DE19822050A1

DE19822050A1 - Verfahren zur Durchführung von chemischen oder biologischen Reaktionen

Info

Publication number: DE19822050A1
Application number: DE1998122050
Authority: DE
Inventors: Sebastian Schmidt; Nanni Jelinek; Manfred Biselli
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 1998-05-16
Filing date: 1998-05-16
Publication date: 1999-11-18
Also published as: NL1011981A1; NL1011981C2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung von chemischen oder biologischen Reaktionen in einer mit einer Rührvorrichtung ausgestatteten, ein flüssiges, feste Partikeln enthaltendes Medium aufweisenden Kammer, wobei die Reaktion an den festen Partikeln erfolgt und diese festen Partikeln von einem für das flüssige Medium durchlässigen Behältnis umfaßt werden. Ein solches Verfahren bietet erhebliche Vorteile, wenn Reaktionen mit empfindlichen Komponenten durchgeführt werden, weil das erfindungsgemäße Verfahren eine vollständige Trennung des von dem Behältnis umfaßten Raums und dem Rest der Kammer vorsieht. DOLLAR A Das erfindungsgemäße Verfahren wird am besten mit einem bestimmten Behältnis durchgeführt, das sich besonders zum Einsatz in kommerziell erhältlichen Gewebekulturplatten eignet. Das Behältnis gemäß der Erfindung umfaßt einen zylinderförmigen Mantel, ein Sieb sowie mindestens drei Standbeine. Bei Anwendung dieses Behältnisses und Verwendung eines Magnetrührers als Rührvorrichtung in der Vertiefung der Gewebekulturplatte kann auf äußerst schonende Weise eine Kultivierung von menschlichen oder tierischen Zellen durchgeführt werden.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung von chemischen oder biologischen Reaktionen, welches in einer Kammer durchgeführt wird, welche mit einer Rührvorrichtung ausgestattet ist und ein flüssiges Medium aufweist welches feste Partikeln enthält. Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Behältnis zur Durchführung des Verfahrens.

Verfahren welche in einem flüssigen Medium mit festen Partikeln, welches sich in einer Kammer mit Rührvorrichtung befindet, durchgeführt werden, sind in der Technik ziemlich üblich. Seither werden zwar solche Verfahren bevorzugt, welche in einem völlig homogenen System ablaufen können wie z. B. in einer die Ausgangsprodukte sowie die Endprodukte in gelöster Form enthaltenden Flüssigkeit, weil in einem solchen homogenen System die Konstanz und Gleichmäßigkeit der Reaktionsbedingungen im Reaktionssystem am einfachsten zu kontrollieren und zu beherrschen sind. In vielen Reaktionen müssen jedoch Produkte eingesetzt werden, die bezüglich ihrer Löslichkeit unter den Bedingungen der Reaktion ein Problem darstellen. Viele größere Moleküle wie z. B. Eiweißmoleküle oder Antikörper, stellen dem Untersucher häufig solche Probleme, während bei Reaktionen, die nicht in einem zellfreien sondern einem Zellen enthaltenden System durchgeführt werden müssen, naturgemäß ebenfalls kein homogenes Reaktionssystem vorliegt.

Es sind verschiedene praktische Möglichkeiten verfügbar, um Reaktionen mit unlöslichen Bestandteilen durchzuführen. So ist es möglich die unlöslichen Bestandteile in der Flüssigkeit aufzuschwemmen wobei praktisch eine Suspension vorliegt. Dabei liegt die Notwendigkeit vor, eine ständige Bewegung der Flüssigkeit vorzunehmen, da eine nicht ausreichende Bewegung zu einem Gradient irgendwelcher Inhaltsstoffe der Flüssigkeit führen kann, wie einem durch Diffusionsvorgänge entstandenen Gradient von löslichen Bestandteilen oder einem schwerkraftbedingten Gradient der unlöslichen Bestandteile in der Flüssigkeit. Bei völlig unzureichenden Rührbedingungen werden die Partikeln sich sogar auf dem Boden des Reaktionsgefäßes absetzen was zu einer gänzlich mangelhaften Kontrolle führt. Diese Verfahrensweise, insbesondere das Vorhandensein einer Rührvorrichtung, führt häufig zu unerwünschten Nebeneffekten.

Es gibt manche Reaktionen welche extrem hohe Anforderungen an den Reaktionsbedingungen stellen und wobei speziell die unlösliche Bestandteile im System relativ ungestört bleiben müssen. Bereits geringe äußerliche Kräfte führen zu erheblichen Mängeln im Reaktionsergehnis. Es ist offensichtlich, daß die Scherkräfte welche bei einem Rührvorgang aufgeweckt werden können bereits zu solchen äußerlichen Kräften zu rechnen sind, geschweige noch der direkte Kontakt der zwischen Rührvorrichtung und unlöslichen Bestandteilen auftreten kann, denn dieser Kontakt kann bei empfindlichen, unlöslichen Bestandteilen regelmäßig zu einer Zerstörung führen.

Ein weiterer Nachteil stellt manchmal die Tatsache dar, daß am Ende der Reaktion eine Trennung der Bestandteile vorgenommen werden muß. Es liegt in der Natur der Sache, daß eine Trennung zwischen Ausgangsprodukten und Endprodukt vorgenommen werden muß, weil üblicherweise ein reines Endprodukt verlangt wird und ebenso ist es erforderlich in solchen Fällen wo kein einzelnes Produkt sondern eine Mischung von verschiedenen Produkten entsteht, auch hier eine Aufreinigung zu betreiben, wiederum damit als Ergebnis ein reines Endprodukt vorliegt. In Verfahren wo unlösliche Bestandteile eine Rolle spielen, ist es notwendig eine Trennung von gelösten und ungelösten Produkten vorzunehmen. Obwohl bekanntermaßen die Filtrierungstechnik seit jeher technisch benutzt wird und dem Fachmann eine Reihe von brauchbaren Techniken zur Verfügung steht, sind die Nachteile welche bei ihrer Durchführung auftreten können, vielfältig und dem Fachmann ebenfalls bekannt. Auch die einfachsten Filtrierverfahren stellen ein extra Schritt im Verfahren dar, welcher zu Verlusten an Zeit und Material führt.

Eine besondere Art der Durchführung einer Reaktion mit einem System welche Partikeln in einem flüssigen Medium umfaßt, betrifft die Kultivierung von menschlichen Zellen. Dabei werden die Zellen in einer Kammer gehalten, welche ein Wachstumsmedium enthält und mit einer Rührvorrichtung ausgestattet ist, und sind an einem Trägermaterial angesiedelt.

Es gibt in der Forschung und in der therapeutischen Medizin viele Gründe, menschliche Zellen außerhalb des menschlichen Körpers am Leben zu halten oder sogar zu züchten, wobei hierbei mit Zucht eine Vermehrung der menschlichen Zellen unter Laborbedingungen gemeint wird.

Es gibt z. B. konkrete Anforderungen aus der Humantherapie wo Knochenmark oder aus Blut gewonnene periphere Knochenmarkstammzellen benötigt werden:

(1) bei der autologen Knochenmarktransplantation wird einem Patienten Knochenmark entnommen und es ihm im Rahmen einer späteren Therapie oder z. B. nach erfolgter chemotherapeutischer Behandlung reimplantiert,
(2) bei Erkrankungen von Blutzellen könnte man eine Heilung solcher Zellen außerhalb des Körpers zustande bringen, um anschließend die geheilten Zellen zu reimplantieren, eine solche gezielte Behandlung käme z. B. bei Leukämie in Betracht,
(3) bei allogener Knochenmarkstransplantation wird Knochenmark eines gesunden Spenders einem Leukämiepatienten anstelle dessen eigenen Knochenmark implantiert.

Bei den hiervor aufgeführten Beispielen ist die Ursache des Leidens eine Störung auf dem Niveau des Knochenmarks und stellt eine Behandlung mit Knochenmarkszellen somit eine kausale Therapie der Krankheit dar.

