DE102005009065A1

DE102005009065A1 - Kryokonservierung von definierten Zellverbänden

Info

Publication number: DE102005009065A1
Application number: DE200510009065
Authority: DE
Inventors: Martin Dr. Schenk; Horst Dieter Prof. Dr. Becker
Original assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Current assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Priority date: 2005-02-22
Filing date: 2005-02-22
Publication date: 2006-08-24

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Konservierung von definierten Zellverbänden sowie eine Trägermatrix, die mit biologischen Zellen zu einem definierten Zellverband besiedelt ist.

Description

Derartige Verfahren sowie Trägermatrices sind im Stand der Technik allgemein bekannt.

Definierte Verbände von biologischen Zellen bilden die Grundlage für sog. bioartifizielle Gewebe bzw. Organe. Hierunter werden meist in vitro zusammengesetzte Hybride aus biologischen ggf, rekombinant modifizierte Zellen und künstlichen Strukturen, wie einer Trägermatrix, verstanden. Diese Hybride können an spezifischen Wirkorten im Patienten implantiert werden oder auch über einen externen Kreislauf mit dem Patienten verbunden werden und sollen bspw. in Form von Bioreaktoren Funktionen natürlicher und ggf. irreversibel geschädigter Organe, wie z.B. der Leber, übernehmen.

Um die sofortige Verfügbarkeit von bioartifiziellen Geweben oder Organen zu gewährleisten, werden derzeit die hierfür erforderlichen biologischen Zellen ständig in Kultur bzw. Suspension gehalten, ggf. bereits in den fertigen Bioreaktoren. Diese Maßnahme ist sehr kosten- und arbeitsaufwändig. So muss sichergestellt werden, dass die Zellkulturen regelmäßig mit Nährstoffen und Salzen etc. versorgt werden. Ferner muss steril gearbeitet werden, um Kontamination zu verhindern. Darüber hinaus verlieren diese kultivierten Zellen im Laufe der Zeit ihre Differenzierung und damit spezifische Funktion, bspw. als Leberzellen, und sind daraufhin für den Bioreaktor nicht mehr zu gebrauchen. Es müssen dann wieder neue Zellkulturen angelegt werden, so dass die vorstehend beschriebenen Probleme erneut auftreten.

Vor diesem Hintergrund besteht vermehrter Bedarf an einer Möglichkeit, definierte Zellverbände, die in Bioreaktoren eingesetzt werden können, so zu konservieren, dass vorstehend genannte Probleme vermieden werden. Insbesondere soll durch eine solche Konservierung die permanente Verfügbarkeit von biologi schen Zellen bzw. entsprechender Bioreaktoren sichergestellt werden, ohne dass entsprechende Zellen stets in Kultur oder Suspension gehalten werden müssen. Dies ist im Stand der Technik bislang nicht ausreichend gelöst.

Aus der WO 01/78504 A2 ist ein Verfahren zum Einfrieren von Zellen, die zu einem sog. Monolayer, d.h. einer einzelnen Zellschicht ausgebildet sind und sich auf dem Boden einer Mikrotitterplatte befinden, bekannt. Derartige Monolayer stellen allerdings keine definierten Zellverbände dar, die Aufgaben von Organen im Sinne eines Bioreaktors wahrnehmen könnten.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem definierte Zellverbände konserviert werden können, so dass die beschriebenen Probleme im Zusammenhang mit Zellkulturen bzw. Zellsuspensionen oder einzelnen Zellschichten vermieden werden.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Konservierung von definierten Zellverbänden gelöst, das folgende Schritte aufweist: (1) Bereitstellen einer zur Besiedlung mit biologischen Zellen geeigneten Trägermatrix, (2) Besiedeln der Trägermatrix mit biologischen Zellen, und (3) definiertes Einfrieren der besiedelten Trägermatrix entlang eines Temperaturgradienten.

Konservierung bedeutet in diesem Zusammenhang, dass die Zellverbände, wenn diese einmal vorliegen, ohne größere äußere Eingriffe durch den Menschen, d.h. bspw. ohne Behandlung mit Nährmedien oder Konservierungsstoffen, über längere Zeiten, vorzugsweise auch unbegrenzte Zeit, derart haltbar gemacht werden, dass diese im Wesentlichen jederzeit unmittelbar für deren Verwendung in einem Bioreaktor verfügbar sind.

