AT407047B - Zellkulturvorrichtung - Google Patents

Description

   <Desc/Clms Page number 1> 
 



   Die Erfindung betrifft eine Zellkulturvorrichtung mit wenigstens einer Wachstumsunterlage für die Zellen, an die auf wenigstens einer Seite ein Nährmediumraum angrenzt, der über Ein- und Ausströmöffnungen mit einem flüssigen Nährmedium vorzugsweise kontinuierlich versorgbar ist. 



   Es ist allgemein bekannt, dass Zellen aus Organgeweben entnommen und extrakorporal zur Vermehrung gebracht werden können. Manche Zelltypen entwickeln dabei Eigenschaften, die zeitlich unbegrenzte Vermehrung (durch permanente Zell-Teilung) aufweisen, sogenannte permanente Zell-Linien. Frisch aus Geweben entnommene Zellen (z. B. aus chirurgischen Proben oder aus Organgeweben von Versuchstieren) hingegen weisen diese Eigenschaft meist nicht auf. 



  Zellen solcher primärer Kulturen teilen sich entweder überhaupt nicht, oder nur einige wenige Male, d. h. sie können nur über kurze Zeit und unter Verlust der meisten ursprünglichen Funktions- leistungen (Dedifferenzierung) in Kultur gehalten werden. 



   Das Anhaften von Zellen auf ihrer Wachstumsunterlage sowie die Differenzierung der Zellen sind im wesentlichen von der Beschaffenheit der Wachstumsunterlage (Substrat) abhängig. 



   Die Einführung mikroporöser Substrate, meist dünne Folien aus verschiedenen organischen oder anorganischen Werkstoffen (mit oder ohne Beschichtung durch extrazelluläre Matrix- moleküle), führte zu deutlich besserer Differenzierung von Zellen in Kultur. Dies gilt insbesondere für jene Zellen (Epithel- und Endothelzellen), die in einschichtigen Lagen (Monolayer) wachsen. 



  Die hiefür verwendeten Kulturgefässe sind meist Hohlzylinder, deren unteres Ende von einer mikroporösen Membran verschlossen ist, auf welche die zu kultivierenden Zellen aufgebracht werden. Diese Zylinder werden dann in ein entsprechend grösseres Kulturgefäss eingebracht, sodass die Versorgung der Zellen oder Monolayer von beiden Seiten, der apikalen oder basolateralen, erfolgt (US-PS 4,608,342). Bei diesen Kultivierungsmethoden wird das Nährmedium in bestimmten Abständen ersetzt, man spricht von statischen Kulturbedingungen. Dabei können im Kulturmedium von Zellen produzierte Stoffe akkumulieren die Wachstum und Differenzierung negativ beeinflussen 
Dieses Verfahren wurde daher verschiedentlich verbessert. So können z.

   B. mikroporöse Substrate in eine entsprechende Halterung aus zwei konzentrischen Ringen (Zellträger) geklemmt und Zellen auf der Membran zum Anwachsen gebracht werden. Diese Zellträger werden anschliessend in ein Kulturgefäss transferiert, welches die getrennte apikale und basolaterale    kontinuierliche Umströmung Per (i)fusion vonZellträgern mit Kulturmedien unterschiedlicher   Komposition, oder gestapelter Zellträger mit nur einem Nährmedium, ermöglicht (DE-PS 39 23 279). Diese Zellkultursysteme sind einfach zu hantieren und ermöglichen es, primäre Zellkulturen über längere Zeiträume als mit konventionellen soliden Kunststoffsubstraten oder mikroporösen Substraten unter statischen Bedingungen zu halten. Sie weisen aber den Nachteil auf, dass nur Kulturkammern für Zellträger mit sehr kleiner Wachstumsfläche, ca. 0,9 cm2, erhältlich sind.

   Die per(i)fusions Zellkulturapparatur, in welcher Zellträger gestapelt werden können, um genügend Material für biochemisch-zellbiologische Analysen zu erhalten, weist den Nachteil unzureichender Oxygenierung des Mediums zwischen den Zellträgern auf. Beide Apparaturen weisen ferner Durchmischungsinhomogenitäten beim kontinuierlichen Nährmediumersatz Per (i)fusion auf. 



   Aufgabe der Erfindung ist eine Zellkulturvorrichtung zu schaffen, die das Wachstum von Zellen über lange Zeiträume unter Bedingungen, die der Situation im intakten Organismus weitestgehend entsprechen, ermöglichen. 