Eine gängige Möglichkeit in bezug auf die Implantation eines Knochenmarkgemisches stellt die Implantation von sogenannten Stammzellen dar. Solche Stammzellen sind die Vorläufer sämtlicher Blutzellen und werden im Knochenmark sowie im peripheren Blut angetroffen. Gerade die Tatsache, daß Stammzellen im Blut angetroffen werden, macht sie zu einer attraktiven Möglichkeit, da eine wenig belastende Gewinnung möglich wird und durch eine gezielte Gewinnung der gewünschten Stammzellen beim Spender kein Verlust anderer Blutzellen eintritt.

Somit wird die Stammzelle für viele Anwendungen in der Humanmedizin als wertvolles Ausgangsmaterial für eine kausale Therapie angesehen und hat es entsprechend viele Anstrengungen gegeben, Stammzellen nach der Entnahme möglichst lange am Leben zu halten und ein Verfahren zu entwickeln, die Stammzellen in vitro zu vermehren, um somit für die Therapie eine unbeschränkte oder zumindest eine große Quelle von homogenem Material zur Verfügung zu haben.

Was vorstehend beispielhaft für die Stammzelle beschrieben wurde, gilt natürlich gleichermaßen für andere Zelltypen welche für eine kausale Therapie in Betracht kommen. Dabei ist z. B. zu denken an Myokardzellen, Hirnzellen, Augenzellen, Leberzellen, Nierenzellen, usw. Dabei muß der Bedarf auch nicht zum humanen Bereich beschränkt angesehen werden, gleiche Anforderungen können sich stellen im Veterinärbereich oder im Rahmen einer gezielten Sortenschutzentwicklung im Bereich der Entwicklung neuer Pflanzenzüchtungen.

Ein großes Problem im Rahmen vieler Entwicklungsarbeiten stellt die Tatsache dar, daß bei vielen Typen von Zellen eine ausgeprägte Empfindlichkeit vorliegt. Diese Empfindlichkeit verhindert bereits eine sinnvolle Handhabung unter reinen Haltungsbedingungen und hat auch zur Folge daß notwendige Untersuchungen zur Optimierung von Haltungs- und Vermehrungsbedingungen nicht durchgeführt werden können.

Insbesondere auch bei den hämatopoietischen Zellen einschließlich Stammzellen sind die praktischen Probleme bei der Entwicklung neuer therapeutischen Ansätze erheblich. Die Zeilen zeigen eine besonders hohe Empfindlichkeit gegenüber jeder Abweichung von der idealen Situation, wobei bereits geringe mechanische Belastungen zu einer Verschlechterung der Überlebensrate der Zellen führt. Dies ist bei den Zellen dieses Zelltyps sicherlich teilweise auf die Tatsache zurückzuführen, daß sie keine Zellwand aufweisen und aus dem Grunde mechanischen Belastungen schlechter standhalten. Bereits eine relativ geringe Scherkraftbelastung reicht aus, um eine hohe Mortalität bei diesen Zellen hervorzurufen.

Frühere Ansätze haben das Problem der hohen Empfindlichkeit nicht in ausreichendem Maße lösen können.

In der Anmeldung P 195 05 109.2 wird ein Verfahren beschrieben, menschliche oder tierische Zellmischpopulationen in einem Wirbelschichtreaktor auf mikroporöse Mikroträger anzusiedeln. Bei diesem Verfahren aus dem Stand der Technik werden die Mikroträger suspendiert in einem Wachstumsmedium gehalten, wobei die Strömungsgeschwindigkeit des Wachstumsmediums gering gehalten wird, um mögliche Verluste zu vermeiden.

Das Verfahren hat trotz Vorteile die Probleme nicht vollständig lösen können. Es war bei bestimmten Zelltypen, insbesondere bei den für Forschung und Therapie äußerst wertvollen Stammzellen, nicht möglich, unter Routinelaborbedingungen Ansätze zu fahren, wobei die Zellen in gewünschtem Umfang überlebten und eine Vermehrung konnte unter solchen Bedingungen überhaupt nicht festgestellt werden.

Es ist ein weiteres Problem bei Forschungsanstrengungen dieser Art, daß die Menge des verfügbaren Materials gering ist. Es ist den Spendern, egal ob Patient oder Proband nicht zuzumuten, häufig eine Entnahme von größeren Mengen Blut oder Knochenmarksmaterial vertragen zu müssen und folglich muß bei den Untersuchungen mit einer geringen Menge Ausgangsmaterial gearbeitet werden, welche nur bedingt aus gleicher Quelle angefüllt werden kann. Dies ist in der Phase, wo sich die Forschung zur Zeit befindet, besonders beschwerlich, da die notwendigen Arbeiten zur Optimierung vieler Verfahrensparameter lediglich im Rahmen eines umfangreichen Screeningprogramms sinnvoll zum Abschluß gebracht werden können. Voraussetzung für ein solches Screeningprogramm ist die Verfügbarkeit einer größeren Menge eines homogenen Ausgangsmaterials.

Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde ein Verfahren zur Durchführung von Reaktionen bei denen feste Partikeln in einem flüssigen Medium beteiligt sind zur Verfügung zu stellen, das einfach handhabbar und praktisch gut durchführbar ist und wobei insbesondere solche Bedingungen im System vorliegen, daß das relativ aufwendige und zu Verlusten führende Filtrierungsverfahren auf einfachere Weise durchgeführt werden kann. Durch das Verfahren soll eine Verbesserung der Kultivierung von menschlichen oder tierischen Zellen möglich werden, wobei die Kultivierung unter besonders schonenden Bedingungen durchgeführt wird. Es ist dabei ein besonderes Ziel, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, wobei mit geringen Mengen an Material gearbeitet werden kann.

Die Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den kennzeichnenden Merkmalen des Hauptanspruchs gelöst.

Es betrifft somit ein Verfahren zur Durchführung von chemischen oder biologischen Reaktionen welche in einem flüssigen Medium enthaltend feste Partikeln durchgeführt wird. Die chemischen und biologischen Reaktionen umfassen zunächst die übliche Lehrbuchchemie wobei aus einem oder mehreren Ausgangsprodukten ein Endprodukt oder mehrere Endprodukte gebildet werden. Dabei ist es im Rahmen der Erfindung möglich, daß ein Ausgangsprodukt oder mehrere Ausgangsprodukte als feste Partikeln vorgelegt werden, ebenso ist denkbar, daß nicht die Ausgangsprodukte sondern der bei der Reaktion erforderliche Katalysator als festes Teilchen oder an feste Partikeln gebunden vorliegt. Dabei kann der Katalysator anorganischer Natur sein oder ganz wesentlich im Rahmen der Erfindung ein Enzym sein. Insbesondere Enzyme als hochmolekulare Produkte eignen sich besonders zur Durchführung des erfindungsgemaßen Verfahrens. Die Enzyme können als Einzelprodukt eingesetzt werden oder gekoppelt an irgendeinem Trägermaterial vorliegen. Insbesondere die letztgenannte Anwendung wobei das Enzym mittels einer chemischen Reaktion oder eines anderen Mechanismus an reaktionsneutrale Teilchen befestigt wird, stellt im Rahmen der Erfindung eine besonders attraktive Verfahrensweise dar. Ebenso gut durchführbar ist das Verfahren für biologische Reaktionen welche mit Hilfe einer Antikörperreaktion durchgeführt werden. Das Antikörper kann dabei z. B. als Hilfsmittel bei der Aufreinigung oder für eine beliebige andere Verwendung benutzt werden.