Unter einem definierten Zellverband wird die Aggregation bzw. Zusammenlagerung von einzelnen biologischen Zellen zu Verbänden verstanden, so dass dieser Verband eine biologische Funktion, wie eine organspezifische Funktion, übernehmen kann. Ein solcher Zellverband liegt bspw. dann vor, wenn die einzelnen Zellen derart miteinander in Wechselwirkung treten können, bspw. direkten Kontakt zueinander haben, so dass ein Stoffaustausch zwischen den einzelnen Zellen stattfinden kann und der Zellverband Aufgaben eines Organes ausüben kann. Dazu ist die Ausbildung einer dreidimensionalen Anordnung der Zellen erforderlich, d.h. die Ausbildung mehrerer direkt miteinander in Verbindung stehender und übereinander angeordneter Zellschichten. Ein bevorzugter definierter Zellverband ist bspw. in der Publikation von Linti et al. (a.a.O.), Cultivation of porcine hepatocytes in polyurethane nonwovens as part of a biohybrid liver support system, The International Journal of Artificial Organs 25, Seiten 995 bis 1000, dort insbesondere in der 9 gezeigt und auf S. 999, linke Spalte, letzter Absatz und rechte Spalte erster Absatz im Detail beschrieben. Diese Ausführungen sind durch In-Bezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung. Von einem solch definierten Zellverband kann insbesondere nicht bei Zellkulturen, Zellsuspensionen oder Monolayern, wie in der WO 01/78504 A2 beschrieben, gesprochen werden.

Trägermatrices, die zur Besiedlung mit biologischen Zellen geeignet sind, sind im Stand der Technik, insbesondere in der Molekularbiologie, umfangreich bekannt. Geeignete Trägermatrices sind bspw. beschichtete oder modifizierte Oberflächen aus Kunststoff, Glas, Keramik oder Metall. Die Beschichtung kann durch ein Aufbringen von Kollagen oder anderen Matrixproteinen erfolgen.

Die Besiedelung von Trägermatrices mit biologischen Zellen ist im Stand der Technik umfangreich beschrieben und findet insbesondere im Zusammenhang mit dem sog. „tissue engineering" Anwendung.

Als biologische Zellen kommen sämtliche Zellen in Frage, die einen definierten Zellverband ausbilden können, bspw. Zellen eines bestimmten Organs wie der Leber, der Lunge, Niere, des Herzmuskels, der Haut, des Gefäßsystems, sowie die aus Vorläuferzellen differenzierten Korrespondate etc.

Unter definiertem Einfrieren entlang eines Temperaturgradienten wird ein Einfriervorgang verstanden, bei dem sowohl die Dauer des Einfrierens als auch die angelegte Temperatur kontrolliert und gesteuert wird, ohne dass sich ein innerer Temperaturgradient ausbildet. Insbesondere zeichnet sich erfindungsgemäß ein solch definiertes Einfrieren dadurch aus, dass die besiedelte Trägermatrix mehr oder weniger gleichmäßig abgekühlt wird, so dass pro Zeiteinheit eine mehr oder weniger gleiche Reduzierung der Temperatur erfolgt, die sog. Probenlinie eine glatte Linienführung aufweist. Dabei wird der Einfriervorgang so gesteuert, dass ein Gefrieren des Cytoplasmas bzw. des Zellwassers weitgehend vermieden wird und ferner eine Ausbildung von Eiskristallen außerhalb aber auch innerhalb der Zellen nicht stattfindet.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird hiermit vollkommen gelöst.

Die Erfinder haben überraschenderweise herausgefunden, dass sich ein wie vorstehend beschriebener Einfriervorgang, der bislang nur für Zellkulturen, sich in Suspension befindliche Einzelzellen oder Monolayer verwendet wurde, auch auf definierte Zellverbände im Sinne der Erfindung anwenden lässt; vgl. in diesem Zusammenhang Mazur, P. (1984), Freezing of living cells: mechanisms and implications, Am. J. Physiol. 247, Seiten 125 bis 142. Der Inhalt dieser Publikation ist durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Beschreibung.

Insbesondere ist bislang im Stand der Technik davon ausgegangen worden, dass definierte Zellverbände durch ein Einfrieren auf Grund eines Temperaturgradienten, der sich von außen hin zum Inneren des Gewebes bzw. des Zellverbandes ausbildet, massiv in ihrer Vitalität einbüßen und deshalb bspw. als Bestandteil von Bioreaktoren nicht mehr verwendet werden können. Wie die Erfinder jetzt allerdings überraschenderweise festgestellt haben, bleiben bei erfindungsgemäß konservierten Zellverbänden nach dem Auftauen letzterer die Vitalität und damit die spezifischen Zellfunktionen weitgehend erhalten.