   Dies wird erfindungsgemäss dadurch erreicht, dass die Zellkulturvorrichtung mindestens einen mit einem definierten Gas- oder Gasgemisch befüllbaren Gasraum aufweist, der an den Nährmediumraum über eine flüssigkeitsdichte, aber gasdurchlässige Membran anschliesst. 



   Damit ist es möglich, im Nährmedium, welches in unmittelbarem Kontakt mit den kultivierten Zellen steht, definierte Partialdrucke (p) für Sauerstoff (O2). Stickstoff (N2), Kohlendioxyd (C02) oder beliebige andere Gase von biologischer oder toxikologischer Bedeutung einzuhalten. 



   Dies ist von besonderer Bedeutung, da die bisher in Verwendung befindlichen Zellkultur- apparaturen mit kontinuierlichem Ersatz von Nährmedien nicht gewährleisten, dass an allen Positionen über den Zellen oder Zellschichten identische Partialdrucke für die biologisch entscheidenden Gase, wie beispielsweise Sauerstoff und Kohlendioxyd, vorliegen. 



   Weitere Vorteile und Einzelheiten der Erfindung werden anhand der nachfolgenden Figuren- beschreibung näher erläutert: 

 <Desc/Clms Page number 2> 

 
Die Fig. 1 zeigt in einem schematischen vertikalen Schnitt ein Ausführungsbeispiel eines Zellkulturteiles einer erfindungsgemässen Zellkulturvorrichtung, die Fig. 2 zeigt eine entsprechende Draufsicht, die Fig. 3 zeigt in einem vertikalen zentralen Schnitt einen   Begasungsteil   einer erfindungs- gemässen Zellkulturvorrichtung, die Fig. 4 zeigt diesen Begasungsteil in einer Draufsicht, und die Fig. 5 zeigt in einem schematischen vertikalen Schnitt den Zusammenbau von zwei Zell- kulturteilen und drei Begasungsteilen einer erfindungsgemässen Zellkulturvorrichtung. 



   Das gezeigte Ausführungsbeispiel der erfindungsgemässen Zellkulturvorrichtung besteht aus einem Zellkulturteil (Fig. 1 und 2) und einem Begasungsteil (Fig. 3 und 4), die beispielsweise, wie in Fig. 5 gezeigt, zusammengesetzt werden können. 



   Der Zellkulturteil (ZKT) stellt eine ringförmige Halterung für eine mikroporöse Wachstumsunterlage 1 dar, welche für optimalen Stoffaustausch zwischen Zellkulturmedium (Nährlösung) und Zellen 2 (hier zwei Monolayer) sorgt und somit die spezielle Differenzierung von Zellen verbessert. Die Zu- bzw. Abfuhr von Nährmedien in den oberen 4 und unteren 5 Nährmediumraum des Zellkulturteiles ZKT erfolgt über Kanäle 3 getrennt für jede Seite der Wachstumsunterlage, wobei die Ein- und Ausströmungsöffnungen so konzipiert sind, dass sie für einen homogenen Medienersatz sorgen, es also zu keinen Zonen ungleicher Durchmischung kommt. Damit ist es möglich, oben (apikal) und unten (basal) verschiedene Nährmedien zu verwenden und organotypische Kulturbedingungen zu schaffen. 



   Der Zellkulturteil ZKT ist durch eine Gas-, nicht aber nährmediumdurchlässige Membran 5, vorzugsweise aus PTFE, vom Begasungsteil GT getrennt. 



   Der Begasungsteil GT ist als gesonderter Bauteil ausgebildet, der dieselben zylindrischen Aussenabmessungen aufweist, wie der Zellkulturteil ZKT der Fig. 1 und 2. Der Begasungsteil der Fig. 3 weist oben und unten jeweils eine gasdurchlässige Membran 5 auf, die in einer Halterung 12 gasdicht gehalten ist. Der eigentliche Gasraum 13 befindet sich zwischen den beiden Membranen 5 und wird über vertikale Kanäle 8 aus einem nicht dargestellten Gasvorrat über ebenfalls nicht dargestellte Leitungen mit dem gewünschten Gas in der gewünschten Konzentration versorgt, wobei das Gas über die vertikalen Kanäle strömen kann, die auch im fluchtend darunter bzw. darüber liegenden Zellkulturteil vorhanden sind. 



