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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur homogenen
Verteilung einer zellhaltigen viskösen Suspension innerhalb eines
porösen Trägermaterials.
Damit ist die Besiedelung von Gerüststrukturen mit Zellen für das Tissue
engineering (= Züchtung
komplexer Gewebe) zur Erzeugung vitaler, biologischer Ersatzgewebe
möglich.
Das derart besiedelte Trägermaterial
eignet sich für
den sich nachfolgend anschließenden
Kultivierungsprozess, der die Aufrechterhaltung der Nährstoffversorgung und
Differenzierung beinhaltet. Weitere Anwendungsgebiete finden sich
dort, wo Suspensionen innerhalb poröser Trägermaterials verteilt werden
müssen.
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Zur
Züchtung
komplexer Gewebe im Rahmen des Tissue engineering ist der Einsatz
von lebenden Zellen Vorraussetzung. Für die meisten Gewebe, insbesondere
jedoch Binde- und
Stützgewebe wie
Knochen, Knorpel, Sehnen und Bänder,
sind Form und mechanische Festigkeit der Regenerate von größter Bedeutung.
Zur Gewährleistung
dieser Bedingungen greift man daher meist auf Trägermaterialien in Form von
Gerüststrukturen
zurück,
die auf Grund Ihrer Biokompatibilität und Biodegrabilität die Stütz- und
Formgebungsfunktion temporär
wahrnehmen, sowie die Anhaftung und Ausreifung der Zellen und Integration
der Implantate fördern.
Je nach Konfiguration der Gerüststrukturen
ist der initiale Prozess der Verteilung der zellulären Komponenten
auf dem Material problematisch. Dies gilt insbesondere für starre
Gerüste,
kann aber auch bei flexiblen Gerüsten
ein limitierender Faktor sein. Weitere Einflussfaktoren auf die
homogene Verteilung der Zellen finden sich in der Viskosität des Trägermediums,
in dem die Zellen aufgenommen werden, sowie in der Porosität und Geometrie
der Gerüststruktur
bzw. die Zusammensetzung des Trägermaterials.
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Als
Beispiel für
die vielfältigen
Möglichkeiten und
deren Bedeutung für
die moderne medizinische Versorgung sei auf den Einsatz von Implantaten
zur knöchernen
Regeneration des Unterkiefers verwiesen. Die Atrophie des Unterkieferalveolarkammes
ist ein häufiges
Krankheitsbild, das meist in Folge von Zahnverlust auftritt und
spezifische mechanische Anforderungen an die Implantate stellt.
Zum Einsatz kommen dabei hoch poröse mineralische Gerüststrukturen
mit Dimensionen von 1*1*3 bis 2*2*5 Zentimetern, die direkt auf
den Kieferknochen an- bzw. aufgelagert werden. Das Tissue engineering
von Implantaten, die mit adulten Stammzellen besiedelt sind, kann
dabei die volumenmäßig limitierte,
sowie risiko- und nebenwirkungsreiche Transplantation von Knochen
aus dem Beckenkammknochen ersetzen, die mit einen einwöchigen stationären Aufenthalt
und bis sechs Wochen Arbeitsunfähigkeit
verbunden sein kann. Somit kann bei Atrophie der Kiefer ein implantatgetragener
Zahnersatz, der aus demographischen und funktionellen Gründen immer
häufiger
wird, mit einer erheblichen Reduktion der Therapiekosten und -risiken
ermöglicht
werden.
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Eine
wesentliche Vorraussetzung für
die Anwendung von neuen Technologien im Tissue engineering besteht
in der einfachen Handhabbarkeit nach GMP-Standard, wie der zuverlässigen individualisierbaren
Funktion bei möglichst
einfacher Technologie und geringem apparativen Aufwand insbesondere
zur Gewährleistung
steriler Bedingungen.
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Die
initiale Verteilung von Zellen auf Trägermaterialien stellt einen
kritischen Prozess der Züchtung
komplexer Gewebe dar und wird auch als Besiedelungsprozess bezeichnet.
Man geht dabei von der Hypothese aus, dass die gleichmäßige Verteilung
der zellulären
Komponenten sowohl zur Versorgung der Zellen mit Nährstoffen
als auch für
die Interaktion der Zellen untereinander eine notwendige Bedingung darstellt
und Zellhaufen oder zellfreie Areal die Ausreifung der Gewebe behindern.
Dies steht in Analogie zum feingeweblichen Aufbau der Zielgeweben,
in denen sich meist eine nach funktionellen Gesichtspunkten orientierte
gleichmäßige Ausrichtung
von Zellen findet. Zur Gewährleistung
und Aufrecherhaltung der homogenen Verteilung der Zellen sind komplexe
Besiedlungs- und Kultivierungstechnologien entwickelt worden. Dabei
müssen
Methoden der Besiedlung und Kultivierung auf Grund Ihrer andersartigen
Zielsetzung unterschieden werden, auch wenn in technisch komplexen
Systemen, sogenannten Bioreaktoren, versucht wird diese beiden Schritte
zusammen zu führen.