Dank des erfindungsgemäßen Verfahrens wird nun vermieden, dass Zellkulturen oder Zellsuspensionen permanent zur Verfügung stehen müssen und regelmäßig erneuert werden müssen, um als Bestandteil eines Bioreaktors verwendet werden zu können. So kann nun eine tiefgefrorene, mit biologischen Zellen besiedelte Trägermatrix im Bedarfsfall lediglich aufgetaut, mit dieser ein entsprechender Bioreaktor zusammengesetzt werden, der dann unmittelbar einsatzbereit ist.

So kann bspw. einem Patienten, der im Leberversagenskoma auf der Intensivstation liegt, rasch geholfen werden. Dieser ist weder auf Lebertransplantate noch auf Leberzellkulturen angewiesen. Es werden vielmehr bspw. Vliese mit kryokonservierten Leberzellen, die aus Leberteilresektaten oder definiert differenzierten Stammzellen stammen, aus dem Lagertank, gefüllt mit flüssigem Stickstoff bei –196°C, entnommen und zu einem Reaktor zusammengesetzt. Dieser ist nach einem Auftauvorgang, bspw. von zwei Stunden, betriebsbereit und kann an eine kontinuierliche Plasmapherese über einen Standarddialysemonitor angeschlossen werden. Der Patient wird intermittierend behandelt, nach jeder Behandlung wird der Reaktor verworfen. Vor der Verwendung wird die eingefrorene Trägermatrix mit Medium gespült, um eine schnelle Erwärmung zu erzielen und um ferner eine ggf. vor dem Einfrieren zugegebene protektive Substanz wieder zu entfernen.

Nach einer bevorzugten Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird nach Schritt (2) Schritt (2a) durchgeführt, in dem die Trägermatrix unter Zugabe einer protektiven Substanz gespült wird.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass beim Einfrieren eine Kristallbildung verhindert wird, die zur Zerstörung der Zellen oder des Zellverbandes führen könnte. Geeignete protektive Substanzen sind im Stand der Technik umfangreich beschrieben; vgl. K.G. Brockbank (1995), Principles of Autologous, Allogenic and Cryopreserved Venous Transplantation, Chapter 10, Tabelle 10.1. Der Inhalt dieser Tabelle ist durch In-Bezugnahme Bestandteil der vorliegenden Erfindung. Als protektive Substanz wird vorzugsweise Dimethylsulfoxid (DMSO) verwendet.

Dabei ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn das Einbringen der besiedelten Trägermatrix in flüssigen Stickstoff erfolgt.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass mittels flüssigem Stickstoff, der eine Temperatur von etwa –196°C aufweist, ein definiertes Einfrieren entlang eines Temperaturgradienten besonders gut und schonend möglich ist. Darüber hinaus ist gewährleistet, dass ein ausreichend steiler Temperaturgradient erzeugt werden und die besiedelte Trägermatrix auf ausreichend tiefe Temperaturen abgekühlt werden kann. Ferner steht flüssiger Stickstoff in zellbiologischen Labors ausreichend und kostengünstig zur Verfügung.

Gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung erfolgt das erfindungsgemäße Verfahren derart, dass die Trägermatrix über einen Zeitraum von 0,1 bis 2 h, vorzugsweise von etwa 50 min, von einer Temperatur von 0 bis 45°C, vorzugsweise von 10°C, auf eine Temperatur von –40 bis –200°C, vorzugsweise –100°C gebracht wird.

Mit dieser Maßnahme wird eine glatte Linienführung der Probenlinie und damit ein besonders schonendes Einfrieren gewährleistet. Wie die Erfinder herausfinden konnten, zeigen die auf bzw. in der Trägermatrix angesiedelten biologischen Zellen bei einem derartigen Einfriervorgang eine besonders geringe Vitalitätseinbuße.

Ein derart definiertes Einfrieren ist mittels im Handel verfügbarer Einfriergeräte möglich, wie bspw. solcher der Firma SY-LAB Geräte GmbH, Tullnerbachstr. 61–65, 3011 Neupurkersdorf, Österreich.

Nach einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung weist die Trägermatrix Polyurethanvlies auf.

Polyurethan basierende Vliese haben sich in der Zellbiologie bzw. dem „tissue engineering" als besonders geeignete Trägermatrices erwiesen. Bei Polyurethan handelt es sich um ein chemisch inertes Material, bei dem mit wenig bzw. keinen Abbauprodukten zu rechnen ist. Derartige Vliese lassen sich leicht zu einer dreidimensionalen Struktur verarbeiten, weisen eine große Oberfläche und variable Porosität auf und sind sterilisierbar.

Nach einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens weist die Trägermatrix eine Oberfläche von 100 mm² bis 10.000 mm², vorzugsweise von ca. 1.250 mm², auf.