Die Reaktion wird in einer Kammer durchgeführt welche mit einer Rührvorrichtung ausgestattet ist. Dabei kommt es auf die besondere Form der Kammer gar nicht an, gemeint ist lediglich irgendeine Geometrie welche in der Lage ist, eine Flüssigkeit zu enthalten. Welche Form die Kammer aufweist, aus welchem Material sie besteht, ob sie abschließbar ist oder offen ausgebildet ist, ob sie ausgestattet ist mit bestimmten Zu- oder Abführleitungen, ob sie begast werden kann, welches Volumen an Flüssigkeit sie aufnehmen hängt grundsätzlich von dem jeweiligen Typ der anvisierten chemischen oder biologischen Reaktion ab. Es sollte im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens keineswegs ausgeschlossen werde, daß es im Rahmen einer großtechnischen Herstellung durchgeführt wird. Auch bei Herstellungen in größerem Maßstab kann das erfindungsgemäße Verfahren eine wünschenswerte Anwendung finden, vielleicht sogar speziell in einem solchen größeren Maßstab, da es geradezu bei einer industriellen Anwendung besonders auf Vereinfachung und Einsparung ankommt und bereits relativ geringe Vorteile im industriellen Umfeld eine erhebliche Auswirkung haben.

Trotzdem ist es das primäre Augenmerk der Erfinder, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, daß im Labormaßstab eingesetzt werden kann und seine Vorteile optimal entfaltet, wo der Untersucher welcher das erfindungsgemäße Verfahren anwendet gezwungenermaßen mit äußerst geringen Mengen an Ausgangsmaterial arbeiten muß.

Dieses primäre Augenmerk hat die Erfinder veranlaßt das Verfahren speziell für solche Reaktionsbedingungen vorzusehen, wobei die Materialmengen äußerst gering sind und der Untersucher ständig darauf bedacht ist, die Bedingungen der Reaktion auf die geringe Materialmenge auszurichten.

Das Problem der geringen Menge an Ausgangsmaterial wird z. B. ausgeprägt begegnet, wenn es ein Verfahren zur Kultivierung von menschlichen oder tierischen Zellen wie z. B. hämatopoietische Stammzellen betrifft, wie es nachher im Rahmen einer bevorzugten Ausführungsform noch ausführlicher dargestellt wird.

Es stellt somit eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens dar, daß die Kammer welche zur Durchführung des Verfahrens vorgesehen ist, ein Volumen von unter 20 ml aufweist. Bevorzugt wird ein Reaktionsvolumen von 0,37 bis 16,8 ml, besonders bevorzugt wird ein Volumen von etwa 6 ml. Ein solches Volumen ist auch praktikabel für Versuch wo lediglich kleinste Mengen Ausgangsmaterial vorliegen, andererseits erlaubt ein solches Volumen eine Durchführung im Routinebetrieb. Wie nachher weiter ausgeführt wird, ist es eine der attraktiven Möglichkeiten bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens das erfindungsgemäße Verfahren zu Screeningzwecken im Rahmen spezialisierter Untersuchungen zur Optimierung von Wachstumsbedingungen für menschliche Blutzellen einzusetzen.

Wie später anhand der Beschreibung konkret durchgeführter Versuchsreihen nach ausführlicher dargestellt wird, ist es eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens als Kammer zur Durchführung der Reaktion eine Vertiefung oder Aussparung einer Gewebekulturplatte zu verwenden.

Eine solche Bezeichnung definiert zwar nicht ohne weiteres automatisch die Geometrie einer solchen Vertiefung, es ist auch keineswegs erforderlich ein bestimmtes Format zu selektieren, da die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens grundsätzlich mit praktisch jedem Typ von Vertiefung durchführbar ist. Andererseits ist es durchaus eine bevorzugte Ausführung des Verfahrens, Gewebekulturplatten zu nehmen, welche kommerziell erhältlich sind. Sehr gut anwendbar sind die sog. "Corning® Multiple well plates" der Firma Corning Costar Corporation (Cambridge, MA 02140): Solche Platten haben sich in der biologischen Forschung wegen ihrer günstigen Eigenschaften eine hervorragende Stellung besorgt und stellen auch im Rahmen dieser Erfindung ein bevorzugtes Arbeitsmaterial dar. "Corning® Muitiplewell plates" sind Platten mit einer unterschiedlicher Zahl von Vertiefungen (auch als "wells" bezeichnet) verfügbar. Welche Ausführungsform bei der Durchführung des Verfahrens im einzelnen gewählt wird, wird primär durch die Menge des verfügbaren Materials und die Zwecke der Versuchsreihe bestimmt. Grundsätzlich kann das erfindungsgemäße Verfahren mit jeder erhältlichen Ausführungsform der "Corning® Multiple well plates" durchgeführt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird in einem flüssigen Medium durchgeführt. Das Medium kann dabei jede denkbare Zusammensetzung aufweisen. Hier sind den theoretischen Möglichkeiten keine Grenzen gesetzt. Jede denkbare Möglichkeit variierend von einem chemischen Verfahren in einem organischen Lösungsmittel zu einer biologischen Technik unter Zuhilfenahme einer wäßrigen Pufferlösung kann in Betracht kommen, wobei allerdings jederzeit zu beachten ist, daß das gewählte flüssige Medium sich mit den weiteren Bestandteilen im Verfahren verträgt.

Die festen Partikeln sind nicht an einer bestimmten Ausführungsform gebunden. Auch in bezug auf diese feste Partikeln gibt es eine beliebige Variation an Möglichkeiten. Einzige Bedingung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Voraussetzung, daß die festen Partikeln im ausgewählten flüssigen Medium nicht löslich sind. Ansonsten ist bei dem Material der Partikeln und bei deren genauen Geometrie lediglich auf deren Zweck im Verfahren zu achten. Im Rahmen der Erfindung wird es sicherlich eine bevorzugte Variante darstellen, von mehr oder weniger kugelförmige Partikeln auszugehen. Diese bieten eine relativ große Oberfläche, lassen sich hervorragend zu einer Packung stapeln und erlauben trotzdem einen ungestörten Durchfluß von flüssigem Medium.

Wie nachher im Rahmen der Ausführungsbeispiel näher erörtert wird, ist es eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, es im Rahmen der Kultivierung von menschlichen Körperzellen zu verwenden. Bei solchen Versuchen haben sich bestimmte Partikeln als äußerst gut verwendbar gezeigt. Besonders zweckmäßig sind poröse Wirbelkörper mit 200-1500 µm Durchmesser und einer Dichte von mindestens 1,1 kg/l, deren Poren mit Medium gefüllt sind.

Zunächst wurden günstige Erfahrungen mit Siran® Kugeln (Firma Schott, Mainz) gemacht. Solche Siran® Kugeln sind poröse Glasträger mit etwa 50% Porosität und einer Korngröße von 200-1500 µm, vorzugsweise von 400-700 µm. Die Glasträger können vor dem Einsatz im Verfahren mit einer verdünnten Gelatinelösung vorbehandelt werden. Die Siran®-Kugeln haben sich in Versuchen mit menschlichen oder tierischen Zellen immer wieder durch ihre hervorragenden Eigenschaften in bezug auf Haftung und Stabilität ausgezeichnet.

Eine weitere Variante welche ebenfalls bevorzugt im Rahmen von Untersuchungen mit Zellmaterial zur Anwendung kommt sind Kollagenmikroträger. Auch diese Träger sind in verschiedenen Größere und Ausführungen verfügbar. Kollagenmikroträger zeigen ähnlich gute Eigenschaften im Versuch, weisen im Vergleich zu den Glaskugeln eine besondere Eigenschaft auf; welche ihnen je nach Bedarf einen entscheidenden Vorteil verschaffen kann. Es kommt nämlich häufig bei der Anwendung von Partikeln mit angehafteten Komponenten vor, daß gewünscht wird; diese Komponenten am Ende der Reaktion zurückzugewinnen; mit dem Ziel eines erneuten Einsatzes oder einer anschließenden Weiterbearbeitung. Es kann sich dabei um chemische Moleküle wie z. B. Enzyme oder Antikörper handeln; häufig wird dieser Wunsch auch bei Versuchen welche mit Zellen durchgeführt werden, vorliegen, etwa wie wenn die Partikeln verwendet wurden, um eine Kultivierung von menschlichen oder tierischen Zellen zu bewerkstelligen. Bei solchen Kultivierungen stellen die angewachsenen Zellen den Zweck des Versuches dar und ist es somit unumgänglich sie von den Partikeln, wie z. B. den Siran®- Kugeln oder den Kollagenmikroträgern zu lösen. Gerade dann zeigt sich der Vorteil der letztgenannten Partikeln, weil man die Kollagenmikroträger einfach in einem eine Kollagenase enthaltenden System überführen kann, mit der Folge, daß die Träger sich auflösen und die Zellen welche von dem Enzym nicht angegriffen werden aus der Lösung isoliert werden können.