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Alle
bekannten Lösungen
zur homogenen Verteilung von Zellen innerhalb eines porösen Trägermaterials
nutzen stets eine Flüssigkeit
als Trägermedium
zur Aufnahme und Verteilung der Zellen. Diese wird gemäß den spezifischen
Anforderungen der Zellen, der Gerüststruktur oder des Prozesses entweder
als visköse
Flüssigkeit,
zum Beispiel als aushärtendes
Hydrogel genutzt, um die Zellen durch die kontinuierliche Viskositätserhöhung im
Gel ortsansässig
zu halten und zudem eine Einbettung der Zellen in eine hydrophile
Matrix zu ermöglichen.
Oder man setzt eine nicht visköse
bis niedrig-visköse
Flüssigkeit
zum Beispiel ein Kulturmedium ein, so dass die Zellen vornehmlich über oder
durch das Material gespült
und auf diese Weise verteilt werden. Im letzteren Fall resultiert
im Idealfall eine Bedeckung der Oberfläche des Gerüstmateriales mit einem Zellrasen.
Schließlich
ist es auch prinzipiell möglich,
mit bereits vitalen also besiedelten Materialen eine Gerüststruktur
aufzubauen.
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Für die Verteilung
der Zellen sind die folgenden vier grundsätzlichen Lösungen bekannt.
- (1.) Aufnahme und Verteilung der Zellen durch eine meist visköse Suspension,
die auf Grund von Kapillarkräften
passiv oder durch Injektion bzw. Aufträufeln auf den porösen Festkörper auf-
beziehungsweise eingebracht wird.
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Bei
der alleinigen Nutzung von Kapillarkräften zur Verteilung von Zellen
werden meist hoch visköse
Suspensionsmedien eingesetzt. Dabei ist die Sedimentation ein wesentliches
technisches Problem, da die aktive Anhaftung von Zellen am Trägermaterial
ein langsamerer Prozess ist als das Absacken der Zellen gemäß der Gewichtskraft
in der Suspension. In dreidimensionalen Gewebekulturen kann eine
rasche und stabile Verteilung der Zellen innerhalb einer porösen Gerüststruktur
durch ein aushärtendes
Hydrogel erfolgen. Derartige Trägermedien können die
Nährstoffversorgung,
sowie Differenzierung der Zellen fördern. Vielerlei Gele sind
auf ihre Anwendbarkeit für
das Tissue engineering untersucht worden, wobei sich für die knöcherne Gewebezüchtung Kollagen-I-
und Fibrin-Gele
als besonders geeignet erwiesen haben, siehe Weinand, Pomerantseva
et al. 2006. Während
der niedrig viskösen
Aushärtephase
des Hydrogels kann das Zellpellet aufgenommen und innerhalb der
Flüssigkeit
suspendiert werden. Die Aushärtung
des Gels muss so eingestellt werden, dass es nach Verteilung im
Festkörper
idealer Weise so rasch fest wird, dass die Sedimentation verhindert
wird.
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Diese
Lösung
ist mit einer Reihe von Nachteilen verbunden. Die Nutzung passiver
Kapillarkräfte setzt
voraus, dass die Poren und Dimensionen des Trägermaterials und die Viskosität der Suspension aufeinander
abgestimmt sind. Daher kann die Porengrößen nicht an die spezifischen
Vorraussetzungen des Zielgewebes oder den Bedarf der Vaskularisation in
vivo angepasst werden, sondern muss auf die Bedingungen des Besiedlungsprozesses
abgestimmt sein. Dass dies möglich
ist, haben Weinand, Pomerantseva et al. 2006 gezeigt. Die passive
Verteilung einer zellhaltigen Suspension ist darüber hinaus ein langsamer Prozess,
so dass mit einer erheblichen Sedimentation zu rechnen ist. Dies
wird durch die verhältnismäßig schnellere
Verteilung zellarmer und damit leichterer Anteile der Suspension
noch verstärkt.
Nach eigenen Ergebnissen ist die Anwendung von Kapillarkräften für die Besiedlung
großer
Konstrukte ungeeignet. Zudem ist sie auf den klinischen Bedarf hinsichtlich
der Implantatform hin nur bedingt individualisierbar.
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Ähnlich problematisch
stellt sich die manuelle Injektion auf und in das Trägermaterial
dar. Neben dem Verbleib von Luftblasen, resultiert bei dieser Technik
eine nicht reproduzierbare ungleiche Verteilung der Zellen, wie
auch Janssen, Hofland et al. 2006 berichten. Maschinell gesteuerte
Injektionstechniken sind nicht bekannt, würden jedoch auch eine erhebliche
technische Herausforderungen darstellen und so dem Primat der leichten
Handhabbarkeit widersprechen.
- (2.) Aufnahme
und Verteilung der Zellen durch eine Suspension, die mittels Änderung
physikalischer Parameter, vornehmlich die Anwendung von Unter- oder Überdruck
und/oder Rotation, durch den porösen
Festkörper
bewegt wird.