Wie die Erfinder herausgefunden haben, ist es bei einer solchen Oberfläche gewährleistet, dass der Zellverband ausreichend groß ist, um bspw. eine Organersatzfunktion auszuüben, und bspw. als bioartifizielle Leber verwendet werden kann, die Trägermatrix hingegen ausreichend klein ist, um schonend eingefroren zu werden. Wenn die angegebenen Grenzen deutlich überschritten werden, so besteht die Gefahr, dass beim Einfrieren ein zu großer Temperaturgradient entlang des Gewebes bzw. Zellverbandes entsteht, diese dadurch erheblich an Vitalität einbüßen. Wenn die Grenzen deutlich unterschritten werden, besteht hinge gen die Gefahr, dass eine organspezifische Funktion des Zellverbandes nicht mehr ausgeübt werden kann.

Die gegenwärtigen kombinierten technisch-biologischen Lösungen im Bereich der Leberersatztherapie zeichnen sich nämlich bspw. durch eine unhandliche Größe aus. Die Zellen können in den derzeitigen Reaktoren nicht konserviert bzw. tiefgefroren werden. Die Anbieter sind deshalb bislang darauf angewiesen, permanent besiedelte Reaktoren entweder lokal vorzuhalten oder im Bedarfsfall zu transportieren. Die Zellen lassen sich außerdem, wie oben erwähnt, nicht über längere Zeit im differenzierten Zustand halten. Einen Überblick über den derzeitigen Stand der Leberersatztherapie findet sich bspw. in Kjaergard et al. (2003), Artificial and bioartificial support systems for acute and acute-on-chronic liver failure: a systematic review, JAMA 289, Seiten 217 bis 222, und in Strain, A. J. und Neuberger, J.N. (2002), A bioartificial liver – state of the art, Science 295, Seiten 1005 bis 1009. Hier schafft die vorliegende Erfindung wirksam Abhilfe. Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens eingefrorene Hepatocytenzellverbände sind jederzeit verfügbar und können als Bestandteil eines Bioreaktors bzw. einer bioartifiziellen Leber verwendet werden.

Ferner ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn die Trägermatrix in etwa kreisförmig ausgebildet ist.

Diese Maßnahme hat den besonderen Vorteil, dass die Aufnahme einer kreisförmigen Trägermatrix in ein Gehäuse zum anschließenden Zusammenbau eines Bioreaktors besonders gut und einfach möglich ist. So lassen sich entsprechende Gehäuse bei einer derartigen Ausgestaltung der Trägermatrix mittels einer Dreh bank besonders einfach und zweckmäßig fertigen. Denkbar sind aber auch andere Ausgestaltungen der Trägermatrix, bspw. rechteckig, quadratisch, sechseckig, ovalförmig oder in jeder anderen denkbaren Form, wobei sich die jeweilige Ausgestaltung an den Abmessungen des etwaigen Gehäuses oder Bioreaktors zu orientieren hat.

Weiter ist es bevorzugt, wenn die Trägermatrix integrierte Kapillarmembranen aufweist.

Diese Maßnahme hat den besonderen Vorteil, dass über derartige Kapillarmembranen Luft bzw. Sauerstoff oder sonstige Gase an die Zellen gebracht werden können, somit die metabolische Aktivität bspw. von Hepatocyten gewährleistet ist und andererseits der Abtransport von Gasen, wie Kohlendioxid oder anderen Gasen, ausgehend von den biologischen Zellen gewährleistet ist. Die Herstellung derartiger Trägermatrices mit integrierten Kapillarmembranen ist im Stand der Technik umfangreich beschrieben. In diesem Zusammenhang wird auf die Publikation von Linti et al. (2002), Cultivation of porcine hepatocytes in polyurethane nonwovens as part of a biohybrid liver Support system, The International Journal of Artificial Organs 25, Seiten 995 bis 1000, dort insbesondere auf den Abschnitt "Materials and methods, nonwoven polyurethane matrices and bioreactor set-up", Seite 995 und 996, 1, verwiesen. Der Inhalt dieser Publikation ist durch Inbezugnahme Bestandteil der vorliegenden Anmeldung.

Erfindungsgemäß ist es weiter bevorzugt, wenn die Trägermatrix in einem Gehäuse vorgesehen ist.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die Trägermatrix dadurch besser handhabbar wird, es insbesondere gewährleistet ist, dass bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ein direkter Kontakt der Bedienperson mit den biologischen Zellen vermieden wird. Ferner lassen sich derartige Gehäuse leichter „in Reihe schalten" und so zu einem größeren bioartifiziellen Gewebe oder Organ zusammensetzen. Durch das Vorsehen eines Gehäuses werden darüber hinaus definierte modulare Einheiten gebildet, die je nach Bedarf, bspw. in einem weiteren Gehäuse, zusammengesetzt werden und dann den eigentlichen Bioreaktor bilden. Ein solches Gehäuse kann erfindungsgemäß aus jeglichem geeignetem Material bestehen, wie bspw. einem Kunststoff wie Polyurethanharz, bspw. Biresin U1305B und Biresin G55B, erhältlich bei Sica Chemie GmbH, Stuttgart, Deutschland.