Es ist eine entscheidende Eigenschaft der vorliegenden Erfindung, daß die festen Partikeln nicht frei in dem flüssigen Medium schweben, wie es im Stand der Technik üblich ist, sondern von einem Behältnis umfaßt werden, welches sich in der Kammer im flüssigen Medium befindet. Dieses Umfassen ist so aufzufassen, daß in der Kammer ein separater Raum vorgesehen ist und die Partikeln lediglich innerhalb dieses Raums und überhaupt nicht außerhalb des Raumes festgestellt werden.

Das Behältnis kann jede denkbare Form annehmen und unterschiedlich ausgeführt sein. Gut denkbar ist ein Behältnis, das vollständig abschließbar ist und entweder im Medium treibt oder fast aufgestellt wird. Eine solche Lösung ist z. B. dann empfehlenswert, wenn es feste Partikeln betrifft, welche eine sehr geringe Dichte aufweisen oder untereinander eine sehr geringe Adhäsion zeigen. Bei einer solchen Konstellation wäre die Gefahr gegeben, daß die Wirkung der ebenfalls nach dem erfindungsgemäßen Verfahren vorgesehenen Rührvorrichtung eine solche Wirbeiung des flüssigen Mediums hervorruft; daß die festen Partikeln aufgeschwemmt werden und dadurch in der Kammer außerhalb des Behältnisses gelangen. Dies ist absolut unerwünscht, denn es ist gerade einer der Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens, daß das die festen Partikeln umfassende Behältnis als Merkmal des Verfahrens eine sehr einfache Handhabung dieses Verfahrens erlaubt. Es kann nach Belieben in die Kammer gebracht und wieder daraus entfernt werden, was eine optimale Steuerung des Verfahrens erlaubt. Am Ende des Verfahrens kann das Behältnis ganz aus der Kammer entfernt werden, wobei die von dem Behältnis umfaßten Partikeln sofort zur anderweitigen Anwendung zur Verfügung und hierdurch ein umständliches Abtrennungs- oder Isolierungsverfahren entfällt.

Im Gegenzug zu der gerade geschilderten Variante des Behältnisses, wobei dieses vollständig abschließbar ist, gibt es die andere Variante wobei dieses vollständige Abschließen nicht erfolgt. Bei vielen Reaktionen werden die festen Partikeln eine solche Dichte aufweisen oder untereinander eine solche Zusammenhang besitzen; daß das Abschließen entfallen kann, weil es praktisch nicht zu einem unerwünschten Aufschwemmen der Partikeln kommen kann. In solchen Fällen ist natürlich die Variante des nicht abschließbaren Behältnisses zu bevorzugen, weil es im allgemeinen eine einfachere und kostengünstigere Ausführung darstellen wird und vermutlich auch weniger Handlungen des Anwenders benötigt, weil naturgemäß das Abschließen und wieder Öffnen entfällt. Dabei gibt es bei den nicht abschließbaren Behältnissen noch die Möglichkeit; daß sie im Vergleich zu der Dimension der Kammer eine solche Konstruktion aufweisen; daß ihre Öffnung aus der Kammer hinausragt oder sich zumindest oberhalb der Oberfläche des flüssigen Mediums befindet sowie die alternative Möglichkeit, daß das Behältnis insgesamt in dem flüssigen Medium angeordnet ist und die Öffnung dem Behältnisses sich dementsprechend unterhalb der Oberfläche des flüssigen Mediums befindet.

Entscheidend für das Funktionieren des Behältnisses im Sinne der Erfindung ist die Tatsache, daß es durchlässig für das flüssige Medium ist. Dies bedeutet, daß das Behältnis eine solche Konstruktion aufweist; daß ein freier und ungestörter Austausch von Flüssigkeit innerhalb und außerhalb des Behältnisses möglich ist. Denkbar ist die Anwendung eines semipermeablen Membrans als vollständige oder partielle Hülle des Behältnisses, wobei hierdurch ein freier Austausch von Molekülen bis zu einer bestimmten Größe erfolgen kann. Ein solches semipermeables Membran kann vorteilhaft sein, wenn es sehr kleine und schwer handhabbare feste Partikeln betrifft. Üblicherweise wird jedoch nicht eine solche Ausführungsform benutzt, sondern eine solche, wobei das Behältnis Öffnungen aufweist; mit einer solchen Größe; daß sie für die festen Partikeln nicht passierbar sind. Theoretisch kann das Behältnis eine einzelne Öffnung aufweisen; üblicherweise werden es jedoch mehr sein, weil es für die meisten chemischen und biologischen Reaktionen erforderlich ist, daß die einzelnen Bestandteile der Reaktion untereinander in intensiven Kontakt treten können, und dieser intensive Kontakt mit lediglich einer Öffnung ungenügend zustandekommt. Es stellt ein bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens dar, eine Mehrzahl von einzelnen Öffnungen im Behältnis vorzusehen. Dies läßt sich z. B. sehr gut dadurch realisieren, daß man im Behältnis einen Sieb einbaut oder das Behältnis eine solche Konstruktion aufweist, daß es ganz oder teilweise aus einem Siebmaterial konstruiert ist. Es wird weiter unten einen weiteren Aspekt der Erfindung beschrieben werden; wobei ein bestimmtes Behältnis zur Verfügung gestellt wird, das sich aufgrund seiner einfachen und praktischen Konstruktion, optimal zur Anwendung im erfindungsgemäßen Verfahren eignet.

Es wurde bereits bei den einführenden Bemerkungen erwähnt, wie schädlich in vielen Systemen eine arbeitende Rührvorrichtung sein kann. Es ist offensichtlich, daß es geradezu eine der größten Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens darstellt, daß man sehr leicht eine räumliche Trennung der bewegenden Teile der Rührvorrichtung und der festen Partikeln erreichen kann. Die Rührvorrichtung, welche jede denkbare Ausführung aufweisen kann, bringt an irgendeiner Stelle in der Kammer das flüssige Medium in Bewegung. Ebenfalls in der Kammer befindet sich das Behältnis, welches die festen Partikeln umfaßt. Es ist völlig klar, daß die Rührvorrichtung dergestalt angeordnet ist, daß ihre bewegenden Teile lediglich mit dem flüssigen Medium außerhalb des Behältnisses in Berührung kommen können. Diese Ausrichtung verhindert somit vollständig die vorstehend geschilderten Nachteile, daß die Rührvorrichtung zu erheblichen Störungen im System führt und entweder zu Beschädigungen oder sogar Zerstörungen der festen Partikeln selbst oder zu Beeinträchtigungen der Haftung von Molekülen oder Zellen an den festen Partikeln führt. Zwar führt jedes Rührverfahren zu Bewegung und kann somit theoretisch zu einer Störung im System führen, aber es ist eine der großen Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens, daß mit einfachsten Rührvorrichtungen ohne besonderen Aufwand eine sehr schonende Durchführung einer Reaktion möglich ist.

