DE69535324T2

DE69535324T2 - Mediumdurchdringender Zellkulturträger und seine Verwendungen in eine Kulturmethode und einem Apparat

Info

Publication number: DE69535324T2
Application number: DE69535324T
Authority: DE
Inventors: Toshiaki Diamondforum-Enjoji 501 Takezawa; Katsutoshi Yoshizato
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1994-03-09
Filing date: 1995-03-09
Publication date: 2007-06-21
Anticipated expiration: 2015-03-10
Also published as: CA2144279C; EP0671469A2; US5736399A; EP0671469A3; JPH07298876A; CA2144279A1; EP0671469B1; DE69535324D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung, umfassend einen Medium-durchdringenden Zellkulturträger. Genauer gesagt, beinhaltet sie einen Kulturträger zur Züchtung von darauf befindlichen dreidimensionalen Verankerungs-abhängigen Zellen und ein Verfahren zur Züchtung der Zellen in einem Zustand, der sich näher bei dem Zustand befindet, in dem sie sich in einem lebenden Organismus befinden. Dies stellt eine sehr nützliche Kultureinrichtung als ein spezifisches Organmodell eines Tieres bei z.B. der Entwicklung von künstlichen Organen vom Hybridtyp und bei der Bewertung der Wirkungen und Toxizität eines neuen Medikaments als eine Alternative für Tierexperimente dar.
Herkömmlicherweise ist zur Entwicklung von verschiedenen medizinischen Technologien und Medikamenten eine Mannigfaltigkeit von Tierexperimenten und Zellzüchtungsexperimenten ausgeführt worden.
Jedoch liefern Tiere und gezüchtete Zellen verwendende Experimente kein vollständiges Modell für den ganzen Körper oder verschiedene Organe des Menschen, wobei jedes seine eigenen Probleme aufweist. Tierexperimente weisen z.B. den Vorteil ihres Vermögens auf, die Analyse einer systemischen Antwort auf die beabsichtigte Wirkung zu ermöglichen. Andererseits haben jedoch die spezifischen Unterschiede zwischen Mensch und Tieren die erhaltenen Ergebnisse nicht immer zufriedenstellend zuverlässig gemacht. Auch müssen zahlreiche Tiere geopfert werden. Zellkulturexperimente weisen andererseits den Vorteil auf, dass man die Wirkung, die betrachtet wird, direkt untersuchen kann, indem menschliche Zellen, selbst diejenigen des Patienten, gezüchtet werden. Bisher erfolgt eine gewöhnliche Zellkultur in der zweidimensionalen Ebene. Folglich unterscheiden sich die erhaltenen Ergebnisse nicht nur, was histologische Unterschiede sondern auch die Weise anbetrifft, in der Funktionen ausgedrückt werden, sehr von denjenigen mit den Organen, in denen viele Zellen dreidimensional aggregiert sind.
Aus diesen Gründen sind Versuche begonnen worden, die durchgeführt wurden, um die von Tiergeweben, einschließlich menschlichen Geweben, abgeleiteten Zellen dreidimensional zu züchten und gezüchtete Zellen zu verwenden, um Strukturen wie Organe des Organismus zu regenerieren. Bekannte dreidimensionale Kulturverfahren, die für diesen Zweck entworfen sind, sind ein Verfahren zur Einbettung von Zellen in Collagen-Gele und ihr dreidimensionales Züchten, und ein multizelluläres Sphäroid-bildendes Verfahren, wie vom Erfinder der vorliegenden Erfindung entwickelt, bei dem ein Kultursubstrat, das ein temperaturempfindliches Polymer enthält, verwendet wird.
Jedoch weisen das herkömmliche dreidimensionale Zellkulturverfahren, das Collagen-Gel-Kulturverfahren und das Sphäroid-bildende Verfahren die folgenden Nachteile auf. Während der dreidimensionale Strukturkörper von Kulturzellen größer wird, wird es schwierig, Nährstoffe zu den inneren Zellen zuzuführen. Gleichzeitig wird es für die Zellen unmöglich, Stoffwechselprodukte auszuscheiden, die sie absondern (nützliche physiologisch-aktive Substanzen und schädliche erschöpfte Substanz). Demgemäß nekrotisieren die Zellen in dem durch das herkömmliche Verfahren entwickelten dreidimensionalen Strukturkörper von Zellen im Laufe der längeren Kulturzeit.
