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Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Kultivierung von Zellen in einem von einem Oberteil abgedeckten Hohlzylinder, mit einem zwischen einer flüssigkeitsdurchlässigen oberen ersten Platte und einer beabstandeten flüssigkeitsdurchlässigen unteren zweiten Platte angeordneten Trägermaterial, und einer der ersten Platte zum Oberteil hin vorgelagerten Vorkammer.
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Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen in einer Vorrichtung mit einem zwischen zwei Platten eines Hohlzylinders angeordneten Trägermaterial, bei dem das Trägermaterial von einer einer Platte vorgelagerten Vorkammer her zu einem der anderen Platte nachgelagerten Raum hin und umgekehrt von einem flüssigen Medium umflossen wird.
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Von der Internetseite http://www.cescobio.com.tw der Fa. CESCO Bioengineering Co., Ltd., BelloCell
® und BelloStage
® Cell Culture System, Instruction Manual, und aus der
EP 1 333 085 A2 ist eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen bekannt. Die Vorrichtung besteht aus einem Hohlzylinder in dem zwischen einem oberen Sieb und einem unteren Sieb ein Trägermaterial aus porösem fibrösen Matrix-Material angeordnet ist. Das Matrix-Material dient dabei als Einbettung für die Zellen. Der Matrix vorgelagert ist eine Vorkammer bzw. eine obere Kammer und der Matrix nachgelagert ist eine untere Kammer. Die untere Kammer besteht im Wesentlichen aus einem kompressiblen Faltenbalg, von dem das flüssige Kultivierungsmedium aufgenommen und zur Stromrichtungsumkehr in Richtung obere Vorkammer ausgetrieben werden kann.
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Nachteilig bei der bekannten Vorrichtung ist, dass bei der Expansion des Faltenbalges ein Unterdruck entstehen kann, der auf die zu kultivierenden Zellen schädigend einwirken kann und somit unerwünscht ist. Weiterhin nachteilig ist, dass eine relativ aufwendige mechanische Apparatur zur Bewegung des Faltenbalges benötigt wird. Auch ist es notwendig, die bekannte Vorrichtung unter Reinraumbedingungen zu bestücken.
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Weiterhin ist aus der
US 5,501,971 A ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Kultivierung von Zellen in einem Reaktor bekannt, bei der ein Hohlzylinder von einem oberen und einem unteren Sieb begrenzt wird, in dem ein Trägermaterial zur Kultivierung von Zellen angeordnet ist und der seinerseits in einem Reaktorgefäß angeordnet ist. Das Reaktorgefäß weist ein Rührwerk auf, dessen Achse durch den Hohlzylinder hindurchführt und dessen Rührer für eine Umspülung des Hohlzylinders sorgt, so dass das in dem Reaktorgefäß angeordnete flüssige Medium über das obere Sieb dem Hohlzylinder zugeführt und über das untere Sieb aus dem Hohlzylinder abtransportiert wird, um in einer Art Kreislauf dem oberen Sieb wieder zugeführt zu werden.
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Nachteilig bei dieser bekannten Vorrichtung ist, dass ein mechanisches Rührwerk mit den damit verbundenen Nachteilen benötigt wird.
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Aus der
DE 198 22 050 A1 ist eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Durchführung von chemischen oder biologischen Reaktionen in einer mit einer Rührvorrichtung ausgestatteten, ein flüssiges, feste Partikel enthaltendes Medium aufweisenden Kammer, wobei die Reaktion an den festen Partikeln erfolgt, bekannt. Die festen Partikel werden dabei von einem für das flüssige Medium durchlässigen Behältnis umfasst.
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Nachteilig dabei ist, dass es praktisch nicht möglich ist, weitgehend ohne Cleanbench bzw. Reinraumtechnik an der Vorrichtung zu manipulieren.