Die Rührvorrichtung gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren kann wie vorstehend ausgeführt jede beliebige Form besitzen. Besonders bevorzugt wird jedoch eine Rührvorrichtung mit einem Magnetrührer, insbesondere dann, wenn gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform mit einer Gewebekulturplatte gearbeitet wird und noch mehr bevorzugt wenn in mehreren Vertiefungen (wells) der Gewebekulturplatte gleichzeitig eine Reaktion abläuft, was ja gerade eine der attraktiven Möglichkeiten des erfindungsgemäßen Verfahrens darstellt. Anwendung eines Magnetrührers mit entsprechender Benutzung einer Mehrzahl voll einzelnen Magnetrührstäben in jeder Vertiefung wo eine Reaktion abläuft ist sicherlich die einfachste und am wenigsten aufwendige Art das erfindungsgemäße Verfahren gemäß der besonders bevorzugten Ausführungsform mit einer Gewebekulturplatte durchzuführen. Dabei wird die Gewebekulturplatte auf einen Mehrstellen Magnetrührer positioniert, wodurch mit einem Magnetrührer sämtliche Magnetrührstäbe gleichzeitig angesteuert werden.

Es stellt eine weitere Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens dar, eine Temperierung vorzusehen, wenn es im Verfahren auf einer ganz bestimmten Temperatur, die nicht mit der Umgebungstemperatur oder mit der Temperatur im Brutschrank übereinstimmt, ankommt. Auch hat sich manchmal gezeigt, wenn gemäß der im vorherigen Paragraphen beschriebenen Ausführungsform mit einem Magnetrührer gearbeitet wird, daß die Durchführung der Reaktion mit einem solchen Magnetrührer zu einer unerwünschten lokalen Erhitzung führt. Diese Erhitzung macht sich natürlich dann am stärksten bemerkbar, wenn die Reaktion über längere Zeit abläuft. Längere Reaktionszeiten sind z. B. bei Reaktionen mit menschlichen oder tierischen Zellen; wie Kultivierungsversuchen mit solchen Zellen, keine Seltenheit. Eine Reaktionszeit von mehr als 24 Stunden ist dabei völlig normal. Da die Erhitzung zu Temperaturen im flüssigen Medium von über 50°C führen kann, war es unumgänglich eine Vorkehrung zur Kühlung vorzusehen, da speziell für die Durchführung biologischer Reaktionen eine Abweichung von der Optimumtemperatur sehr schnell zu einer Verschlechterung der Reaktionsabläufe führen und bei Durchführung von Reaktionen mit menschlichen oder tierischen Zellen sogar das Überleben dieses Zellmaterials gefährden kann. Es ist deswegen eine besonders bevorzugte Ausführungsform, bei der Durchführung des Verfahrens unter Anwendung eines Magnetrührers gleichzeitig eine Kühlung im Verfahren vorzusehen, wobei diese Kühlung praktisch am einfachsten abläuft, wenn zwischen Magnetrührer und Gewebekulturplatte eine Kühlvorrichtung angeordnet wird. Diese Kühlvorrichtung kann als ein ziemlich flaches Reservoir ausgebildet sein, welches dauerhaft mit Wasser von 36°C durchströmt wird. Bereits eine solche einfache Form reicht vollständig aus, eine Erhitzung des Reaktionsgemisches in der Kammer zu verhindern.

Es ist bei der Beschreibung des erfindungsgemäßen Verfahrens bereits mehrfach ausgeführt, daß es gemäß bevorzugten Ausführungsformen leicht möglich ist, verschiedene Reaktionsansätze parallel zu fahren. Sehr konkret ist diese Möglichkeit gegeben, wenn Gewebekulturplatten eingesetzt werden, da es bei dieser Anwendung von Vorteil ist, die Reaktion in einer Mehrzahl von einzelnen Vertiefungen ablaufen zu lassen, wobei es selbstverständlich grundsätzlich gleichgültig ist, ob mehrere identische Ansätze parallel ablaufen wie z. B. in Mehrfachversuchen oder wenn durch Variationen in der Reaktionsparameter in jeder Vertiefung eine ganz bestimmte Reaktion stattfindet. Es ist jedoch eine der entscheidenden Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens, daß das Verfahren in einem geringen Volumen durchgeführt werden kann. Dies ist immer dann von sehr großem Vorteil, wenn die Materialmengen nicht ausreichen würden, um größere Ansätze zu fahren. Auch bei geringen Mengen Ausgangsmaterial, z. B. wenn das Ausgangsmaterial aus einem Menschen oder einem Tier beschafft werden muß, bietet das erfindungsgemäße Verfahren die Möglichkeit, speziell wenn die bevorzugte Variante mit der Gewebekulturplatte mit geringvolumigen Vertiefungen benutzt wird, um eine größere Zahl an einzelnen Reaktionen parallel ablaufen zu lassen. Auch dies stellt eine der sehr attraktiven Aspekte des erfindungsgemäßen Verfahrens dar, da diese parallele Durchführung einer größeren Versuchsreihe ein Screeningprogramm in größerem Umfang erlaubt. Solche Screeningprogramme werden bei Untersuchungen in bezug auf menschliches oder tierisches Zellmaterial vielfach benötigt, in etwa in Zusammenhang mit der Frage, wie bestimmte Zelltypen kultivierbar sind. Solche Untersuchungen wo eine große Reihe von einzelnen Parametern variiert werden müssen, können nur durch umfangreiche Screeningprogramme in Angriff genommen werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist geradezu prädestiniert bei solchen Screeningprogrammen eingesetzt zu werden. Es ist somit ein weiterer Aspekt der Erfindung das erfindungsgemäße Verfahren im Rahmen der Durchführung von Screeeingprogrammen zu verwenden.

Der Einsatz des erfindungsgemaßen Verfahrens im Rahmen der Untersuchungen mit menschlichen oder tierischen Zellen ist nicht auf irgendwelche Zelltypen begrenzt. Grundsätzlich alle Zelltypen können zum Einsatz kommen. Es ist dabei von der Erfindung mit umfaßt, daß die Zellen selbst feste Partikel im Sinne des Hauptanspruchs sind und sich somit innerhalb des Behältnisses eine Zellkultur befindet. Ein solcher Einsatz kommt jedoch für viele Zelltypen gar nicht in Betracht, weil sie ohne einen Träger gar nicht überlebensfähig sind. Für solche Zellen werden Verfahren bevorzugt, welche eine Ansiedlung der untersuchten Zellen auf irgendwelche Träger vorsehen, wie z. B. auf die bereits vorher besprochenen Siran® Partikeln oder auf Kollagenmikroträger. Es ist bei solchen Trägern und bei anderen Typen von Trägern durchaus möglich, alleine die untersuchten Zellen selber auf die Träger zu bringen, da Zellen eine eigene haftende Fähigkeit besitzen. Es ist genauso gut möglich, für die Haftung Hilfsmittel wie z. B. Adhesionsmoleküle zu benutzt.

Es stellt eine weitere oft praktizierte Möglichkeit dar, Zellen nicht alleine, sondern in einer Kokultur mit einem weiteren Zelltyp oder mehreren weiteren Zelltypen auf Träger zu bringen. Eine solche Kombination von verschiedenen Zelltypen nennt man eine Kokultur. Eine Kokultur kann viele Vorteile aufweisen. Es ist erstens möglich, daß eine gleichzeitige oder vorher erfolgte Haftung mit bestimmten Zellen, dem eigentlich untersuchten Zelltyp eine bessere Grundlage für die Haftung bietet, mit der Folge, daß die Haftung der untersuchten Zellen in einer Kokultur günstiger abläuft, weil einfach eine bessere Grundlage vorliegt. Ein weiterer Aspekt kann die Tatsache sein, daß der weitere Zelltyp einen eigenen Einfluß auf die Reaktionsbedingungen ausübt, wobei ein solcher Einfluß sich ganz konkret als die Produktion und Ausscheidung in das flüssige Medium von Stoffen die beim Metabolismus oder Wachstum der untersuchten Zellen eine Rolle spielen, darstellen kann.