Als ein Mittel diese Probleme zu lösen, hat der Erfinder der vorliegenden Erfindung schon einen Kulturträger, der im Wesentlichen einen Pflanzen-abgeleiteten Faser-Zweigkörper umfasst, und ein Verfahren zur Verwendung desselben, um Tierzellen zu züchten, vorgeschlagen. Genauer gesagt, macht dieser Träger Gebrauch von fibrösen Wurzeln, die von Pflanzensamen isoliert sind, die einer Keimungskultur unterzogen worden sind. Eine Verwendung dieses Trägers ermöglicht eine dreidimensionale Kultur von Zellen in einem Zustand, der sich näher bei dem Zustand befindet, der in einem lebenden Organismus vorherrscht.
Jedoch blieb ein Bedarf an Kulturträgern, die leichter herzustellen und zu handhaben sind und die eine überragende Leistungsfähigkeit als dreidimensionale Kulturträger anbieten. Prüfungen und Untersuchungen bei Kulturverfahren, die einen neuen Kulturträger verwenden, sind fortlaufend vom Erfinder dieser Erfindung unternommen worden.
Die vorliegende Erfindung ist im Lichte der obigen Umstände gemacht worden und weist das Ziel auf: Überwinden der Probleme des herkömmlichen Verfahrens und des dafür verwendeten Kultursubstrats, und Bereitstellen eines neuen Kulturträgers, bei dem sich Tierzellen dreidimensional vermehren können und bei einer hohen Überlebensrate eine Spontanaggregation zeigen, und eines neuen Verfahrens zur Züchtung von Zellen und eines dieses nutzenden Geräts dafür.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Vorrichtung für eine Zellkultur bereit, umfassend:

a) ein Kulturgefäß;
b) in dem Kulturgefäß verwendbar: einen Medium-durchdringenden Zellkulturträger für das dreidimensionale Kultivieren von Tierzellen, wobei der Zellkulturträger eine Mehrzahl von Seidenfäden oder einen Webkörper derselben umfasst und wobei der Webkörper entweder ein Netzkörper oder ein gazeartiger Körper ist; und
c) eine Einrichtung zur Zufuhr von Kulturmedien zu dem Kulturgefäß,

In den begleitenden Zeichnungen:
1 stellt eine perspektivische Darstellung dar, die ein Beispiel für das Kulturgerät gemäß der vorliegenden Erfindung wiedergibt.
2 stellt eine perspektivische Darstellung dar, die ein anderes Beispiel für das Kulturgerät gemäß der vorliegenden Erfindung wiedergibt.
3 stellt eine Phasenkontrastmikrofotografie dar und stellt den Zustand am 8ten Tag von Zellen dar, die durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung gezüchtet sind. 6,5 mm auf der Fotografie entsprechen 200 μm in einem Ist-Zustand.
4 stellt eine Phasenkontrastmikrofotografie dar und stellt den Zustand am 10ten Tag von Zellen dar, die durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung gezüchtet sind. 6,5 mm auf der Fotografie entsprechen 200 μm in einem Ist-Zustand.
5 stellt eine Phasenkontrastmikrofotografie dar und stellt den Zustand am 8ten Tag von Zellen dar, die als ein Vergleichsbeispiel in der vorliegenden Erfindung gezüchtet wurden. 6,5 mm auf der Fotografie entsprechen 200 μm in einem Ist-Zustand.
6 stellt eine Phasenkontrastmikrofotografie dar und stellt den Zustand am 10ten Tag von Zellen als ein Vergleichsbeispiel in der vorliegenden Erfindung dar. 6,5 mm auf der Fotografie entsprechen 200 μm in einem Ist-Zustand.
7 stellt eine Phasenkontrastmikrofotografie dar und stellt den Kulturzustand am 10ten Tag von Zellen als eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar. 16 mm auf der Fotografie entsprechen 200 μm in einem Ist-Zustand.
8 stellt eine Phasenkontrastmikrofotografie dar und stellt den 6-Stunden-Zustand von Gelen als ein Vergleichsbeispiel für die vorliegende Erfindung dar. 32 mm auf der Fotografie entsprechen 200 μm in einem Ist-Zustand.
9 stellt eine Phasenkontrastmikrofotografie dar und stellt den Zustand am 4ten Tag von Gelen als ein Vergleichsbeispiel der vorliegenden Erfindung dar. 32 mm auf der Fotografie entsprechen 200 μm in einem Ist-Zustand.