Das Gehäuse weist vorzugsweise einen Einlass zum Einbringen eines flüssigen Mediums und einen Auslass zum Abführen des durch die besiedelte Trägermatrix hindurchgetretenen flüssigen Mediums auf.

Mit dieser Maßnahme wird ein Gewebemodul bereitgestellt, das einen einzelnen Baustein eines gesamten Systems, wie einem Bioreaktor, bilden kann. Ein solches System zeichnet sich durch seine Skalierbarkeit aus. Durch den Einsatz einer unterschiedlichen Anzahl von Modulen kann das System im Umfang an die zu ersetzende physiologische Funktion, bspw. Leberfunktion, angepasst werden. Durch diese Ausgestaltung lässt sich dann bspw. Plasma, das einem Patienten im Rahmen einer Dialyse entnommen wird, über den Einlass zu dem Zellverband durch die Trägermatrix hindurchführen. Die biologischen Zellen entfalten dann ihre metabolische Aktivität, übernehmen im Falle von Hepatocyten Leberfunktionen, bspw. Cytochrom P450-basierende Aktivitäten, wobei im Anschluss der Abtransport des derart behandelten „entgifteten" Plasmas über den Auslass des Gehäuses erfolgen kann.

In diesem Zusammenhang ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn das Gehäuse derart ausgebildet ist, dass dieses mit mehreren gleichen Gehäusen zu einer modular aufgebauten, funktionellen Einheit, vorzugsweise einer Dialyseeinheit, stapelbar ist.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass eine Vielzahl von durch das Gehäuse definierten Modulen gebildet wird, die derart übereinander gestapelt werden können, dass ein kontinuierlicher Plasmastrom vom Einlass über den definierten Zellverband und Auslass des ersten Gehäuses in den Einlass des sich daran anschließenden Gehäuses, von diesem wiederum zu dem sich daran anliegenden Gehäuse etc., möglich ist. Derartig stapelbare Gehäuse können dann bspw. in einem weiteren zylindrischen Gehäuse zum eigentlichen Bioreaktor zusammengesetzt werden.

Es ist weiter erfindungsgemäß bevorzugt, wenn das Gehäuse einen Einlass zum Einbringen eines gasförmigen Mediums und einen Auslass zum Abführen des durch die besiedelte Trägermatrix hindurchgetretenen gasförmigen Mediums aufweist.

Diese Ausgestaltung des Gehäuses hat den besonderen Vorteil, dass die konstruktiven Voraussetzungen für das Anlegen eines kontinuierlichen Gasstromes, bspw. für die Zufuhr von Sauerstoff, und die Abfuhr entsprechender Stoffwechselgase, wie Kohlendioxid, geschaffen werden.

Nach einer erfindungsgemäßen Weiterbildung handelt es sich bei den biologischen Zellen um ausdifferenzierte Zellen.

Unter ausdifferenzierten Zellen wird erfindungsgemäß verstanden, dass diese Zellen einen definierten Funktionszustand aufweisen, folglich auf Grund eines bestimmten genetischen Programms der Zellen eine Spezialisierung deren Eigenschaften stattgefunden hat. Dies hat den Vorteil, dass derartige Zellen in einem definierten Zellverband Funktionen von Organen ausüben können und deshalb als Bestandteil von Bioreaktoren besonders geeignet sind.

Nach einer erfindungsgemäßen Weiterbildung sind die biologischen Zellen Hepatocyten.

Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass sofort verfügbare Bausteine einer artifiziellen Leber in Form eines Bioreaktors bereitgestellt werden. So besteht gegenwärtig ein besonders hoher Bedarf an Leberersatzreaktoren. Bekanntermaßen gibt es nämlich eine weit größere Anzahl an Patienten, die auf eine Transplantatleber warten, als Spenderlebern. Die zum Ausgleich dieses Ungleichgewichts derzeit eingesetzten Vorrichtungen aus dem Bereich der Leberersatztherapie, wie die gegenwärtig verwendeten Bioreaktoren oder Abwandlungen der Dialysetechnik, sind allerdings nicht in der Lage, die Syntheseleistung der Leber auszubilden.