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Hier
gibt es vielerlei technische Möglichkeiten,
die jedoch alle einen hohen technischen Aufwand zur Umsetzung der
Druckunterschiede und vor allem der freien Rotation zeigen. Technisch
komplexe Systeme sind für
Anwendungen im Tissue engineering auf Grund der Notwendigkeit der
einfachen Handhabung zur Sicherstellung steriler Arbeitsbedingungen
nur bedingt geeignet. Zudem ist auch die mehrfache Verwendung solcher
Systeme mit Zellen verschiedener Patienten auf Grund der Übertragung von
Infektionen oder Fremdzellen bzw. Fremdeiweißen problematisch. Weiterhin
besteht bei komplexen Prozessen oft das Problem der Individualisierung
je nach der Geometrie der verwendeten Gerüststrukturen, die in Abhängigkeit
der klinischen Notwendigkeiten variabel sein müssen. Auch ist zu bedenken, dass
Strömungen
und Drücke
für die
meisten Zellen unphysiologische Bedingungen darstellen, die vor
allem für „nackte” Zellen
aus Zellkulturen, die nicht in eine natürliche extrazelluläre Matrix
eingebunden sind, schädlich
bis tödlich
sein können.
Dennoch ermöglicht
die Anpassung solcher Systeme an die individuellen Bedingungen eine
ideale homogene Verteilung selbst der komplexesten Gerüststrukturen.
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Eine
einfache, häufig
angewandte Methode ist der sogenannte Spinner Flask. Dabei handelt
es sich um ein Zellkulturgefäß, in dem
die Gerüststrukturen,
die an einem Trägersystem
befestigt werden, in dem Gefäß um eine
zentrale Achse in Längsrichtung
rotieren. Komplexere Systeme erlauben eine Rotation in allen drei
Raumebenen. Unter-(Vakuumverfahren) und Überdruck erlauben darüber hinaus eine
rasche Verteilung im porösen
Festkörper
und können
darüber
hinaus in ein Rotationssystem eingebunden sein. Bei unzureichender
Abstimmung der Porengröße zur Suspension
kann sich jedoch ein Filter effekt ergeben, der zu einer ungleichmäßigen Verteilung
der Zellen führen
kann. Van Wachem, Stronck et al. 1990; Griffon, Sedighi et al. 2005;
Wang, Asou et al. 2006 beschreiben derartige Techniken, die auf Unterdruck
basieren und einen hohen technischen Aufwand bedingen.
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Aus
der Patentanmeldung
DE
199 62 456 A1 ist ein Beispiel für eine derartige Technik bekannt.
Die Verteilung der Zellen wird durch einen Filtereffekt erreicht,
in dem ein poröser
Festköper
durch einen passgenauen Zylinder bewegt wird. Die korpuskulären Bestandteile
der Lösung
werden dabei durch das Abpressen der Flüssigkeit in dem porösen Festkörper gefangen.
Dies setzt jedoch eine angepasste Größe der Poren für den Filtereffekt,
sowie eine Anpassung des Zylinders auf das Gerüstet oder umgekehrt voraus.
- (3.) Aufnahme und Verteilung der Zellen durch eine
vornehmlich nicht oder niedrig-visköse Suspension, die auf Grund
eines kontinuierlichen oder pulsatilen Strömungsflusses, sogenannte Perfusion über eine
längere
Zeit, durch einen Festkörper
transportiert wird und die Zellen dabei gleichmäßig verteilt.
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Lösungsansätze, die über einen
längeren Zeitraum
die zellulären
Komponenten der Gewebezüchtung über die
exakte Einstellung physikalischer Parameter, vornehmlich Perfusion,
in einem Gerüstsystem
verteilen, vereinen unweigerlich die Verteilungs- und Kultivierungs-
bzw. Züchtungsprozesse
in einem Schritt. Die Möglichkeit
der Kombination von Besiedlung und Kultivierung in einem System
ist in vielerlei Hinsicht vorteilhaft. Zum einen wird ein Übertragungsschritt
vermieden. Zum anderen können physikalische
Parameter nicht nur die Verteilung, sondern auch die Umverteilung
der Zellen gemäß ihren
Bedürfnissen
und sogar die Entwicklung der Zellen positiv beeinflussen. So ist
beispielsweise die Anwendung von Druck zur Entwicklung von Knorpelgewebe
förderlich.
Darüber
hinaus können
diese Bedingung kontrolliert eingestellt werden, da auf Grund des langsamen
Ablaufes viele Parameter der Verteilung und Entwicklung der Zellen
kontinuierlich gemessen werden können.