10 stellt eine Phasenkontrastmikrofotografie dar und stellt den Zustand in der 6ten Stunde von Gaze-Gelen als ein Vergleichsbeispiel für die vorliegende Erfindung dar. 32 mm auf der Fotografie entsprechen 200 μm in einem Ist-Zustand.
11 stellt eine Phasenkontrastmikrofotografie dar und stellt den Zustand am 10ten Tag von Gaze-Gelen als ein Vergleichsbeispiel der vorliegenden Erfindung dar. 16 mm auf der Fotografie entsprechen 200 μm in einem Ist-Zustand.
12 stellt eine Draufsicht dar, die einen anderen Gaze-Träger als eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt.
13 stellt eine Draufsicht dar, die den Zustand entsprechend 12 zeigt.
14 stellt eine perspektivische Darstellung dar, die ein sterilisiertes Verlängerungsrohr zeigt.
15 stellt eine perspektivische Darstellung dar, die den Zustand zeigt, in dem das Ende des Rohrs in 14 geschnitten ist.
16 stellt eine perspektivische Darstellung dar, die das Ende des Rohres zeigt, auf dem Gaze befestigt ist.
17 stellt eine perspektivische Darstellung dar, die den Zustand zeigt, in dem der Sackteil für das Ende des Rohrs geschnitten ist.
18 stellt eine perspektivische Darstellung dar, die den Zustand zeigt, in dem ein Verlängerungsrohr, dessen Endsackteil geschnitten worden ist, in die Kappe eines konischen Rohrs eingesetzt ist.
19 stellt eine perspektivische Darstellung dar, die den Zustand zeigt, in dem das Rohr, auf dem Gaze wie in 19 befestigt ist, eingesetzt und befestigt ist.
20 stellt eine perspektivische Darstellung dar, die den Zustand zeigt, in dem der Körper, der in 19 eingesetzt und befestigt ist, auf dem konischen Kappenkörper montiert ist.
21 stellt eine perspektivische Darstellung dar, die den Zustand zeigt, in dem eine Kunststoffpipette auf der Kappe des konischen Rohrs eingesetzt und befestigt ist.
22 stellt eine perspektivische Darstellung dar, die ein Zirkulationskulturgefäß veranschaulicht.
23 stellt eine Phasenkontrastmikrofotografie dar und stellt den Zustand dar, wo ermöglicht wird, dass sich Zellen in einem Multilayerzustand bis zum 10ten Tag vermehren. 16 mm auf der Fotografie entsprechen 500 μm in einem Ist-Zustand.
24 stellt eine Phasenkontrastmikrofotografie dar und stellt den Zustand einer Petrischale dar, nachdem ein Gaze-Träger entfernt ist. 16 mm auf der Fotografie entsprechen 500 μm in einem Ist-Zustand.
25 stellt eine Phasenkontrastmikrofotografie dar und stellt den Zustand der Adhäsion von Zellen an einem Gaze-Träger dar, nachdem ein Gaze-Träger entfernt ist. 16 mm auf der Fotografie entsprechen 500 μm in einem Ist-Zustand.
26 stellt eine perspektivische Darstellung dar, die einen Träger zum Zirkulieren von Kultur zeigt.
27 stellt eine perspektivische Darstellung dar, die den Zustand eines Zirkulierens von Kultur zeigt.
28 stellt eine Phasenkontrastmikrofotografie dar und stellt den Zustand dar, wo ein multizelluläres Aggregat gebildet ist. 16 mm auf der Fotografie entsprechen 500 μm in einem Ist-Zustand.
29 stellt eine Fotografie dar, die ein Sphäroid zum Vergleich zeigt. 19 mm auf der Fotografie entsprechen 500 μm in einem Ist-Zustand.
30 stellt eine vergrößerte Darstellung von 29 dar. 19 mm auf der Fotografie entsprechen 100 μm in einem Ist-Zustand.
31 stellt eine Fotografie dar, die ein Sphäroid in dieser Erfindung zeigt. 19 mm auf der Fotografie entsprechen 500 μm in einem Ist-Zustand.
32 stellt eine vergrößerte Darstellung von 31 dar. 19 mm auf der Fotografie entsprechen 100 μm in einem Ist-Zustand.
33 stellt eine Phasenkontrastmikrofotografie dar und stellt den Zustand von Gaze am 10ten Tag als ein Vergleichsbeispiel dar. 16 mm auf der Fotografie entsprechen 500 μm in einem Ist-Zustand.