Die regulatorischen Eigenschaften der Leber, z.B. Kohlenhydrat- und Fettsäuremetabolismus, lassen sich durch starre technische Apparaturen, wie diese derzeit als Leberbioreaktoren verwendet werden, nicht zufriedenstellend ersetzen. Auch die Rolle der Leber im Rahmen der Immunantwort lässt sich mittels der derzeit verwendeten artifiziellen Leberreaktoren nicht ersetzen. Hier schafft die vorliegende Erfindung Abhilfe.

Vor diesem Hintergrund ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung auch eine Trägermatrix, die eine Besiedlung mit biologischen Zellen zu einem definierten Zellverband aufweist, wobei die Trägermatrix tiefgefroren bei einer Temperatur von –40°C bis –200°C, vorzugsweise –100°C, vorliegt. Die Trägermatrix weist vorzugsweise eine Oberfläche von 100 mm² bis 10.000 mm², weiter vorzugsweise von ca. 1.250 mm² auf. Dabei ist es bevorzugt, wenn die Trägermatrix Polyurethanvlies aufweist. Vorzugsweise ist die Trägermatrix in etwa kreisförmig ausgebildet und weist weiter vorzugsweise integrierte Kapillarmembranen auf.

Die Trägermatrix ist vorteilhafterweise in einem Gehäuse vorgesehen, das vorzugsweise einen Einlass zum Einbringen eines flüssigen Mediums und einen Auslass zum Abführen des durch die besiedelte Trägermatrix hindurchtretenden flüssigen Mediums aufweist, weiter weist dieses vorzugsweise einen Einlass zum Einbringen eines gasförmigen Mediums und einen Auslass zum Abführen des durch die besiedelte Trägermatrix hindurchgetretenen gasförmigen Mediums auf. Ferner ist das Gehäuse weiter vorzugsweise derart ausgebildet, dass es mit mehreren gleichen Gehäusen zu einer modular aufgebauten, funktionellen Einheit stapelbar ist. Die biologischen Zellen sind vorzugsweise ausdifferenzierte Zellen, weiter vorzugsweise Hepatocyten.

Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen erläutert, die rein illustrativ sind und den Rahmen der vorliegenden Erfindung keinesfalls einschränken, und aus denen sich weitere Vorteile und Eigenschaften der Erfindung ergeben.
Auf den beigefügten Figuren ist zu sehen:
1: Schematischer Aufbau eines Bioreaktors
2: Kinetik des definierten Einfrierens
Beispiel 1: Polyurethanträgermatrices
Die Herstellung der Vliese aus Polyurethan ist ausführlich in der Publikation von Linti et al. (a.a.O.) beschrieben.
Beispiel 2: Bioreaktoraufbau
In 1 ist ein Bioreaktormodul insgesamt mit 10 bezeichnet. Dieses besteht aus einem insgesamt zylindrisch ausgebildeten Gehäuse 12, das bspw. aus einem Zweikomponenten-Polyurethanharz (Biresin U1305B und Biresin G55B, Siga Chemie GmbH, Stuttgart, Deutschland) bestehen kann.
Das Gehäuse ist an seiner Oberseite mit einem Gehäusedeckel 14 versehen, der zusammen mit einem Verschlusseinsatz 16 das Bioreaktormodul 10 verschließt. Gehäusedeckel 14 und Verschluss einsatz 16 können aus dem gleichen Material ausgebildet sein wie das Gehäuse 12.
Im Inneren des Gehäuses 12 ist horizontal eine Trägermatrix 18 angeordnet, die bspw. aus Polyurethanvlies gebildet ist, und mit biologischen Zellen, wie Hapatocyten, zu einem definierten Zellverband besiedelt ist. Die Trägermatrix 18 weist integrierte Kapillaren 20 auf, die vorzugsweise horizontal von einer seitlichen Wand 12a des Gehäuses 12 horizontal durch die gesamte Trägermatrix 18 hin zur anderen seitlichen Wand 12b des Gehäuses 12 verlaufen.
Der Verschlusseinsatz 16 weist eine Einlassöffnung 22 zum Einlassen eines Mediums, wie bspw. dem zu dialysierenden Plasma, auf, wobei das Gehäuse 12 an seiner Unterseite eine Auslassöffnung 24 zum Abführen des bspw. entgifteten Plasmas aus dem Gehäuse 12 aufweist.
Das Bioreaktormodul 10 weist ferner an der seitlichen Wand 12a des Gehäuses 12 eine Einlassöffnung 26 zum Einbringen von Gasen wie Sauerstoff oder Luft in das Gehäuse 12 und die integrierten Kapillaren 20 auf, und an der seitlichen Wand 12b des Gehäuses 12 eine Auslassöffnung 22 zum Abführen von Gasen wie Sauerstoff oder Kohlendioxid auf.
Die Trägermatrix 18 lässt sich mit entsprechenden Trägermatrices 18 zu beliebiger Größe stapeln. In einem solchen Fall setzen sich die seitlichen Wände 12a und 12b des Gehäuses 12 verlängernd nach oben fort, so dass ein länglicher Zylinder gebildet wird. In einem solchen Zylinder lassen sich mehrere Trägermatrices 18 in beliebiger Anzahl übereinander stapeln. Bei Inbetriebnahme des Biorektormoduls 10 kommt es dann zu einem kontinuierlichen Strom, bspw. von Plasma oder sonstigem Medium hindurch durch die einzelnen Trägermatrices 18. Dabei kann die Trägermatrix 18 auf einer Seite mit einem bspw. Kunststoff ummantelten Metallgitter versehen sein, um letzterer eine zusätzliche Struktur und Abgrenzung zur daran angrenzenden Trägermatrix 18 zu verschaffen.
Beispiel 3: Hepatocytenpräparation und Hepatocytenkultivierung
Die Präparation und Kultivierung von Hepatocyten erfolgt wie in der Publikation von Linti et al. (a.a.O.) beschrieben.
Beispiel 4: Definiertes Einfrieren der besiedelten Trägermatrix bzw. des Bioreaktormoduls
Die Einlassöffnung 22 und Auslassöffnung 24 des Bioreaktormoduls 10 werden mit sterilisierbarer Folie, wie z.B, der OpSite-Folie (Smith and Nephew, Hull HU3 2BN, England) verschlossen. Das Bioreaktormodul 10 wird in ein Einfriergerät der Firma SYLAB eingebracht. Sofern mehrere Bioreaktormodule 10 eingefroren werden sollen, werden diese einzeln gelegt bzw. gestellt. Zur Überprüfung des Temperaturverlaufes wird in eines der Bioreaktormodule 10 eine Temperatursonde eingeführt. Dazu wird parallel zu den Kapillaren 20 eine Bohrung in die Trägermatrix 18 eingebracht, in welche dann die Temperatursonde eingeführt wird. Ein solch präpariertes Bioreaktormodul 10 wird nach Abschluss des Einfriervorganges verworfen.
Im Anschluss wird das Einfrierprogramm gestartet. Der Temperaturverlauf des Programmes (–––), in der Kammer des Einfrierge rätes (------) und in dem Bioreaktormodul 10 (----- Probe) sind in 2 dargestellt. Das Einfrierprogramm wird so gestaltet, dass in dem Bioreaktormodul innerhalb von 45 bis 50 Minuten eine gleichmäßige Abkühlung von ca. 10°C auf –100°C erfolgt. Dies entspricht einer Abkühlrate von 2 bis 2,5°C pro Minute; vgl. 2 (----). Der Einfrierprozess beginnt mit einer Ausgleichsphase von ca. 15–20 Minuten, während der sich das Bioreaktormodul 10 äquilibriert und von einer Temperatur von ca. 10°C auf ca. 0°C gebracht wird. Im Anschluss erfolgt eine kontinuierliche Abnahme auf die Endtemperatur von –100°C innerhalb der nächsten 30 bis 35 min.
Nach Beendigung des Einfrierprogrammes werden die Module entnommen und in Flüssigstickstoff gelagert. Die eingefrorenen Module werden üblicherweise in der Gasphase über dem Flüssigstickstoff bei einer Temperatur von < –165°C gelagert.
Beispiel 5: Funktionelle Tests nach Auftauen der zuvor eingefrorenen Trägermatrix
Die Erfinder haben definierte Zellverbände von Hepatocyten gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren eingefroren und durch Spülen mit Medium wieder aufgetaut. An diesen aufgetauten Hepatocyten wurden funktionelle Tests durchgeführt, wie diese bspw. in Linti et al. (a.a.O.), dort S. 997, rechte Spalte im Detail beschrieben sind. Kurz, es wurde die Cytochrom-P450-abhängige Synthese von Monoethylglycinxylidid (MEGX) sowie die Laktatdehydrogenase (LDH)-Leckage und die Glukose- und Albuminkonzentrationen gemessen. Ferner wurde die Ammoniak- und Sauerstoffkonzentration gemessen. Sämtliche Messungen wurden im Vergleich zu Messungen an solchen definierten Zellverbänden aus Hepatocyten durchgeführt, die nicht eingefroren waren (Kontrollmodule).
Mittels dieser Experimente konnten die Erfinder demonstrieren, dass die kryokonservierten Hepatocyten nach dem Auftauen mehr als 75 % der Aktivität der Kontrollzellen hatten. Das erfindungsgemäße Verfahren stellt deshalb ein besonders schonendes Konservierungsverfahren für definierte Zellverbände dar, bei dem lediglich sehr geringe Vitalitätseinbußen erfolgen. Die Erfinder stellen deshalb erstmals ein Verfahren bereit, mit dem Bioreaktoren oder allgemein definierte Zellverbände so konserviert werden können, dass diese nahezu unbegrenzt lagerbar sind und im Bedarfsfall unmittelbar zur Verfügung stehen.