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Weiterhin ist aus der
DE 198 01 763 C2 eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen bekannt. Die Vorrichtung umfasst einen Kulturbehälter, in dessen Inneren ein Zellkulturinsert angeordnet ist, der eine flüssigkeitsdurchlässige Tragstruktur für eine Membran bildet, die eine Zellkultur trägt. Zum Zuführen von Kulturmedium zu dem Kulturbehälter ist eine Versorgungseinrichtung vorgesehen, die in Abhängigkeit vom Ausgangssignal eines Pegelfühlers gesteuert wird.
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Aus der
DE 197 25 602 A1 ist eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Züchtern von Zellen bekannt. Die Vorrichtung umfasst eine Zellkulturkammer mit Einlass- und Auslasseinrichtungen, eine Substrateinrichtung, welche innen in der Zellkulturkammer zum Anhaften von Zellen angeordnet ist, und Einrichtungen zum Zirkulieren eines Kulturmediums durch die Zellkulturkammer. Die Zirkulationseinrichtung soll ein alternierendes Erhöhen und Erniedrigen des Kulturmediumniveaus relativ zu der Oberfläche der Substrateinrichtung bewirken.
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Weiterhin ist aus der
DE 693 05 163 T2 eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Kultivierung von biologischen Zellmaterial in Form von festen Teilchen bekannt, in der man die festen Teilchen mit einem flüssigen Kulturmedium in Kontakt bringt und die es erlaubt, die Raumdichte des biologischen Materials in Bezug auf das Volumen des Kulturmediums im Wesentlichen konstant zu halten. Die Vorrichtung umfasst eine Kultivierungskammer, die aus einem Behälter besteht, der von Wänden begrenzt ist, wobei mindestens eine der Wände beweglich ist, so dass der Behälter ein variables Volumen hat, Einrichtungen zur Einführung, zum Abführen und zur Zirkulation der Flüssigkeit zu, in und aus dem Behälter und Einrichtungen zu Zurückhalten der genannten Teilchen und zu Abtrennung derselben mit der Flüssigkeit, um diese im Innern des Behälters zu halten.
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Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine Vorrichtung zu schaffen, die zu einem auf einen mechanischen Antrieb verzichten kann und die zum anderen unerwünschte Unterdrücke und Scherkräfte vermeidet. Auch soll es möglich sein, weitgehend ohne Cleanbench bzw. Reinraumtechnik an der Vorrichtung manipulieren zu können.
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Diese Aufgabe wird in Verbindung mit dem Oberbegriff des Anspruches 1 dadurch gelöst, dass der Hohlzylinder in einem von einem Deckel abdeckbaren Kulturgefäß angeordnet ist, dass das Kulturgefäß eine obere Niveausonde und eine untere Niveausonde aufweist, und dass ein flüssiges Medium mittels einer mit den Niveausonden verbundenen Mess- und Regeleinrichtung niveaugesteuert zwischen der Vorkammer und dem den Hohlzylinder umgebenden Raum des Kulturgefäßes über eine Verbindung, welche durch Poren in den Platten geschaffen ist, kommunizieren kann.
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Durch die Anordnung des Hohlzylinders in einem abschließbaren Kulturgefäß kann auf eine spezielle Reinraumtechnik für Manipulationen an der Vorrichtung verzichtet werden. Der Medienaustausch kann über sterilisierbare Anschlüsse erfolgen. Durch die Niveausteuerung kann auf mechanische Antriebe und etwaige Unterdrücke gänzlich verzichtet werden. Unter Poren in den Platten sind dabei sowohl Öffnungen bzw. Poren in Membranen als auch Öffnungen bzw. Maschen in Sieben etc. zu verstehen.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Strömungsrichtung des Mediums über ein Druckventil steuerbar. Über die Mess- und Regeleinrichtung kann dabei durch eine Druck- und/oder Zeitregelung eine Strömungsgeschwindigkeit des Mediums vorgegeben werden.
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Dadurch ist es möglich eine sehr geringe bzw. optimale Frequenz der Hubbewegung bzw. Strömung des Mediums einzustellen, die das Anwachsen der Zellen auf dem Trägermaterial ermöglicht bzw. fördert. Die Hubfrequenz kann dabei wechselnden Bedürfnissen der Zellen angepasst werden.