34 stellt eine Phasenkontrastmikrofotografie dar und stellt den Zustand von Gaze dar, nachdem die Gaze von einer Petrischale entfernt ist. 16 mm auf der Fotografie entsprechen 500 μm in einem Ist-Zustand.
35 stellt eine Phasenkontrastmikrofotografie dar und stellt den Zustand einer Petrischale dar, nachdem die Gaze davon entfernt ist. 16 mm auf der Fotografie entsprechen 500 μm in einem Ist-Zustand.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Zellkulturträger umfasst eine Mehrzahl von Seidenfäden oder einen Webkörper derselben. Der Webkörper in diesem Fall kann entweder ein Netz oder eine Gaze sein.
Fäden mit einem Durchmesser von Werten bis zu Hunderten von μm im Durchmesser oder andere Typen von Fäden können zur Verwendung kombiniert werden. Mehrere Arten von Fäden oder der Webkörper derselben oder diejenigen von derselben Art, die aber im Fadendurchmesser, Größe der Maschenweite des Webkörpers oder einer anderen physischen Form und Eigenschaft unterschiedlich sind, können verwendet werden.
Diese müssen so ausgeführt sein, dass für die dreidimensionale Kultur von Zellen eine geeignete Raumgeometrie gebildet werden kann. Für den Netzkörper ist diese Geometrie schon gebildet worden. Eine Mehrzahl von Netzkörpern kann verwendet werden. Z.B. können Netzkörper mit einer Netzöffnung von 10 bis 1000 μm, insbesondere von 200 bis 400 μm, zur Verwendung in dieser Anwendung angemessen sein.
Die zur Durchdringung eines Mediums erforderliche Wasserabsorption ist für Naturfäden und die Webkörper derselben größer als für synthetische und deren Webkörper. Seide insbesondere absorbiert etwa 1,5-Mal so viel Wasser wie Baumwolle. Wenn diese Eigenschaften von Fadenmaterialien zusätzlich zu den zu handhabenden Zellen und den Kulturbedingungen dafür in Erwägung gezogen werden, ist es möglich, den richtigen Träger für diese beabsichtigte Verwendung zu konstruieren.
Es ist auch wirkungsvoll, diesen aus Netz und anderen Webkörpern hergestellten Kulturträger gemäß der vorliegenden Erfindung mit dem Vermögen zu versehen, in einem lebenden Organismus biologisch abbaubar zu sein. Diese Eigenschaft macht es möglich, Zellen in einem lebenden Organismus zu züchten, und ermöglicht, dass der Kulturträger durch den Organismus biologisch abbaubar ist und beseitigt wird. Dies macht diese Art von Kulturträger für medizinische Anwendungen sehr nützlich.
Der Kulturträger bietet die folgenden Vorteile. Ascorbinsäure wird zu einem Kulturmedium hinzugefügt, um die Proliferation von Zellen in einer Multilayer (dreidimensionalen)-Form zu beschleunigen. Oder es ist auch möglich, einen direkten Träger von Zellen zu verwenden, indem der Träger mit dem Vermögen versehen wird, Zellen darauf adhärieren zu lassen. In diesem Fall stellen extrazelluläre Matrix, Gelatine, Lektin, Mytilidae-abgeleitete adhäsive Proteine, Polylysin, adhäsives Oligopeptid und/oder Thrombospongin Einrichtungen bereit, um den Träger in die Lage zu versetzen, Zellen darauf adhärieren zu lassen. Als die extrazelluläre Matrix werden Collagen, Fibronectin, Hydronectin, Laminin, Proteoglycan, Glycosaminoglycan willkürlich verwendet.
Unter Verwendung dieser Träger ist es auch wirkungsvoll, zu ermöglichen, dass Zellen an Teilen auf einem Medium-durchdringenden Zellkulturträger örtlich adhäriert werden, die in die Lage versetzt worden sind, sie adhärieren zu lassen.
Weiter wird es gemäß der vorliegenden Erfindung, wenn zwei oder mehr Arten von Zellen gleichzeitig auf einem Medium-durchdringenden Zellkulturträger zur Kultur angesetzt werden, möglich, jede Zellspezies selbst selektiv an einem Teil adhärieren zu lassen, der mit dem richtigen Zelladhärierungsvermögen versehen ist.