Die Möglichkeit, eine Kokultur verschiedener Zelltypen einzusetzen, wird im Rahmen der Erfindung z. B. dann benutzt, wenn es Untersuchungen in bezug auf menschliche Plasmazellen betrifft. Hier haben bereits frühere Untersuchungen gezeigt, daß eine Kokultur mit Stromazellen bzw. Fibroblasten von großem Vorteil ist, wobei die Bedeutung der Stromazellen für die Kultur der Stammzellen darin besteht, daß die mit den Stromazellen besiedelten Partikeln den Plasmazellen eine verbesserte mechanische Stabilität verschaffen und die Stromazellen außerdem vermutlich durch Produktion von Zytokinen zu einer Verbesserung der Funktionalität der Stammzellen beitragen. Es ist des weiteren grundsätzlich zu bedenken, daß auch in der natürlichen Situation im Körper die Zellen nicht völlig isoliert und unabhängig von anderen Zellen angetroffen werden, sondern immer in ständigem Kontakt und Austausch mit irgendwelchen anderen Zellen stehen. Eine Kokultivierung mit anderen Zellen stellt somit eine bessere Annäherung der natürlichen Lage dar und durch das hierbei entstehende Gebilde ist die Situation im Knochenmark besser mimikriert. Es ist somit auch ausdrücklich ein Aspekt der vorliegenden Erfindung die untersuchten Zellen zusammen mit anderen Zellen auf das Trägermaterial zu immobilisieren, insbesondere menschliche Stammzellen zusammen mit Stromazellen auf die festen Träger zu fixieren.

Es ist möglich, die Partikeln unvorbehandelt in das Behältnis zu bringen und die Manipulationen vollständig in dem Behältnis vorzunehmen. Es ist auf der anderen Seite ebenfalls möglich, bereits vorher eine Behandlung der Partikeln vorzunehmen und sie als behandelte Partikeln in das Behältnis zu bringen. Die letzte Vorgehensweise mag manchmal Vorteile aufweisen, sie hat jedoch immer den Nachteil; daß sie mit mehr Arbeit verbunden ist.

Es ist noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung, ein Behältnis zur Verfügung zu stellen, das besonders geeignet zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist. Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es eine Voraussetzung für die Benutzung des Behältnisses im erfindungsgemäßen Verfahren, das es für ein flüssiges Medium durchlässig ist, aber eine solche Ausgestaltung aufweist, daß die festen Partikeln im Behältnis dauerhaft von ihn erfaßt werden, d. h. es muß ausgeschlossen sein, daß die festen Partikeln aus dem Innenraum des Behältnisses ausgeschwemmt werden.

Ein solches bevorzugtes Behältnis besteht aus einem zylinderförmigen Grundkörper, welch der bevorzugt aus Edelstahl besteht. Dieser zylinderförmige Mantel weist zwei Öffnungen auf, eine auf der unteren Seite und eine auf der gegenüberliegenden oberen Seite, wobei die Bezeichnungen "untere" und "obere" Seite verwendet werden, weil das Behältnis stehend benutzt wird d. h. die zentrale Symmetrieachse des Zylinders befindet sich mehr oder weniger senkrecht relativ zu der Oberfläche des flüssigen Mediums in der Kammer. Die untere Seite des Behältnisses ist mit einem Sieb abgeschlossen. Die Größe der Poren in dem Sieb werden nach Bedarf gewählt, sie wird anhand der Größe der festen Partikeln welche von dem Behältnis umfaßt werden festgelegt. Der Sieb kann aus jedem beliebigen Material gefertigt werden, da der Mantel bevorzugt aus Edelstahl besteht, sieht eine ebenfalls bevorzugte Variante vor, daß der Sieb ebenfalls aus dem Material Edelstahl besteht. Es werden Hilfsmittel angeordnet, damit gewährleistet ist, daß unterhalb des Behältnisses ungestört einen Rührvorgang stattfinden kann. Solche Hilfsmittel können z. B. kleine Haken sein, welche an der Außenseite der Zylindermantel angebracht sind und auf dem äußeren Rand der Kammer ruhen. Bevorzugt wird jedoch eine Ausführung mit Standbeinen welche ebenfalls am äußeren Rand des Behältnisses befestigt sind und womit das Behältnis insgesamt auf dem Boden der Kammer positioniert wird. Diese Ausführungsform wird bevorzugt in allen Fällen wo die Kammer einen flachen Boden aufweist. Wenn der Boden jedoch nicht flach ist, sondern z. B. konkav, kann eine Ausführung des Behältnisses mit Standbeinen zu einer gewissen Instabilität führen und ist eine Ausführung des Behältnisses mit Haken zu bevorzugen. Die Zahl der Haken sowie der Standbeine kann beliebig gewählt werden. Da nicht nur die Stabilität aber auch der Kostpreis des Behältnisses ein Aspekt bei dieser Überlegung darstellt, wird es als Optimum beider Überlegungen angesehen, das Behältnis mit drei Haken oder Standbeinen zu versehen.

Auf die Dimension des Behältnisses relativ zu der Dimension der Kammer kommt es nicht genau an. Auch bei einer sehr schmalen Spalt zwischen Behältnis und Kammerwand wird das Verfahren funktionieren, genau wie bei einem Behältnis, das im Verhältnis zur Kammer relativ klein ist. Bevorzugt wird jedoch ein Bereich, welcher mit dem in der P 195 05 109.2 übereinstimmt, nämlich ein Verhältnis Schüttvolumen Festbettkörper:Gesamtvolumen flüssiges Medium von 0,1-0,6.

Beschreibung der Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen.

Fig. 1 stellt ein Behältnis zur Durchführung des Verfahrens in Oberansicht dar (leer).

Fig. 2 stellt ein Behältnis zur Durchführung des Verfahrens in Oberansicht dar (gefüllt).

Fig. 3 stellt in Querschnitt eine schematische Darstellung eines Behältnisses zur Durchführung des Verfahrens dar.

Fig. 4 stellt in Querschnitt eine schematische Darstellung eines Behältnisses zur Durchführung des Verfahrens dar.

Fig. 5 stellt das Ergebnis einer Versuchsreihe mit einer stromalen Zellinie dar.

In der Fig. 1 ist ein Behältnis in perspektivischer Oberansicht dargestellt. Das Behältnis weist einen zylindrischen Mantel 1 auf, welcher aus Edelstahl gebildet ist. Am unteren Ende des zylindrischen Mantels sind drei Standbeine 2 befestigt. In dem Behältnis ist ein Sieb 3 sichtbar welche auf Vorsprünge 4, welche an der Innenseite des zylindrischen Mantels angeordnet sind, ruht.

In der Fig. 2 ist das gleiche Behältnis wie in der Fig. 1 dargestellt. Hier befindet sich jedoch das Behältnis nicht mehr in leerem Zustand, sondern ist es mit kugelförmigen Partikeln 5 gefüllt.

In der Fig. 3 ist in Querdurchschnitt die Vertiefung 6 einer Gewebekulturplatte abgebildet.

Diese Vertiefung weist einen flachen Boden 7 auf. Die Kammer weist ein Behältnis 8 sowie ein Magnetrührstab 9 auf.

Das Behältnis 8 ist hier ebenfalls in Querdurchschnitt dargestellt. Sichtbar sind der zylindrische Mantel 1 und zwei Standbeine 2. In dem Behältnis sind die kugelförmigen Partikeln 5 sichtbar.

Während die Fig. 3 die Ruhelage im erfindungsgemäßen Verfahren darstellt, wird demgegenüber in der Fig. 4 angezeigt, welche Strömungsbewegung einsetzt, wenn das flüssige Medium (in der Figur nicht separat dargestellt) durch den Magnetrührstab 9 gerührt wird. Wie in der Fig. 4 dargestellt, befindet sich der Magnetrührstab 9 in der Mitte unter dem Behältnis. Durch die drehende Bewegung des Magnetrührstabes 9 wird das flüssige Medium von oben angezogen. Das bedeutet bei der vorliegenden Lage in der Kammer, daß das flüssige Medium aus dem mit festen Partikeln 5 gefüllte Festbett 10 nach unten gefördert wird, durch die Bewegung des Magnetrührstabs radial gefördert wird und an der Wand entlang in Richtung der Pfeile 11 und 12 aufwärts bewegt und durch den offenen Eingang des Behältnisses durch das Festbett 10 geführt wird.

