se realiza por medio de la
conducción estéril de tubo (26) tal como se representa en la Figura
1.
Para la simplificación de la vista global se han
identificado las seis cámaras de cultivo de células (20)
consecutivas conectadas en serie con los números I, II, III, IV, V y
VI.
El sistema de conducciones de tubos flexibles
(27) y (28) para líquidos y la conducción flexible (26) para gases
se encuentran conectados directamente con la primera cámara de
cultivo de células I, de forma que la conducción flexible (26)
desemboca de forma directa en un canal de gas (50) en el interior de
esta primera cámara de cultivo de células, mientras que por su
parte el sistema de conducciones flexibles (27) y el sistema de
conducciones flexibles (28) desembocan en sus canales para líquidos
correspondientes (51) y (52), cada uno en el interior de esta
primera cámara de cultivo de células. Con ello se suministrarán en
primer lugar medios líquidos y gases al cultivo de células incluido
en la primera cámara de cultivo de células I, mientras que las
cámaras de cultivo de células sucesivas de la II a la VI quedarán
alimentadas de forma correspondiente con medios líquidos y gases.
Con más detalle, la cámara de cultivo de células I está conectada
por medio de las conducciones flexibles para líquidos (27A) y (28A)
y por medio de una conducción flexible para gases (26A) con la
segunda cámara de cultivo de células II, mientras que ésta por su
parte está conectada por medio de las conducciones flexibles para
líquidos (27B) y (28B) y por medio de una conducción flexible para
gases (26B) con la tercera cámara de cultivo de células III, que a
su vez está conectada de nuevo por medio de las conducciones
flexibles para líquidos (27C) y (28C) y por medio de una conducción
flexible para gases (26C) con la cuarta cámara de cultivo de
células IV, mientras que a su vez ésta está conectada por medio de
las conducciones flexibles para líquidos (27D) y (28D) así como por
medio de una conducción flexible para gases (26D) con la quinta
cámara de cultivo de células V, y finalmente esta última está
conectada por medio de las conducciones flexibles para líquidos
(27E) y (28E) y por medio de una conducción flexible para gases
(26E) con la sexta cámara de cultivo de células VI.
Debido a esta conexión consecutiva de unas a
continuación de las otras de las seis cámaras de cultivo de células
(20), cada una de las conducciones flexibles para líquidos (28A) ó
(28B) ó (28C) ó (28D) ó (28E) desemboca de forma correspondiente en
un canal para líquidos (52) en el interior de cada cámara de cultivo
de células, cada una de las conducciones flexibles para líquidos
(27A) ó (27B) ó (27C) ó (27D) ó (27E) desemboca de forma
correspondiente en un canal para líquidos (51) en el interior de
cada cámara de cultivo de células, mientras que cada una de las
conducciones flexibles para gases (26A) ó (26B) ó (26C) ó (26D) ó
(26E) desemboca de forma correspondiente en un canal para gases
(50) de cada cámara de cultivo de células.
De la sexta cámara de cultivo de células VI
salen conducciones de desagüe de líquidos (27F) y (28F) así como
una conducción de gases de escape (26F).
Como consecuencia de ello se consigue que a
todos los cultivos de células en las seis cámaras de cultivo de
células desde la I hasta la VI se les suministre de forma continua
tanto medios líquidos, definidos y seleccionables libremente, así
como un aporte de gases continuo y constante por medio del sistema
de suministro de gases D, según la Figura 1, como ya se ha
explicado con detalle con anterioridad.
Se advierte del hecho de que en la Figura 2 se
ha representado únicamente una de las muchas posibilidades de
dirección de flujo de líquidos y gases de las que se dispone.
A través de los sistemas de conducciones de
tubos flexibles explicadas con anterioridad para líquidos y para
gases se pueden poner en marcha también otras combinaciones de
cámaras de cultivo de células distintas a las representadas en la
Figura 2.