Dieser Träger kann auch als ein indirekter Träger von Zellen verwendet werden, nämlich als ein extrazellulärer Matrixträger. In diesem Fall ist es möglich, Zellen in Gele einzubetten, die eine extrazelluläre Matrix enthalten, wie z.B. Collagen, Gel und Matrigel (Schutzmarke).
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Kulturverfahren macht es möglich, Verankerungs-abhängige Tierzellen zur Kultur anzusetzen, die in einem Kulturmedium in einem Kulturgefäß suspendiert sind, in dem der Kulturträger befestigt ist, wodurch bewirkt wird, dass die Zelle in einer Multilayer (dreidimensionalen)-Form adhäriert, sich ausbreitet und vermehrt.
Für Tierzellen kann eine beliebige Probe verwendet werden, die von dem Körpergewebe oder -organ von jeder Spezies einschließlich Mensch gesammelt ist. Diese Zellen können die Primären sein, die direkt von einem Gewebe oder einem Organ gesammelt sind, oder können diejenige sein, die nach Generationen einer Passage derselben erhalten werden. Außerdem können Tierzellen Mesenchym- und/oder Epithelnormalzellen sein, oder können Mesenchym- und/oder Epithelkrebszellen oder andere Krankheitsgewebezellen sein.
Man nehme als ein Beispiel eine Homo- und Heterozellkultur. Es ist veranschaulicht, Mesenchymzellen und/oder Haut-, Leber-, Krebs- und andere Epithelzellen zu züchten. Diese sind nicht die einzigen Zellen, die durch das Verfahren unter Verwendung der vorliegenden Erfindung gezüchtet werden können.
Die auf einem Kulturträger adhärierten Zellen breiten sich aus, migrieren und teilen sich entlang demselben auf, während sie sich in einer Multilayer(dreidimensionalen)-Form vermehren.
In dem bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Kulturverfahren wird über den Medium-durchdringenden Zellkulturträger ein Kulturmedium auf den Träger und die Kulturzellen um sie herum zugeführt. Selbst wenn die Anzahl von Zellen mit langandauernden Kulturzeiten anwächst, hat dies einige innere Zellen an einem Nekrotisieren gehindert. Es ist auch möglich, Zellstoffwechselprodukte (nützliche physiologisch aktive Agenzien und/oder schädliche Ausscheidungsstoffe) mit der Zeit nicht nur von diesen inneren Zellen sondern auch von der ganzen Zelle zu sammeln.
Aus dem Obigen ist die sichere Feststellung zu treffen, dass dieser Träger ähnliche Funktionen ausführen kann, wie Kapillaren in einem lebenden Gewebe.
Wenn es einen Kulturträger und ein Aggregat von Kulturzellen umfasst, kann das multizelluläre Aggregat als ein hervorragendes Modell eines lebenden Organs sowohl bei histologischen Unterschieden als auch beim Ausdruck von Funktionen dienen. Zusammen damit könnte dieses Aggregat auf die Entwicklung von künstlichen Organen, die Bewertung der Wirkung oder Toxizität eines neuen Medikaments angewandt werden, und weist einen zusätzlichen Vorteil auf, dass Stoffwechselprodukte mit der Zeit bei der Auswahl von Antikarzinogenen und der Bewertung des Metastasisvermögens von Krebsen gesammelt und gemessen werden können.
Es kann in Erwägung gezogen werden, dass dieses multizelluläre Aggregat, das einen Kulturträger (insbesondere ein Seidennetz) und ein Aggregat von Kulturzellen umfasst, als das Transplantat zur Behandlung von Wunden einschließlich Verbrennung und Wundliegen anwendbar ist. In diesem Fall, mit ihren nachgewiesenen Leistungen als Nahtmaterial, das in einem lebenden Organismus nicht biologisch abbaubar ist, gewährleistet Seide ihre Zuverlässigkeit, wenn sie in einem Organismus ver wendet wird.
Es gibt keine spezifische Begrenzung für die Struktur der Kulturvorrichtung, solange wie der Medium-durchdringende Zellkulturträger gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird. Bisher kann als die Einrichtung zur Zufuhr eines Kulturmediums eine Pipetten-ähnliche oder eine Tropfpipetten-ähnliche Einrichtung verwendet werden, die durch ein Traggestell vertikal getragen wird oder die ohne Verwendung von irgendeiner tragenden Einrichtung auf einem Kulturgefäß montiert ist. Alternativ kann die Einrichtung mit einer peristaltischen Pumpe ausgerüstet sein.
Ein einfacheres Laborgerät ist z.B. in 1 und 2 dargestellt.