Claims

Verfahren zur Konservierung von definierten Zellverbänden, das folgende Schritte aufweist: (1) Bereitstellen einer zur Besiedlung mit biologischen Zellen geeigneten Trägermatrix (18), (2) Besiedeln der Trägermatrix mit biologischen Zellen, und (3) Definiertes Einfrieren der besiedelten Trägermatrix (18) entlang eines Temperaturgradienten.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt (2) folgender Schritt (2a) durchgeführt wird: (2a) Spülen der Trägermatrix unter Zugabe einer protektiven Substanz.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Einfrieren durch Einbringen der besiedelten Trägermatrix (18) in flüssigen Stickstoff erfolgt.
Verfahren nach einer der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Einfrieren derart erfolgt, dass die Trägermatrix (18) über einem Zeitraum von 0,1 bis 2 h, vorzugsweise von etwa 50 min, von einer Temperatur von 0°C bis 45°C, vorzugsweise von 10°C, auf eine Temperatur von –40°C bis –200°C, vorzugsweise auf –100°C gebracht wird.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägermatrix (18) Polyurethanvlies aufweist.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägermatrix (18) eine Oberfläche von 100 mm² bis 10.000 mm², vorzugsweise von 1.250 mm², aufweist.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägermatrix (18) in etwa kreisförmig ausgebildet ist.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägermatrix (18) integrierte Kapillarmembranen (20) aufweist.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägermatrix (18) in einem Gehäuse (12, 14, 16) vorgesehen ist.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Gehäuse (12, 14, 16) einen Einlass (22) zum Einbringen eines flüssigen Mediums und einen Auslass (24) zum Abführen des durch die besiedelte Trägermatrix (18) hindurchgetretenen flüssigen Mediums aufweist.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Gehäuse (12, 14, 16) einen Einlass (26) zum Einbringen eines gasförmigen Mediums und einen Auslass (28) zum Abführen des durch die besiedelte Trägermatrix (18) hindurchgetretenen gasförmigen Mediums aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Gehäuse (12, 14, 16) zum Stapeln mit mehreren gleichen Gehäusen (12, 14, 16) zu einer modular aufgebauten funktionellen Einheit, vorzugsweise einer Dialyseeinheit, ausgebildet ist.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die biologischen Zellen ausdifferenzierte Zellen sind.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die biologischen Zellen Hepatocyten sind.
Trägermatrix (18), aufweisend eine Besiedelung mit biologischen Zellen zu einem definierten Zellverband, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägermatrix tiefgefroren bei einer Temperatur von –40°C bis –200°C, vorzugsweise bei –100°C, vorliegt.
Trägermatrix (18) nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass diese eine Oberfläche von 100 mm² bis 10.000 mm², vorzugsweise von 1.250 mm², aufweist.
Trägermatrix (18) nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass diese Polyurethanvlies aufweist.
Trägermatrix (18) nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass diese in etwa kreisförmig ausgebildet ist.
Trägermatrix (18) nach einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass diese integrierte Kapillarmembranen (20) aufweist.
Trägermatrix (18) nach einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass diese in einem Gehäuse (12, 14, 16) vorgesehen ist, das vorzugsweise einen Einlass (22) zum Einbringen eines flüssigen Mediums und einen Auslass (24) zum Abführen des durch die besiedelte Trägermatrix hindurchgetretenen flüssigen Mediums aufweist, weiter vorzugsweise einen Einlass (26) zum Einbringen eines gasförmigen Mediums und einen Auslass (28) zum Abführen des durch die besiedelte Trägermatrix (18) hindurchgetretenen gasförmigen Mediums aufweist, weiter vorzugsweise derart ausgebildet ist, dass es mit mehreren gleichen Gehäusen (12, 14, 16) zu einer modular aufgebauten funktionellen Einheit stapelbar ist.
Trägermatrix (18) nach einem der Ansprüche 15 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die biologischen Zellen ausdifferenzierte Zellen, vorzugsweise Hepatocyten, sind.