Se concede una importancia especial, además, al
hecho de que el agrupamiento de cámaras de cultivo de células A
está conectado en su totalidad de forma permanente al sistema de
supervisión F según la Figura 1, de forma que durante el transcurso
global del experimento se puedan medir todos los parámetros
relevantes de la cámara de cultivo de células (20) correspondiente
por medio de los sensores asignados respectivos. Cada una de las
seis cámaras de cultivo de células (20) está equipada por ello en su
interior con su canal (53) correspondiente para la conexión de los
sensores. Con más detalle, la primera cámara de cultivo de células I
estará conectada en este caso por medio de un cable (44A), la
segunda cámara de cultivo de células II por medio de un cable (44B)
y la tercera cámara de cultivo de células III por medio de un cable
(44C) con un cable (44), mientras que la cuarta cámara de cultivo
de células IV estará conectada por medio de un cable (43A), la
quinta cámara de cultivo de células V por medio de un cable (43B) y
la sexta cámara de cultivo de células VI por medio de un cable
(43C) con un cable (43). Los cables (43) y (44) llevan a un punto de
unión (42) que está conectado por medio de un cable (41) con el
sistema de supervisión F según la
Figura 1.
Figura 1.
Con ayuda de los sensores dispuestos en el
interior de cada una de las cámaras de cultivo de células (20), que
no se han representado en este caso de forma individual, es posible
medir de forma permanente los parámetros relevantes, de forma que
se irán transfiriendo mientras tanto los valores medidos
correspondientes por medio del sistema de supervisión F al sistema
de control y vigilancia G controlado por ordenador según la Figura
1, para que allí se realice el procesado posterior respectivo.
En la Figura 2 se puede además comprobar que
cada una de las cámaras de cultivo de células (20) de la agrupación
de cámaras de cultivo de células A dispone en su cara superior de
una ventana circular (20A) dotada de una placa de cristal, a través
de la cual se puede llevar a cabo una iluminación de toda la
superficie del cultivo de células contenido en la respectiva cámara
de cultivo de células (20), como ya se ha explicado en detalle con
anterioridad tomando como referencia la Figura 1.
La cámara de cultivo de células por sí misma
constituye por lo demás el objeto de una solicitud de patente
alemana, realizada por la misma solicitante con la denominación
"Cámara de cultivo de células para un sistema de cultivo de
células" (número de expediente oficial .........).
Con ayuda del procedimiento referido en la
invención para el cultivo de células se ha creado en especial la
posibilidad de simular procesos biológicos de alta complejidad en
tiempo real y en condiciones prácticamente iguales a las de en
vivo.
De una forma especialmente ventajosa se puede
aplicar el procedimiento referido en la invención sobre todo para:
la investigación de funciones celulares, el análisis de la
efectividad de medicamentos, el desarrollo de principios activos
farmacológicos, el cocultivo de distintos tipos de células y partes
de tejidos, el estudio típico de los órganos, la observación de
células tumorales en su entorno típico o los estudios
toxicológicos.
Claims (15)
1. Procedimiento para el cultivo de células de
distintos tipos, en especial de células humanas o de animales, de
modo que se disponga, como mínimo, un cultivo de cada tipo
determinado de células con unas condiciones del entorno definidas,
y de modo que a las células del cultivo correspondiente se les
suministren los respectivos medios alimenticios líquidos, factores
de crecimiento, gases y similares asignados, de forma que el
procedimiento comprende la combinación de las siguientes etapas del
procedimiento:
a) Colocación, como mínimo, de un cultivo de
células dentro, como mínimo, de una cámara de cultivo de células
(20) de un sistema de cultivo de células (30);
b) Puesta en marcha de un flujo de medios
líquidos definidos, que se pueden seleccionar libremente hacia
adentro, como mínimo, de una cámara de cultivo de células (20) para
el suministro continuo, como mínimo, de un cultivo de células;
c) Puesta en marcha de un flujo de distintos
gases con concentraciones que se pueden seleccionar libremente
hacia adentro, como mínimo, de una cámara de cultivo de células (20)
para el aporte constante y continuo de gas, como mínimo, a un
cultivo de células;
d) Calefacción regulada y controlada, como
mínimo, de una cámara de cultivo de células (20) de modo que se
garantice en este caso una temperatura constante durante el
transcurso de un experimento;
f) Medición permanente de todos los parámetros
relevantes del cultivo de células por medio de los sensores
correspondientes, integrados, como mínimo, en una cámara de cultivo
de células (20),
caracterizado por la observación
microscópica permanente de las cámaras de cultivo de células (20),
sin que se tomen muestras mientras transcurra un experimento del
cultivo de células, de forma que una cámara con un microscopio
integrado se desplace sobre una mesa móvil hacia las cámaras de
cultivo de células (20) y se pueda programar la posición de
desplazamiento por medio de un software.