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Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Platten als Siebe ausgebildet. Die Siebe lassen sich dabei relativ einfach auf die durchzuführende Kultivierung abstimmen. Für CHO-Zellen kann beispielsweise unten ein Sieb mit Poren (Maschen) von beispielsweise 10 μm und oben ein großmaschigeres Sieb verwendet werden.
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Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Platten als poröse Membranen ausgebildet.
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Dabei können vorteilhaft mikroporöse Membranen verwendet werden, die wachstumshemmende Produkte/Abbauprodukte durchlassen. Dabei kann mindestens die untere Membrane so ausgebildet sein, dass Zellen und Trägermaterial nicht durchgelassen werden. Dabei ist es vorteilhaft möglich, dass die Membranen so ausgewählt werden, dass je nach Anwendungsfall hochmolekulare Proteine, wie Antikörper etc. durchgelassen bzw. nicht durchgelassen werden.
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Die obere Membran kann zum einen wie die untere Membran ausgebildet sein und zum anderen kann die obere Membran so ausgebildet sein, dass Zellbruchstücke in die Vorkammer transportiert bzw. aufgeschwemmt werden können. Um die mechanische Stabilität der Membranen zu gewährleisten, können diese von einem Stützgitter stabilisiert werden. Das Träger-/ oder Matrix-Material kann beispielsweise als ein poröses keramisches Material ausgebildet sein. Es ist aber auch beispielsweise möglich, dass Trägermaterial aus einem Fasermaterial aus Kunststoff oder Keramik-Material auszubilden.
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Die bekannten Verfahren zur Kultivierung von Zellen weisen die oben genannten Nachteile auf.
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Weitere Aufgabe der Erfindung ist es daher, die bekannten Verfahren so zu verbessern, dass zum einen auf einen mechanischen Antrieb verzichtet werden kann und dass zum anderen Unterdrücke, die zu einer Zellschädigung führen können, sicher vermieden werden. Diese Aufgabe wird in Verbindung mit dem Oberbegriff des Anspruches 11 dadurch gelöst, dass die Strömungsgeschwindigkeit und/oder die Strömungsrichtung des Mediums über eine mit im nachgelagerten Raum angeordneten Niveausonden verbundene Mess- und Regeleinrichtung durch Beaufschlagung mit Druck gesteuert werden.
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Durch die Steuerung der Strömungsgeschwindigkeit oder der Strömungsrichtung des Mediums durch Beaufschlagung mit Druck in Abhängigkeit von dem Niveau des Mediums im nachgelagerten Raum, kann auf eine unerwünschte Mechanik der Vorrichtung verzichtet werden. Unerwünschter Unterdruck kann durch die entsprechende Druckbeaufschlagung gänzlich vermieden werden.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Regelung der Strömungsgeschwindigkeit druck- und/oder zeitabhängig.
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Durch die Regelung der Strömungsgeschwindigkeit kann eine für das optimale Wachstum der zu kultivierenden Zellen geeignete Strömungsgeschwindigkeit eingestellt werden.
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Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Medium durch den Druck eines Gas/Gasgemisches aus oder in den Hohlzylinder gedrückt. Hierbei wird ein Gas- bzw. Gasgemisch verwendet, dass ohnehin für ein optimales Zellwachstum benötigt wird. Eine Regelung des pH- und/oder des pO2-Wertes kann dabei ebenfalls über das Gas/Gasgemisch erfolgen. Es ist aber auch möglich, das Medium über eine Begasungseinrichtung und ein im Kulturgefäß angeordnetes Begasungsrohr direkt zu begasen.
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Weitere Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden ausführlichen Beschreibung und den beigefügten Zeichnungen, in denen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung beispielhaft veranschaulicht sind.
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In den Zeichnungen zeigen:
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1: Eine räumliche Darstellung einer Vorrichtung zur Kultivierung von Zellen,
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2: eine Seitenansicht eines Hohlzylinders ohne Trägermaterial im Schnitt und
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3: eine räumliche Darstellung eines Hohlzylinders mit Trennmaterial im Schnitt.