   Die Wachstumsunterlagen 1 für die zu kultivierenden Zellen 2 sind leicht austauschbar, sodass erforderliche biochemische oder molekularbiologische Messgrössen auf einfache Weise erhoben werden können. Die gasdurchlässige Membran 5 kann ebenfalls auf einfache eise ersetzt werden. 



  Der Begasungsteil GT (inkl. der vertikalen Gaskanäle 8) und die Halterung 12 für die gasdurchlässige Membran 5 sind mit O-Ringen 6 gegen den ZKT abgedichtet. GT und ZKT können gestapelt werden, wie dies die Fig. 5 zeigt, sodass die gleichzeitige Kultivierung von (beliebig) vielen Zellsubstraten unter kontinuierlichem Ersatz von Nährmedium möglich ist. Der Zusammenbau erfolgt in Richtung der Pfeile 11, wobei nicht gezeigte Schrauben durch die fluchtenden Bohrungen 9 alle Teile zusammenpressen können. Die Fläche des einzelnen Zellsubstrates (Wachstumsunterlage) beträgt hier ca. 5 cm2. 



   Alle Begasungsteile GT sind über einen Kanal 8 miteinander verbunden, sodass nur eine Gaszufuhr-14 und eine Gas-Auslassöffnung 15 erforderlich ist. Vom Kanal 8 gehen Seitenkanäle 8a in die Gasräume. Die Abdichtung des Gas-Strömungskanales zwischen GT und ZKT erfolgt ebenfalls mittels O-Ringen 6. 



   Die beiden Enden des Zellkulturapparates sind mit Gasteilen verschlossen, welche nur eine, dem ZKT zugewandte, gasdurchlässige Membran aufweisen. Der Rest ist an den Stellen 10 dicht verschlossen. 



   Da der Abstand zwischen der Membran 5 des GT und dem Zellkulturträger (Wachstumsunterlage 1) sehr gering und damit das Volumen des apikalen bzw. basolateralen Flüssigkeitskompartimentes (Nährmediumräume 4,5) jeweils sehr klein ist, wird sehr rasch ein Equilibrium zwischen den Gasen im GT und den im Nährmedium gelösten Gasen erreicht und konstantgehalten. 



   Die erfindungsgemässe Zellkulturvorrichtung ermöglicht ferner die einfache Veränderung von Gaspartialdrucken im Kulturmedium sowie die einfache Beimengung potentiell die Funktion von Zellen beeinflussender Gase (z. B. gasförmige Anaesthetika oder Stickstoffmonoxyd) zum 

 <Desc/Clms Page number 3> 

 Nahrmedium. 



   Die Partialdrucke der verwendeten Gase können im Bedarfsfall sowohl im GT als auch im ZKT insbesondere mittels kommerziell erhältlicher Elektroden gemessen werden (O2. Clark-Elektroden, CO2 oder NO). Hiefür können entsprechende (z. B. O-Ring gedichtete) Öffnungen vorgesehen sein (nicht gezeigt) 
In einer bevorzugten Ausführungsform des ZKT, insbesondere bei der Kultivierung von Epi- und Endothelzellen oder der Ko-Kultivierung beider Zellen am gleichen Substrat, sind auf beiden Seiten des Zellsubstrates Elektroden zur Strominjektion sowie Elektroden zur kontinuierlichen Messung von über die Zellschichte hinweg entstandenen Potentialdifferenzen, welche aufgrund vektoriellen Transportes geladener Teilchen (meist Ionen) entstehen, angeordnet. Strominjektion und Potentialmessung kann mit dafür erhältlichen handelsüblichen Geräten vorgenommen werden. 



  Aus den bei Strominjektion sich verändernden Potentialdifferenzen kann der transepitheliale Widerstand bzw. die transepitheliale elektrische Leitfähigkeit (lonenleitfähigkeit) von Epithel und Endothel Monolayern ermittelt werden (Prinzip der Ussing-Kammer). 



   ZKT und GT sind beispielsweise aus Polysulfon gefertigt und können nach den für medizini- sche Gerätschaften vorgeschriebenen Normen mittels eines Autoklaven sterilisiert werden. Alle Teile sind günstigerweise wiederholt verwendbar, wenngleich auch Einmalartikel denkbar sind. Zur Dichtung werden Viton oder Silicon O-Ringe eingesetzt. Als mikroporöse Wachstumsunterlagen können kommerziell erhältliche Folien, die z. B. zur Herstellung von Membranfiltern Verwendung finden, eingesetzt werden. 