Die in der Fig. 4 dargestellte Strömungsdynamik zeigt eine Reihe von Vorteilen. Es macht erstens deutlich, warum das in der Fig. 1 dargestellt Behältnis ohne Absperrung auf der oberen Seite auskommt. Eine solche Absperrung wäre selbstverständlich ohne weiteres möglich gewesen, z. B. als aufklappbare Sieb. Dies hätte allerdings zu mehr Aufwand bei der Herstellung der Behältnisse und dadurch zu einem höheren Kostpreis geführt und hätte auch das Arbeiten mit den Behältnissen um einige Handlungen erschwert. Bei dem Verfahren gemäß der Erfindung ist eine solche Absperrung überflüssig, weil die Strömung in der Kammer das Festbett in das Behältnis hinein drückt und ein Entweichen von einzelnen festen Partikeln 5 aus dem Behältnis praktisch nicht vorkommen wird. Auch eine relativ leichte niederwärts Bewegung des flüssigen Mediums wird völlig ausreichen, das Festbett intakt zu halten.

Die in der Fig. 4 dargestellte Strömung zeigt deutlich auf, daß eine Beladung der festen Partikeln, beispielsweise mit bestimmten Zellen, einfach dadurch vorgenommen werden kann, daß diese Zellen an einer willkürlichen Stelle in der Kammer zugesetzt werden. Die Strömung des flüssigen Mediums führt dann sofort dazu, daß die zugesetzten Zellen von oben ab durch das Festbett 10 geführt werden wobei die Gleichmäßigkeit des Flüssigkeitsstroms durch das Festbett eine homogene Verteilung garantiert. Natürlich gilt das gleiche analog für andere Komponenten der Reaktion, welche der Kammer zugesetzt werden. Die Strömung führt automatisch dazu, daß solche Komponenten dem Festbett rasch und gleichmäßig zugeführt werden. Es ist aber trotzdem zu beachten, daß eine Beladung der Partikeln bevorzugt durch direktes Auftragen auf die Schüttung vorgenommen wird.

Die Fig. 4 führt außerdem vor Augen, wie wenig belastend sich die Strömungsverhältnisse in der Kammer auf die festen Partikeln auswirken. Nicht nur ist ein direkter Kontakt mit dem Magnetrührstab ausgeschlossen, außerdem wird das flüssige Medium dem Festbett von oben gleichmäßig zugeführt und mit Regelmaß durch das Festbett gezogen.

Schließlich ist die Anwendung des erfindungsgemäßen Behältnisses auch deswegen von großem Vorteil, weil durch das durchströmte Festbett ein dreidimensionales Gebilde mit einer großen Oberfläche entsteht, das eine gewebeähnliche Zelldichte zeigt.

Beschreibung der Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen.

Beispiel 1

Für die Untersuchungen mit menschlichen hämatopoietischen Zellen war es vorgesehen, eine Kokultivierung mit stromalen Zellen vorzunehmen, weil bei einer solchen Kokultivierung Ansiedlung besser abläuft und die Überlebensrate der hämatopoietischen Zellen günstiger ist.

Für eine solche Kokultivierung war es wichtig, die Immobilisierungseigenschaften der einzelnen Zelltypen zu charakterisieren. Erst dadurch ist man in der Lage, gezielt Konzentrationen von Zeilen auf dem Trägermaterial einzustellen.

Für die Charakterisierung der Immobilisierungseigenschaften der murinen Stroma Zellinie M2-10B4 (Lemoine et al, Expl Hematol, 1988; 16: 718-726) wurden verschiedene Inokulumsdichten in parallelen Ansätzen verglichen.

Es wurde das in der Fig. 1 dargestellte Behältnis aus Edelstahl benutzt. Die Behältnisse wurden gemeinsam mit den dazugehörigen Magnetrührstäben und Pinzetten durch Autoklavieren sterilisiert. In eine sterile 12-Loch-Gewebekulturplatte (Corning Costar Corp., Cambridge) wurde in jede Vertiefung zunächst ein Magnetrührstab und ein steriles Behältnis eingesetzt und anschließend mit 3 ml Kulturmedium überschichtet. Als Kulturmedium wurde RPMI 1640 mit 10%igem Fötalen Kälberserum (jeweils Gibco BRL, Eggenstein) verwendet. In die Behältnisse wurde jeweils 1 ml steriler Träger pipettiert und das Behältnis anschließend vollständig mit Medium bedeckt. Die so präparierte Gewebekulturplatte wurde im Brutschrahk (36,5°C, 5% CO₂) auf einen 12-Stellen-Magnetrührer (Telesystem HP 12 p; H+P Labortechnik, Oberschließheim) gestellt und für 25 Stunden in einen Steriltest genommen.

Die Zellen wurden in Gewebekulturplatten vorkultiviert und zur Wachstumsarretierung mit 80 Gy bestrahlt. Nach dem Abzentrifugieren wurde die gewünschte Inokulumsmenge in 100 µl Kulturmedium aufgenommen und vorsichtig über die Träger geschichtet.

Für die Untersuchung der Immobilisierungseigenschaften der stromalen Zellinie wurden vier verschiedene Inokulumsdichten (5.10⁵, 1.10⁶, 5.10⁶ und 1.10⁷ Zellen/Ansatz) jeweils in einem Dreifachansatz untersucht. Nach 24 Stunden Kultivierung wurden die einzelnen Ansätze abgeerntet. Dazu wurden die Behältnisse mit einer sterilen Pinzette aus den Vertiefungen genommen und jeweils in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen (Greiner, Frickenhausen) überführt, in dem 5 ml PBS (phosphate buffered saline) vorgelegt waren. Nach einmaligem Waschen mit PBS wurde die Zahl der immobilisierten Zellen mittels einer Kernfärbung mit Kristallviolett (Merck, Darmstadt) bestimmt.

Die Ergebnisse der Versuchsreihe sind in der Fig. 5 dargestellt.

Die Fig. 5 belegt einen eindeutigen linearen Zusammenhang zwischen der Zahl der inokulierten und der Zahl der davon immobilisierten Zellen. Daraus folgt, daß im untersuchten Konzentrationsbereich eine konstante Immobilisierungsrate stromaler Zellen auf Kollagenträgern von etwa 45% angenommen werden kann. Das hohe Maß an Reproduzierbarkeit dieser Ergebnisse läßt sich aus den äußerst geringen Standardabweichungen der Dreifachansätze, die als Fehlerbalken zusätzlich in der Fig. 5 gezeigt sind, ablesen.

Beispiel 2

Es wurde einen weiteren Versuch zur Untersuchung der Möglichkeit der Kokultivierung hämatopoietischer Zellen durchgeführt. Bei diesem Versuch wurden im direkten Vergleich Mikroträger aus Borosilikatglas (Siran®, Schott Glaswerke, Mainz) und Kollagen (Cellex Bioscience Inc., USA) untersucht.

Das Kultivierungssystem wurde wie im Beispiel 1 beschrieben, bestückt. Die eine Hälfte der Behältnisse wurde mit Borosilikatträgern, die andere Hälfte mit Kollagenträgern gefüllt. Als Kulturmedium wurde IMDM verwendet, das 12,5% Pferdeserum (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim), 10 ng/ml IL-3 (Produziert durch ein Baculoexpressionssystem, Insektenzellinie Sf 9 und Virus AcNPV, mit rekombinantem humanem IL-3), 10 ng/ml G-CSF (Amgen, München) und 50 ng/ml murinen SCF (produziert durch E. coli SG 13009, Expressionsvektor pDS(0), exprimiert wird der extrazelluläre Anteil des murinen Kit Liganden) enthielt.

Nach einem Steriltest wurden die Träger in jeder Vertiefung mit 2.10⁶ wachstumsarretierten M2-10B4 Zellen (Stromale Zellinie) besiedelt. Die Bedingungen entsprachen den Angaben zu Beispiel 1.