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Eine Vorrichtung 1 zur Kultivierung von Zellen besteht im Wesentlichen aus einem Hohlzylinder 2, einem Kulturgefäß 3 und einem Deckel 4.
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Der Hohlzylinder 2 besteht aus einem Mantelrohr 5, das an seinem unteren Ende 6 mit einer eine Durchlassöffnung 7 aufweisenden Bodenplatte 8 verbunden ist. An seinem dem unteren Ende 6 abgewandten oberen Ende 9 wird das Mantelrohr 5 von einem Oberteil 10 abgedeckt. Der Bodenplatte 8 benachbart weist der Hohlzylinder 2 eine untere Platte 11 auf, die als ein Sieb oder eine flüssigkeitsdurchlässige Membran ausgebildet ist. In einem Abstand 12 zur unteren Platte 11 ist eine obere Platte 13 so angeordnet, dass zwischen der oberen Platte 13 und dem Oberteil 10 eine Vorkammer 14 gebildet wird. Die zwischen unterer Platte 11 und oberer Platte 13 gebildete Kammer 15 ist mit dem das Zellwachstum begünstigenden Trägermaterial 16 ausgefüllt. Das Trägermaterial 16 bildet die sogenannte Matrix für die zu kultivierenden Zellen. Das Oberteil 10 und die Bodenplatte 8 sind über eine Zugstange 17 miteinander verbunden.
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Das Oberteil weist mittig einen Befestigungsansatz 18 auf, über den es mit dem Deckel 4 des Kulturgefäßes 3 verbindbar (bspw. verschraubbar) ist. Weiterhin weist das Oberteil 10 es durchdringende Anschlussstutzen 19 auf, die über Silikonschläuche 20 mit entsprechenden im Deckel 4 angeordneten Deckelstutzen 21 verbindbar sind. Ein langer Anschlussstutzen 22 des Oberteiles 10 endet kurz oberhalb der oberen Platte 13. Während die anderen Anschlussstutzen 19 in einem etwas größeren Abstand zur oberen Platte 13 enden.
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An dem Deckel 4 ist eine untere Niveausonde 23 so angeordnet, dass ihr freies unteres Ende 24 auf der Höhe des im Kulturgefäß 3 vorgesehenen unteren Niveaus 25 des flüssigen Mediums 26 endet. Eine obere Niveausonde 27 ist im Deckel 4 so angeordnet, dass ihr freies unteres Ende 28 auf der Höhe des vorgesehenen oberen Niveaus 29 des flüssigen Mediums 26 endet. Ebenfalls am Deckel 4 befestigt ist ein Begasungsrohr 30, dessen unteres Ende 31 einem Boden 32 des Kulturgefäßes 3 benachbart angeordnet ist.
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Die Niveausonden 23, 27 und evtl. weitere nicht dargestellte Messsonden sind mit einer ebenfalls nicht dargestellten Mess- und Regeleinrichtung verbunden.