Solche Systeme werden auch als Bioreaktoren bezeichnet und müssen für verschiedene Zell-
und Gewebearten sowie Implantatkonfigurationen individuell entwickelt
werden. Die hohe technische Komplexität, einschließlich Messtechnik
und Sterilisierbarkeit, stellt somit neben der eingeschränkten Möglichkeit
der individuellen Konfiguration der Implantate den wesentlichen
Nachteil dieser Systeme dar. Zudem ist eine Umverteilung der Zellen in
der Regel nur mit niedrig-viskösen
Nährmedien möglich, so
dass primär
nur eine Besiedelung und Kultivierung der Oberflächen starrer Gerüstmaterialien
möglich
ist. Es resultiert daher in der Regel primär ein Zellrasen und somit eine zweidimensionale
Besiedlung der Oberflächen
in Analogie zur Monolayerkultur in Kulturflaschen.
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Für die Züchtung knöcherner
Gewebe erscheint der Einsatz von Perfusionskulturen von Vorteil.
So lassen sich durch gleichmäßige Strömung nicht
nur verschiedenartige Gerüststrukturen
mit Zellen besiedeln, siehe Alvarez-Barreto, Linehan et al. 2007,
sondern sogar die Zellen in ihrer knöchernen Differenzierung fördern Datta,
Pham et al. 2006.
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Aus
der Patentanmeldung
DE
100 53 014 A1 ist die Kultivierung von vitalem biologischem
Ersatzmaterial mittels pulsierender Strömungen und pulsierender Bewegung
der Gerüststruktur
vorzugsweise zur Züchtung
flächiger
Implantate für
kardiovaskuläre Strukturen
bekannt. Dabei werden die Druck- und Strömungsunterschiede eingesetzt,
um einen positiven Effekt auf die Ausreifung und Entwicklung der Zellen
in Richtung Zellwandbestandteile zu erreichen. Es werden dabei die
physiologischen Druck- und Pulsationseffekte im Blutkreislaufsystem
imitiert und sehr kontrolliert durch ein aufwendiges technisches
System reguliert.
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Vornehmlich
für die
Züchtung
von Knorpelgewebe wird in der
DE 103 49 484 A1 ein Verfahren beschrieben,
in dem auf ein Zellen-Matrix-System mittels Perfusion und einem
komplexen berührungsfreiem
mechanischem System pulsatile Drücke
ausgeübt
werden. Diese dienen ebenfalls primär der Förderung der Reifung und Entwicklung
des Konstrukts in Knorpelgewebe und weniger der Verteilung der Zellen.
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Die
vorgenannten geschützten
Lösungen nutzen
pulsatile physikalische Parameter wie Druck und Strömung zur
Stimulation der Ausreifung, Differenzierung und Ernährung spezifischer
Gewebe und nur in zweiter Linie zur Umverteilung und Besiedelung
von dünnen
Konstrukten. Zudem sind diese Parameter auf eine langfristige Einwirkung
ausgelegt und daher unmittelbar mit dem Besiedelungsprozess kombiniert.
- (4.) Schichtweise Besiedlung von Netzstrukturen oder
sehr dünnen
Gerüsten
wie Vliese oder Folien und anschließende Stapelung der Netze zu
einer größeren Gerüststruktur.
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Die
Zusammensetzung von größeren Gerüststrukturen
aus mehreren dünnen
flächigen
besiedelten Netzen, Vliesen oder Folien erfüllt zwar die Ansprüche bezüglich einer
homogenen Verteilung, erfordert jedoch hohe materialtechnische Ansprüche zur
Generierung stabiler mechanisch belastbarer Konstrukte und einen
sehr hohen technischen Aufwand zur reproduzierbaren Schichtung unter
sterilen Bedingungen. Vor allem die mechanischen Eigenschaften zur
Bindegeweberegeneration erfordern eine Vernetzung der einzelnen
Schichten, die weitere chemische Prozesse notwendig machen, die
sich jedoch negativ auf das Wohlbefinden der Zellen auswirken könnten. Zudem
besteht bei der Verlagerung der Schichten ein hohes Risiko für eine Verunreinigung.
Es ist darüber
hinaus zu bedenken, dass die Zellverteilung verfahrensbedingt ebenso
eine wenn auch homogene Schichtung erfährt. Zuletzt ist die Größe der resultierenden
Gerüststrukturen
durch die aufwendigen Schichtungsprozess als begrenzt anzusehen.
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Ein
derartiges Verfahren wird beispielsweise in der Patentanmeldung
DE 199 19 242 A1 vorgeschlagen.
Hier wird eine Methode zur Herstellung von wabigen Netzstrukturen
aus polymeren Substanzen erläutert,
die entweder durch Schichtung oder mittels Rotation (Vergleiche
2.) besiedelt werden.
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Neben
diesen grundsätzlichen
Lösungen sind
eine Vielzahl von Verfahren und zugehörigen Vorrichtungen bekannt,
die die Analyse und die Züchtung
von Zellen und Geweben unter Druckbelastung betreffen.