Nach ein Immobilisierungszeit von 24 Stunden wurden in jede Vertiefung 2.10⁵ CD34+ hämatopoietische Zellen aus Nabelschnurvenenblut inokuliert und im Brutschrank bei 36,5°C und 5% CO₂ kultiviert. Es wurden am Tag 3, 5 und 7 nach Beginn der Kokultur jeweils zwei Einsätze mit Borosilikatträgern und zwei mit Kollagenträgern gemäß dem oben beschriebenen Verfahren abgeerntet. Am Tag 5 wurde zusätzlich ein halber Medienwechsel durchgeführt.

Dazu wurde über eine Spritze mit Kanüle (Braun, Melsungen) aus dem Spalt zwischen Behältnis und Wand der Vertiefung (Position 13 in der Fig. 3) Medium abgezogen und auf die gleiche Weise durch frisches Medium ersetzt.

Für die Analyse wurden im Falle der Borosilikatträger die Zellen mit Trypsin abgelöst.

Die Kollagenträger wurden dagegen enzymatisch aufgelöst. Dazu wurde weitgehend die gesamte Flüssigkeit über den Trägern abgezogen und 1 ml Kollagenase Lösung (2 mg/ml Kollagenase Typ 1A, C 9891, Sigma, Deisenhofen) zugesetzt. Nach einer Stunde bei 37°C waren die Träger lysiert und die enzymatische Reaktion wurde durch Zugabe von 5 ml PBS/FDTA-Lösung (0,5 mM) gestoppt. Die so suspendierten Zellen wurden abzentrifugiert und in 1 ml frischem Kulturmedium aufgenommen.

Eine Lebendzellzählung mit Trypanblau (Sigma, Deisenhofen) wurde in einer Neubauer-Zählkammer durchgeführt. Zur phänotypischen Charakterisierung der Zellen im Durchflußzytometer (FACScalibur, Becton Dickinson, Heidelberg) wurden diese mit PE-konjugierten Antikörpern gegen CD34 und FTTC konjugierten Antikörpern gegen CD45 (beide Dako, Hamburg) gefärbt. Die biologische Aktivität der hämatopoietischen Zellen wurde über den Methylzellulose Assay (MC) zur Detektion von Colony-Forming-Cells (Koloniebildender Zellen) und dem Long-term Culture Initiating Cell-Assay (LTC-IC) zur Analyse früherer Vorläuferzellen untersucht. Im MC-Assay wurden 500 CD34+-Zellen pro Platte eingesetzt und MethoCult™ (Cellsystems, St. Katharinen) mit 10 ng/ml IL-3 und 100 ng/ml SCF als Medium verwendet (Herstellerangaben siehe oben). Nach zwei Wochen Kultivierungsdauer wurde der Assay ausgewertet. Der LTC-IC wurde in einer 96-Loch- Gewebekulturplatte durchgeführt, wobei je Vertiefung 7.10³ M2-10B4 Zellen (mit 80 Gy bestrahlt) als feeder-layer eingesät wurden. In 10-fach Replikaten wurden 3, 6, 12, 24, 48 und 96 CD34+-Zellen je Vertiefung inokuliert und über einen Zeitraum von 6 Wochen einmal wöchentlich mit frischem Medium gefüttert (IMDM, 12,5% FCS, 12,5% HS, 10 ng/ml IL-3 und 10 ng/ml G-CSF, Herstellerangaben siehe oben). Nach der anschließenden Überschichtung der Zellen mit Methylzellulosemedium konnte der Assay nach zwei Wochen ausgewertet werden.

Beispiel 3

Die Wahl der Medienzusätze ist von entscheidender Bedeutung bei der Kultivierung hämatopoetischer Zellen.

Bei einer vergleichenden Untersuchung wurde der Einfluß einzelner Zytokine auf das Wachstum CD34+ hämatopoietischer Zellen in Kokultur untersucht. Hierzu wurde das Behältnis wie in Beispiel 1 beschrieben mit Kollagenträgern bestückt und die Sterilität geprüft. Bereits in dieser Phase der Untersuchung wurden in die verschiedenen Vertiefungen der Gewebekulturplatte unterschiedliche Medien eingesetzt. Grundsätzlich wurde als Medium IMDM verwendet, welches 12,5% Fötales Kälberserum (beides Gibco BRL, Eggenstein) und 12,5% Pferdeserum (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim) enthielt.

Als Zytokine wurden verwendet:

- 10 ng/ml IL-3,
- 100 ng/ml IL-6,
- 50 ng/ml SCF,
- 50 ng/ml GM-SCF und
- 100 ng/ml flt-3

(Lieferant sämtlicher Zytokine: Genzyme, Rüsselsheim).

In Doppelansätzen wurden jeweils vier dieser Zytokine dem Medium zugegeben. Ein Doppelansatz enthielt alle fünf Zytokine.

Nach einem Steriltest wurden die Träger jeder Vertiefung mit 2.10⁶ wachstumsarretierten M2-10B4 Zellen (Stromale Zellinie) besiedelt (wie in Beispiel 1 beschrieben). Nach einer Immobilisierungszeit von 24 Stunden wurden in jede Vertiefung 2.10⁵ CD34+ hämatopoietische Zellen aus Nabelschnurvenenblut inokulier und im Brutschrank bei 36,5°C und 5% CO₂ kultiviert. Nach 4 Tagen wurde ein halber Medienwechsel durchgeführt. Nach 7 Tagen wurden die Zellen abgeerntet. Eine Lebendzellzählung mit Trypanblau, eine phänotypische Charakterisierung der Zellen im Durchflußzytometer, sowie MC- und LTC-IC- Assays wurden durchgeführt (wie in Beispiel 2 beschrieben).

Claims

1. Verfahren zur Durchführung von chemischen oder biologischen Reaktionen in einer mit einer Rührvorrichtung ausgestatteten, ein flüssiges, feste Partikeln enthaltendes Medium aufweisenden Kammer, wobei die Reaktion an den festen Partikeln erfolgt, dadurch gekennzeichnet, daß diese festen Partikeln von einem für das flüssige Medium durchlässigen Rehältnis umfaßt werden.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kammer ein Volumen unter 20 ml aufweist.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Kammer die Vertiefung einer Gewebekulturplatte ist.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Partikeln Antikörperfunktionen besitzen.

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Partikeln Enzyme enthalten.

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Kultivierung Zellen menschlicher oder tierischer Herkunft, wobei die menschlichen oder tierischen Zellen den Partikeln angesiedelt sind.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen menschliche Stammzellen sind.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Partikeln Glasträger von 400 bis 700 µm oder Kollagenmikroträger sind.

9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß in sämtlichen Kammern der Gewebekulturplatte, z. B. 6 oder mehr, eine Untersuchung mit dem gleichen Zellmaterial abläuft.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Rührvorrichtung in jeder einzelnen Kammer ein Rührmagnetstab ist, welche von einem einzelnen Magnetrührer angetrieben wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die untersuchten Zellen zusammen mit weiteren Zellen auf das Trägermaterial immobilisiert werden.

12. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 6 bis 11 zur Etablierung eines Screeningverfahrens zur Untersuchung von Reaktionsbedingungen zur Kultivierung menschlicher oder tierischer Zellen, wie beispielsweise menschlicher Stammzellen.

13. Behältnis zur Aufnahme von festen Partikeln zur Anwendung in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Behältnis einen zylinderförmigen Mantel, einen Sieb womit die untere Seite des zylinderförmigen Mantels abgeschlossen ist und Hilfsmittel damit zwischen dem Boden der Kammer und der unteren Seite des Behältnisses ein freier Raum entsteht, umfaßt.

14. Behältnis gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Behältnis sowie der Sieb aus Edelstahl bestehen.

15. Behältnis gemäß einem der Ansprüche 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Hilfsmittel drei oder mehr am unteren äußeren Rand des Behältnisses befestigten Standbeine sind.