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Verfahrensbeispiel
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Der Hohlzylinder 2 wird mit den für die durchzuführende Kultivierung geeigneten Platten 11, 13 versehen. Dabei kann beispielsweise für CHO-Zellen als untere Platte 11 ein 10 μm-Sieb und als obere Platte ein grobmaschigeres Sieb verwendet werden. Der Hohlzylinder 2 wird mit dem Trägermaterial 16, beispielsweise porösem keramischen Material (Sponceran® der Firma Zellwerk) gefüllt, verschlossen und mit dem Deckel 4 des Kulturgefäßes 3 verbunden. Dabei werden die Anschlussstutzen 19, 22 des Oberteils 10 mit den Deckelstutzen 21 über Silikonschläuche 20 verbunden. Der lange Anschlussstutzen 22 und einer der Anschlussstutzen 19 werden mittels Silikonschlauch über nicht dargestellte, der sterilen Verbindung von Schläuchen nach der Sterilisation dienende Kupplungen verbunden. An die beiden anderen Anschlussstutzen 19 werden ebenfalls nicht dargestellte Steril-Membranfilter angeschlossen. Die beiden Niveausonden 23, 27 werden auf das gewünschte untere Niveau 25 und das gewünschte obere Niveau 29, die das minimale und maximale Niveau bzw. Volumen im Kulturgefäß 3 darstellen, eingestellt. Alle weiteren notwendigen Ein- und Anbauten am Kulturgefäß 3 werden vorgenommen. Anschließend wird das Kulturgefäß 3 mit ca. 300 bis 500 ml Reinstwasser gefüllt und im Autoklaven sterilisiert. Nachfolgend wird das Wasser aus dem Kulturgefäß 3 entfernt und das Kulturgefäß 3 mit sterilem Medium 26 gefüllt. Das Medium 26 und seine Zusammensetzung hängen von der Zelllinie und/oder dem gewünschten Produkt ab. Das Kulturgefäß 3 wird anschließend an die Mess-/ und Regeleinrichtung angeschlossen und alle für die Vorbereitung der Zell-Kultivierung notwendigen Schritte (Kalibrierung von Sonden, Einstellung von Regler-Sollwerten u. s. w.) werden ausgeführt. Über einen Deckelstutzen 21 wird eine Verbindung zu einer nicht dargestellten Animpfflasche hergestellt. In der Animpfflasche befinden die zu kultivierenden Zellen, z. B. adhärent wachsende CHO-Zellen einer Zelllinie, die z. B. Proteine produziert. Durch eine sehr geringe Frequenz der Hubbewegung des Niveaus bzw. der Strömungsgeschwindigkeit des Mediums 26 wird das Anwachsen der Zellen an das Trägermaterial 16 ermöglicht bzw. gefördert. Nach dem Anwachsen der Zellen, die Anzahl der noch nicht angewachsenen Zellen kann über eine Probeentnahme über den langen Anschlussstutzen 22 bestimmt werden, wird die Hubfrequenz bzw. die Strömungsgeschwindigkeit den Bedürfnissen der Zellen angepasst. Die Begasung, die Regelung des pH- und des pO2-Wertes erfolgt über ein Gas/Gasgemisch, das das Medium 26 aus dem Hohlzylinder 2 bzw. dem Kulturgefäß 3 drückt. Zusätzlich kann das Medium 26 noch über Begasungsrohr 30 direkt begast werden. Das notwendige Wechseln des Mediums 26 (Entfernung von wachstumshemmenden Substanzen, Nachlieferung von Nährstoffen und seine Häufigkeit) hängt z. B. von der gegebenen Zusammensetzung des Mediums 26 und dem „Wohlbefinden” der Zellen ab und erfolgt über das Kulturgefäß 3. Lebende Zellen werden dabei über das 10 μm-Sieb im Hohlzylinder 2 zurückgehalten.
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Bei dem eingebauten 10 μm-Sieb ist davon auszugehen, dass das gebildete Produkt sich im ausgetauschten Medium 26 befindet.
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Die Gewinnung (Ankonzentrierung, Reinigung des Produktes) erfolgt dann nach in der Zellkultivierung üblichen Verfahren.
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Durch die Verwendung einer Membran anstatt des 10 μm-Siebes kann erreicht werden, dass die „Abfall-Produkte” in das Medium 26 des Kulturgefäßes 3 transportiert werden. Die gewünschten Proteine/Produkt in dem Hohlzylinder 2 zurückgehalten werden. Die „Ernte” des Produktes erfolgt dann in folgender Weise: Zum Zeitpunkt der Ernte wird der Hohlzylinder nicht bis zu oberen Platte 13, sondern bis zum Oberteil 10 des Hohlzylinders 2 gefüllt. Anschließend wird der Überstand, in dem sich das Produkt befindet, abgeführt, so dass die weitere Aufarbeitung, wie oben beschrieben, erfolgen kann.