2. Procedimiento, según la reivindicación 1,
caracterizado porque por medio del software se pueden grabar
contornos, de forma que al desplazar la cámara se puedan volver a
reconocer estos contornos.
3. Procedimiento, según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque se dispone un número predeterminado de
cultivos de células dentro de las correspondientes cámaras de
cultivo de células (20) asignadas, de forma que estas cámaras de
cultivo de células se conectarán en serie entre sí.
4. Procedimiento, según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque se dispone un número predeterminado de
cultivos de células dentro de las correspondientes cámaras de
cultivo de células (20) asignadas, de forma que estas cámaras de
cultivo de células se conectarán en paralelo entre sí.
5. Procedimiento, según alguna de las
reivindicaciones de la 1 a la 4, caracterizado porque se
pueden variar durante el transcurso de un experimento el tipo de
los medios líquidos y/o sus direcciones de flujo y/o su
distribución y/o sus caudales de flujo.
6. Procedimiento, según alguna de las
reivindicaciones 1, 2, 3 ó 5, caracterizado porque en el caso
de cámaras de cultivo de células conectadas en serie, se
transfieren los medios líquidos de cada una de las cámaras de
cultivo de células a la siguiente cámara de cultivo de células de
forma continua.
7. Procedimiento, según alguna de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se pueden
variar durante el transcurso de un experimento el tipo de los gases
y/o sus direcciones de flujo y/o su distribución y/o la
concentración de los gases integrantes.
8. Procedimiento, según alguna de las
reivindicaciones 3, 5, 6 ó 7, caracterizado porque en el caso
de cámaras de cultivo de células (20) conectadas en serie, se
transfieren los gases de cada una de las cámaras de cultivo de
células a la siguiente cámara de cultivo de células de forma
continua.
9. Procedimiento, según alguna de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque, como
mínimo, en uno de los cultivos de células dentro, como mínimo, de
una cámara de cultivo de células (20) se medirá de forma permanente
la temperatura existente y se transmitirá como entrada de valor real
de temperatura al correspondiente ciclo de control o regulación de
la temperatura, por medio del cual se puede controlar o regular la
calefacción del cultivo de células del modo que corresponda.
10. Procedimiento, según alguna de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque en el
interior, como mínimo, de una de las cámaras de cultivo de células
(20) se pueden establecer, a cada uno de los lados de una membrana
permeable a los gases, un cultivo de células de distinto tipo, con
el fin de obtener un cocultivo directo de ambos cultivos de
células.
11. Procedimiento, según la reivindicación 10,
caracterizado por la puesta en funcionamiento de un primer
flujo de medios hacia uno de los lados de la membrana, es decir, al
lado apical con el primer cultivo de células, y un segundo flujo de
medios distinto con respecto al primer caudal de medios hacia el
otro de los lados de la membrana, es decir, al lado basolateral con
el segundo cultivo de células.
12. Procedimiento, según alguna de las
reivindicaciones de la 1 a la 9, caracterizado por la
aplicación del procedimiento para el cocultivo indirecto, de forma
que se pueden disponer distintos sistemas biológicos (es decir,
tipos de tejidos y de células) en las cámaras de cultivo de células
(20) correspondientes uno detrás del otro.
13. Procedimiento, según alguna de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado por la observación
microscópica por medio de imágenes de vídeo, como mínimo, de un
cultivo de células, como mínimo, en una cámara de cultivo de
células (20).
14. Procedimiento, según alguna de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque todos los
datos que se obtengan por medio de:
- la observación permanente por medio de un
microscopio, como mínimo, de un cultivo de células, como mínimo, en
una cámara de cultivo de células (20) y/o
- la medición permanente de los parámetros
relevantes de los cultivos de células y/o
- la medición permanente de la temperatura
existente, como mínimo, en uno de los cultivos de células dentro,
como mínimo, de una de las cámaras de cultivo de células (20);
se transfieren a un sistema de control y
vigilancia (G) controlado por un ordenador para su procesado
posterior.
15. Procedimiento, según la reivindicación 14,
caracterizado porque la medida permanente de los parámetros
relevantes del cultivo de células se realizan con ayuda de un
proceso de medida que emplea un software determinado.
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