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So
sind aus der
DE
20 2005 049 905 A1 ein Verfahren und eine Vorrichtung zur
Herstellung eines Gelenkersatzes bekannt, bei welchen ein vorzugsweise
mit Zellen besiedeltes festes und poröses Trägermaterial und eine mit Zellen
vermischte flüssige Substanz
miteinander verbunden werden. Substanz und Trägermaterial werden zunächst in
einem Behälter übereinander
geschichtet und dann mit einem in Richtung des Trägermaterials
wirkenden Druck und/oder Unterdruck beaufschlagt. Vorausgesetzt wird
ein bereits mit einer niedrig viskösen beziehungsweise wässrigen
Lösung
gefülltes
und/oder bereits mit Zellen besiedeltes Trägermaterial, bei dem dann die
niedrig-visköse,
wässrige
Lösung
durch eine hoch-visköse,
vorzugsweise zellhaltige Suspension ersetzt wird, wodurch zwangsweise
Wasser über
eine wasserpermeable Membranen oder einen Filter entfernt werden
muss und die hoch-visköses Substanz
verfestigt wird. Es wird daher das Prinzip einer Filterung und Züchtung durch
zyklischen Druck beschrieben, bei der die Verfestigung einer flüssigen zellulären Substanz
und die Verbindung und Beschichtung des Trägermaterials, nicht aber die
homogene Verteilung von Zellen auf dem Trägermaterial angestrebt wird.
Durch die langfristige Druckeinwirkung verlangt die Filterung einen
hohen apparativen Aufwand einschließlich Sensorik.
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In
der
DE 101 04 008
A1 werden ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Züchten und
Behandeln von Zellen unter zyklischer Druckbelastung auf diese vornehmlich
für Knorpelgewebe
beschrieben. Die Druckbelastung wird hier zur Konditionierung der Zellen
eingesetzt. Vorausgesetzt wird dabei die homogene Verteilung der
Zellen bzw. die gleichmäßige Verteilung
der Zellen in einer Gerüststruktur
eines porösen
Trägermaterials.
Nicht angegeben ist, wie diese homogene Verteilung erreicht wird.
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Aus
der
DE 201 21 709
U1 ist ein Träger
für Parallelsynthesen
und Analysen bekannt, bei dem einzelne Kavitäten zumindest teilweise mit
einem porösen,
flüssigkeitsaufnehmenden
Trägermaterial
gefüllt
sind, der der Form der Kavitäten
angepasst ist. Das poröse
Trägermaterial
ist durch das analytische Verfahren, Eluierbarkeit beziehungsweise
die chemischen Anforderungen der zu untersuchenden Probe gekennzeichnet
und nicht durch die Eignung für
die Gewebezüchtung.
Für die
Synthese oder Analyse ist es unerheblich, ob das Trägermaterial
vollständig
gefüllt
ist oder Lufteinschlüsse
enthält.
Deren Beseitigung ist nicht vorgesehen.
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Das
in
US 2005/0132775
A1 beschriebene Verfahren und die Vorrichtung dienen zur
Verarbeitung von Proben durch Deformation eines sterilen Behälters. Dabei
soll Gewebe durch mechanische zyklische Belastungen unter sterilen
Bedingungen für analytische
Verfahren zerkleinert und fragmentiert werden. Es ist nicht erforderlich,
dass Gewebe zunächst
homogen zu verteilen.
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Die
zu lösende
Problemstellung besteht demzufolge in der verbesserten Verteilung
von Zellen in einem porösen
Trägermaterial
als notwendige Voraussetzung für
eine Anwendung von Zellen zur Erzeugung vitaler biologischer Ersatzgewebe
im Rahmen des Tissue engineering (=Gewebezüchtung). Dabei soll die gleichmäßige Verteilung
einer zellulären
Suspension in einem porösen
Trägermaterial
in einem technisch einfachen, schnellen und leicht auf andere Bedingungsgefüge (bezüglich Porosität, Viskosität der Suspension
oder Festkörpergeometrie,
individualisierbares Verfahren) übertragbaren
Verfahren erfolgen. Weiterhin wird eine Vorrichtung angegeben.
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Das
in den Patentansprüchen
beanspruchte Verfahren und die Vorrichtung ermöglichen auf technisch sehr
einfache Weise eine Verteilung von Zellen in einem porösen Trägermaterial
und machen sich dabei passive Kapillarkräfte und gegensinnige pulsatile
mechanische Belastungen zu Nutze. Dabei besteht das Wesen der Erfindung
darin, dass durch Deformation einer flexiblen mit dem Trägermaterial
beladenen Kammer in einem Formkörper
Druckunterschiede und daraus resultierende Strömungen durch das Träger material
erzeugt werden. Diese ermöglichen
sowohl eine Entlüftung
als auch eine homogene Verteilung der korpuskulären Bestandteile über ein sehr
einfaches und leicht steuerbares Verfahren. Das Verfahren bzw. die
Vorrichtung kann sowohl als Ausgangssituation für die weitere Kultivierung
oder zur direkten Implantation verwendet werden, wobei lediglich
eine kurzzeitige Einwirkung von Druck und Strömung zur Verteilung einer zellulären Suspension notwendig
ist.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
ist durch folgende Verfahrensschritte gekennzeichnet: Zur homogenen
Verteilung einer zellulären
Suspension in porösem
Trägermaterial
für die
Herstellung von vitalem biologischem Ersatzgewebe wird in einem
ersten Schritt das zur Besiedelung vorgesehene Trägermaterial
in die Kammer eines Formkörpers
eingebracht. Die Kammer ist hierbei so gestaltet, dass die Anpassung
der Spaltgröße zwischen
der Innenwand des Formkörpers
und der Oberfläche
des Trägermaterials
in Abhängigkeit
von der Viskosität
der einzubringenden Suspension und der Porösität des Trägermaterials variiert wird.