   Die Erfindung ist selbstverständlich nicht auf die dargestellten Ausführungsbeispiele be- schrankt. Insbesondere kann die Form der Nährmediumräume und der Gasräume bzw. der entsprechenden Zellkulturteile bzw. Begasungsteile von den dargestellten Formen abweichen. 



  Grundsätzlich lässt sich die Erfindung auch bei nur einseitig mit Medium versorgten Wachstumsunterlagen anwenden. Die Verbindung von ZKT und GT zu Stapeln kann anstelle der Schrauben auch durch andere Verbindungsmittel, z. B. Klammern, erfolgen. 



   PATENTANSPRÜCHE : 
1 Zellkulturvorrichtung mit wenigstens einer Wachstumsunterlage für die Zellen, an die auf wenigstens einer Seite ein Nährmediumraum angrenzt, der über Ein- und 
Ausströmöffnungen mit einem flüssigen Nährmedium, vorzugsweise kontinuierlich, versorgbar ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellkulturvorrichtung mindestens einen mit einem definierten Gas- oder Gasgemisch befüllbaren Gasraum (13) aufweist, der an den Nährmediumraum (4a, 4b) über eine flüssigkeitsdichte, aber gasdurchlässige 
Membran (5) anschliesst.

Claims (1)

1. 2. Zellkulturvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein Zellkulturteil (ZKT) und mindestens ein gesonderter damit lösbar verbindbarer Begasungsteil (GT) vorgesehen sind, wobei der Zellkulturteil (ZKT) wenigstens eine Wachstumsunterlage (1) und mindestens einen Nährmediumraum (4a, 4b) aufweist und wobei der Begasungsteil (GT) den Gasraum (13) und die gasdurchlässige Membran (5) aufweist.

   3. Zellkulturvorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass an jede Wachstumsunterlage (1) zwei gesondert mit Nährmedium versorgbare Nährmediumräume (4a, 4b) angrenzen, nämlich ein apikaler und ein basaler bzw. basolateraler Nährmedium- raum.

   4. Zellkulturvorrichtung nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass die beiden Nährmediumräume (4a, 4b) an einem einzigen Zellkulturteil (ZKT) ausgebildet sind.

   5. Zellkulturvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellkulturteile (ZKT) und die Begasungsteile (GT) in abwechselnder Abfolge in einem Stapel verbindbar sind, wobei die mittleren Begasungsteile zwei gasdurchlässige Membranen aufweisen, die jeweils einem angrenzenden Zellkulturteil zugewandt sind, und wobei die endseitigen Begasungsteile des Stapels einseitig eine gasdurchlässige Membran und endseitig einen dichten Abschluss aufweisen (Fig. 5). <Desc/Clms Page number 4>

   6. Zellkulturvorrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die vorzugsweise im wesentlichen hohlzylindrisch ausgebildeten Zellkulturteile (ZKT) und die vorzugsweise mit gleichen Radien ebenfalls im wesentlichen hohlzylindrisch ausgebildeten Begasungsteile (GT) fluchtende achsparallele Bohrungen aufweisen, über die sie beispielsweise mittels eingeführter Schrauben dicht zusammenpressbar sind.

   7. Zellkulturvorrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass zur Abdichtung der Zellkultur- und Begasungsteile O-Ringe (6) vorgesehen sind.

   8. Zellkulturvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die flüssigkeitsdichte, gasdurchlässige Membran (5) aus Polytetrafluorethylen (PTFE) besteht.

   9. Zellkulturvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Wände der Zellkultur- und Begasungsteile (ZKT, GT) aus Kunststoff, vorzugsweise aus Polysulfon bestehen.

   10. Zellkulturvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der oder die Gasräume (13) über vorzugsweise lösbar anschliessbare Leitungen mit mindestens einem Gasvorratsbehälter verbindbar sind.

   11. Zellkulturvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass im Mediumraum eine Einrichtung zur Erfassung der Partialdrücke der verwendeten Gase, vorzugsweise in Form von Elektroden, angeordnet ist.

   12. Zellkulturvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass auf zumindest einer Seite der Wachstumsunterlage Elektroden zur Strominjektion und Elektroden zur kontinuierlichen Messung von über die Zellschichte hinweg entstandenen Potentialdifferenzen angeordnet sind.