In einem zweiten Schritt wird die Suspension von unten nach oben
in die Kammer und/oder durch einen Kanal im Trägermaterial injiziert. Danach
wird der formstabile, aus einem elastischen Material bestehende
Formkörper
gegensinnig, pulsatil durch Krafteinwirkung auf die Längsseiten solange
komprimiert, bis die Suspension gleichmäßig in dem Trägermaterial
verteilt ist und das Sistieren aufsteigender Luftblasen eine vollständige Entlüftung anzeigt.
Schließlich
wird entweder bei aushärtender
Suspension das Trägermaterial
mit der Suspension entnommen, gegebenenfalls nach Auftrennen des
Formkörpers
bei empfindlichen Trägermaterialien.
Bei nicht aushärtender
Suspension wird nach Adhäsion
der Zellen an der Gerüststruktur
des Trägermaterials
dieses entnommen, um es weiter zu kultivieren oder direkt als vitales
biologisches Ersatzgewebe zu implantieren.
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Die
erfindungsgemäße Vorrichtung
besteht aus einem elastischen Formkörper, in dem eine Kammer zur
Aufnahme eines Trägermaterials
angeordnet ist. Idealerweise sollte es sich dabei um ein hoch elastisches,
bioinertes, preisgünstiges
Material handeln, so dass der Formkörper zu Einmalgebrauch beispielsweise
aus Silikon hergestellt werden kann. Die Elastizität des Materials
für den
Formkörper,
sowie der Abstand zwischen der Innenwand der sich im Formkörper ausbildenden
Kammer und der Gerüststruktur
des Trägermaterials,
sowie die Verteilung und Intensität der auf den Formkörper wirkenden Kräfte bestimmen
die Funktionsweise, da durch diese Faktoren die pulsatilen, gegensinnigen
Druckunterschiede im Formkörper
bewirkt werden.
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Durch
diese Eigenschaft unterscheidet sich die erfindungsgemäße Lösung von
den technisch hoch komplexen Bioreaktorlösungen, da diese auf Grund
der langen Einwirkung der mechanischen Effekte sehr fein justierbare
Technologien benötigen und
darüber
hinaus Vorrichtungen zur Kultivierung der Zellen enthalten müssen. Ein
besonderer Vorteil ist die sehr schnelle, in der Regel innerhalb
von wenigen Sekunden erfolgende Verteilung der Suspension im Trägermaterial,
wodurch Filter- und Sedimentationseffekten auf optimale Weise entgegengewirkt werden
kann. Dabei ist die Handhabbarkeit durch die leicht zu beobachtende
Verteilung der Suspension über
die nach oben offene Kammer gegebenenfalls auch durch einen transparenten
elastischen Formkörper
und der manuellen Kraftentfaltung, die durch den Spalt zwischen
dem Trägermaterial
und Kammerwand, sowie der Elastizität des Materiales einstellbar
ist, sehr einfach. Einen weiteren Vorteil stellen die Möglichkeiten
der Individualisierung sowohl hinsichtlich der Gerüststruktur
des Trägermaterials als
auch der Stärke
der pulsatilen Strömung
durch das Konstrukt mittels Variation des Randspaltes zwischen dem
Trägermaterial
und der Kammerwand dar. Es ist daher eine große Variation aus porösen Trägermaterial
und Hydrogel-Kombinationen anwendbar. Schließlich ist der geringe technische
Aufwand, der lediglich in der Herstellung des Modells und der anschließenden Abformung
im Gussverfahren besteht, ein entscheidender Vorteil für die Handhabbarkeit
in der Praxis, sowie die mögliche
industrielle Verwertung der erfindungsgemäßen Lösung. Die technische Einfachheit
der Lösung
fördert
darüber
hinaus die sterile Handhabung.
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Im
folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren
und die Vorrichtung in Ausführungsbeispielen
beschrieben. Die zugehörigen
Abbildungen zeigen in
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1:
Formkörper 1 mit
Kammer 2, sowie einem Trägermaterial 3 in Form
einer Gerüststruktur als
Blöckchen
aus porösem
Beta-TCP mit Kanüle 4.
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2:
Formkörper 1 mit
Beta-TCP-Blöckchen 3 in
der Kammer 2, sowie Kanüle 4 nach
Injektion der zellulären
Suspension.
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3:
Deformation des elastischen Formkörpers 1, der mit dem
Beta-TCP-Blöckchen 3 in
der Kammer 2 beladen ist.
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4:
Entfernung des Beta-TCP-Blöckchens 3 aus
der Kammer 2 des Formkörpers 1 nach Verteilung
der Suspension. Hier mit der Kanüle 4 als Hilfsmittel.
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Ausführungsbeispiel
1 (Verfahren)
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Das
Verfahren zur homogenen Verteilung einer zellulären Suspension in porösem Trägermaterial für die Herstellung
von vitalem biologischem Ersatzgewebe verwendet einen Formkörper mit
einer Kammer mit wenigstens einer Öffnung zur Aufnahme des Trägermaterials
an der Schmalseite. Zur Besiedelung wird das Trägermaterial in die Kammer eingebracht.
Danach wird die Suspension von unten nach oben in die Kammer injiziert.
Das kann auch durch einen Kanal im Trägermaterial erfolgen. Der formstabile,
aus einem elastischen Material bestehende Formkörper wird anschließend gegensinnig,
pulsatil durch Krafteinwirkung auf die Längsseiten solange komprimiert,
bis die Suspension gleichmäßig in dem
Trägermaterial
verteilt ist und das Sistieren aufsteigender Luftblasen eine vollständige Entlüftung anzeigt. Schließlich wird
entweder bei aushärtender
Suspension das Trägermaterial
mit der Suspension entnommen, gegebenenfalls nach Auftrennen des
Formkörpers
bei empfindlichen Trägermaterialien,
oder bei nicht aushärtender
Suspension nach Adhäsion
der Zellen an der Gerüststruktur
des Trägermaterials
dieses entnommen, um es weiter zu kultivieren oder direkt als vitales
biologisches Ersatzgewebe zu implantieren.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
ist sehr variabel gestaltbar.
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Zur
Erzeugung eines Modells der Gerüststruktur
des Trägermaterials
wird ein polier- und bearbeitbares Material verwendet, z. B. Polymetylacrylatkunststoff,
Wachs oder Metall. Das Modell muss je nach Viskosität der Suspension
und Porosität
des Trägermaterials
größer dimensioniert
werden. Die Dimensionierung ist entscheidend für die entstehenden Strömungsgeschwindigkeiten
durch das poröse
Trägermaterial
und damit für
die Homogenität der
Verteilung der zellulären
Komponente. Diese Parameter müssen
für jede
Materialkombination ermittelt werden. Dies kann im Vorfeld empirisch
an Festkörper-Suspensions-Kombinationen
mit verschieden dimensionierten Kammern im Formkörper erfolgen. Dabei ist die
Geometrie des Trägermaterials
nicht vorgegeben und kann daher nach den klinischen Erfordernissen
beispielsweise in einem CAD/CAM-Verfahren hergestellt werden. Jedoch
ist eine Parallelität der
Wände in
Längsrichtung
von Vorteil, da so die Gelmenge reduziert und somit die Zelldichte
pro Gelvolumen erhöht
werden kann.
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Zur
Erzeugung einer Kammer durch Abformung des Modells im Gussverfahren
mit einem sterilisierbaren, bioinerten, formstabilen und hochelastischen
Material werden vornehmlich Silikone verwendet. Die Form der Kammer
im Formkörper
kann nach belieben gestaltet werden. Eine zylindrische Form mit
einem variablen Durchmesser je nach Größe des Trägermaterials bietet sich jedoch
auf Grund der guten Handhabbarkeit und etablierten Form in der Zellkulturtechnik,
sowie der Möglichkeit
der Rotation bei Verschluss der Kammer des Formkörpers nach oben an. Dabei sollte
die Wandstärke
je nach Elastizität des
Abformmaterials eine Dicke haben, die zuverlässig eine spontane Deformation
des Formkörpers
vermeidet und gleichzeitig einen möglichst geringen Kraftaufwand
zur Deformation des Formkörpers
erfordert.
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Nach
Einbringen des Trägermaterials
in die Kammer des Formkörpers
wird die Suspension seitlich durch die Poren oder durch einen zentralen
Kanal von unten nach oben langsam in die Kammer injiziert. Es ist
auch möglich,
die Suspension vorzulegen und das poröse Trägermaterial gleich im Anschluss
in die Kammer einzuführen.
Anschließend wird
die Kammer gegensinnig, pulsatil je nach Viskosität der Suspension
schnell oder langsam komprimiert, bis sich die Suspension gleichmäßig verteilt hat
und das Sistieren aufsteigender Luftblasen eine vollständige Entlüftung anzeigt.
Es ist von Vorteil, wenn das Flüssigkeitsvolumen,
das das poröse
Trägermaterial
voll ausfüllt,
im Vorfeld berechnet oder empirisch ermittelt wird, so dass die
vollständige
Ausfüllung
des porösen
Trägermaterials
an Hand des Füllungsstandes
als zusätzliches
Merkmal kontrolliert werden kann. Dieser Prozess dauert wenige bis zu
30 Sekunden.
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Falls
die Suspension aushärtet,
kann das Trägermaterial
mit dem Gel entnommen werden, gegebenenfalls nach Auftrennen des
Formkörpers
bei empfindlichen Trägermaterialien,
und weiter kultiviert oder direkt als vitales biologisches Ersatzgewebe
implantiert werden. Falls die Suspension nicht aushärtet, muss
die Adhäsion
der Zellen an der Gerüststruktur
des Trägermaterials
abgewartet werden. Dazu kann die Kammer im Formkörper nach Verschluss der oberen Öffnung mit
einem konfektionierten Stopfen bei zylindrischer Form auf Rollen
rotiert werden, bis mit der Adhäsion
der Zellen zu rechnen ist. Anschließend kann das Trägermaterial
entnommen werden und weiter kultiviert oder im Patienten implantiert
werden.
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Ausführungsbeispiel
2 (Vorrichtung)
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Die
in 1 dargestellte Vorrichtung zur homogenen Verteilung
einer zellulären
Suspension in porösem
Trägermaterial 3 besteht
aus dem Formkörper 1 mit
der Kammer 2 zur Aufnahmen des zu besiedelnden Trägermaterials 3.
Als Hilfsmittel wird die Kanüle 4 eingesetzt.
Eine zylindrische äußere Form des
Formkörpers 1 erweist
sich aus Sicht der guten Handhabbarkeit als besonders günstig, da
diese Form dem gängigen
Erscheinungsbild eines Falcons entspricht und daher die Handhabung
im Labor einfacher ist. Die im Formkörper 1 zentrisch in
der Längsrichtung
angeordnete Kammer 2 zur Aufnahme des Trägermaterials 3 weist
dessen Form auf, etwa zur Besiedelung eines 1*1*3 cm großen porösen Beta-TCP-Blockes
(TCP – Tri-Calcium-Phosphat).
Orientiert an der Viskosität
der Suspension, der Porosität
und Größe der Gerüststruktur
des Trägermaterials 3,
der Dichte und Widerstandfähigkeit
der Zellen wurde umseitig eine Spalt von 1 mm Breite zwischen Trägermaterial 3 und
Innenwand des Formkörpers 1 gewählt. Das
Trägermaterial 3 besitzt
in diesem Fall einen zentralen Perfusionskanal, der zur Injektion
genutzt wird wie dargestellt in 2. Durch
manuelle Kompression von bis zu 30 Sekunden wird erreicht, dass
der Flüssigkeitsspiegel
unter Aufsteigen von Luftblasen aus dem Trägermaterial 3 mit
dem oberen Rand des Trägermaterials 3 abschließt, siehe 3.
Die Deformation des Formkörpers 1 und
damit der Kammerwände
wird manuell durchgeführt. Der
Einsatz an sich bekannter mechanisch wirkender Hilfsvorrichtungen
ist möglich.
Nach Ende der Verteilung der Suspension wird der Formkörper 1 zur
weiteren Aushärtung
der Suspension abgestellt. Zur Entnahme des sich aus dem Trägermaterial 3 gebildeten Konstruktes
wird entweder eine Pinzette verwendet oder der Formkörper 1 mit
einem Skalpell der Länge nach
aufgeschnitten. In 4 ist die Entnahme dargestellt.
Anschließend
wird das besiedelte Konstrukt nach Durchstechen des Perfusionskanales
in einem Perfusionsbioreaktorsystem zur osteogenen Differenzierung
der Zellen weiter kultiviert.
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Liste der aufgeführten Literaturstellen
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- Alvarez-Barreto, J. F., S. M. Linehan, et al. (2007). ”Flow perfusion
improves seeding of tissue engineering scaffolds with different
architectures.” Ann
Biomed Eng 35(3): 429–42.
- Datta, N., Q. P. Pham, et al. (2006). ”In vitro generated extracellular
matrix and fluid shear stress synergistically enhance 3D osteoblastic
differentiation.” Proc
Natl Acad Sci U S A 103(8): 2488–93.
- Griffon, D. J., M. R. Sedighi, et al. (2005). ”Evaluation of
vacuum and dynamic cell seeding of polyglycolic acid and chitosan
scaffolds for cartilage engineering.” Am J Vet Res 66(4): 599–605.
- Janssen, F. W., I. Hofland, et al. (2006). ”Online measurement of oxygen
consumption by goat bone marrow stromal cells in a combined cell-seeding
and proliferation perfusion bioreactor.” J Biomed Mater Res A 79(2):
338–48.
- van Wachem, P. B., J. W. Stronck, et al. (1990). ”Vacuum
cell seeding: a new method for the fast application of an evenly
distributed cell layer on porous vascular grafts.” Biomaterials
11(8): 602–6.
- Wang, J., Y. Asou, et al. (2006). ”Enhancement of tissue engineered
bone formation by a low pressure system improving cell seeding and
medium perfusion into a porous scaffold.” Biomaterials 27(13): 2738–46.
- Weinand, C., I. Pomerantseva, et al. (2006). ”Hydrogel-beta-TCP
scaffolds and stem cells for tissue engineering bone.” Bone 38(4):
555–63.