Wie in 1 veranschaulicht, wird ein Medium-durchdringender Träger (1), ein Netzkörper, gemäß der vorliegenden Erfindung in ein Kulturgefäß (2) eingesetzt, wobei das Gefäß (2) mit einer Pipetteneinrichtung zur Zufuhr eines Kulturmediums (4) unter Verwendung eines Klebstoffs (3) adhäriert ist. Der Medium-durchdringende Träger (1) ist so konstruiert, dass ein Ende desselben in das offene Ende dieser Einrichtung zur Zufuhr eines Kulturmediums (4) eingesetzt ist, dass ein Fadenteil, der sich aufwärts (5) erstreckt, die Einrichtung hochzieht oder entspannt, wobei eine Einschnürwirkung des Trägers am Öffnungsende erzeugt wird, um die Menge an Medium zu steuern. Ein Kulturmedium (6) wird von der Einrichtung zur Zufuhr des Mediums zum Träger zugeführt.
Wie in 2 wird eine Einrichtung zur Zufuhr eines Mediums (4) durch einen Träger (7) zur Verfügung gestellt. Diese Einrichtung ist entfernbar gemacht, indem eine Teilung derselben (71) weggenommen wird.
Die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung ist nicht auf dieses vereinfachte Gerät beschränkt.
Nun wird unter Verwendung von Beispielen für diese Erfindung eine detailliertere und spezifischere Beschreibung gegeben, obwohl diese Erfindung nicht auf die folgenden Beispiele beschränkt ist.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
(Erzeugung eines dreidimensionalen Medium-durchdringenden Geräts zur Züchtung von Tierzellen)
Ein Stück der sterilisierten Gaze Typ III (K-Pine: hergestellt von Kawamoto Bandaging Materials Ltd.), aufgelistet in Japan Pharmacopoeia, wurde zu einer Größe von etwa 2,0 × 10,0 cm aseptisch zugeschnitten, dessen eine Seite der Längsenden etwa 1,0 cm aufwärts gerichtet wird; anschließend wurde auf dem mittigen Teil des aufwärts gerichteten Teils der Gaze ein ungefähr 30 cm langes sterilisiertes chirurgisches Seidennahtmaterial No. 4 (hergestellt von Murase Suture Manufacturing Co., Ltd.) aseptisch gebunden. Dann wurde das Nahtmaterial durch das Saugende einer sterilisierten Polypropylen-Pipette (Falcon #7575) eingesetzt, die an ihrem Festhalteende aseptisch in ein Rohr geschnitten wurde, und in das Festhalteende derselben hinaufgezogen. Dies bewirkte, dass die Gaze an einem dünnen röhrenförmigen Teil auf der Saugseite eingesetzt und teilweise daran befestigt wurde. 2 stellt die Konfiguration der Anfertigung dar. In dieser Figur wurde auf dem aus einer Acrylplatte hergestellten Traggestell, das durch eine 70%ige Ethanollösung sterilisiert war, der röhrenförmige Teil der Pipette senkrecht befestigt, so dass das Nahtmaterial zur oberen Seite und die Gaze zur unteren Seite angeordnet wurden; danach wurde, wenn ungefähr 5 ml von Zellkulturmedium* (modifiziertes Eagle's Medium von Dulbecco, das 10% fetales Rinderserum, 20 mM HEPES, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin enthielt) eingefüllt waren, das Kulturmedium zuerst durch die die Gaze bildenden Baumwollfäden absorbiert, über den ganzen Gazekörper verteilt, wobei es langsam durch die Gaze tropft, und schließlich mittels der Schwerkraft in mehreren Stunden vollständig herabtropfen gelassen. Nebenbei gesagt, die Menge des pro Stunde zugeführten Mediums ist einstellbar, indem die Stärke einer Einsetzung der Gaze in den absorbierenden Teil geändert wird (dies wurde bei 0,5 bis 5,0 ml/Stunde bestätigt).
Wie unten in einem Beispiel von spezifischen Anwendungen eines Tierzellen-Züchtungsverfahrens dargestellt, ist das Gerät konstruiert, um Tierzellen in einem dreidimensionalen Zustand überall in der Medium-durchdringende Gaze zu züchten.
BEISPIEL 2
(Verfahren zur dreidimensionalen Züchtung von Tierzellen auf einer Medium-durchdringenden Gaze)
Die Pipette, deren Festhalteende abgeschnitten ist, in die die Gaze, an der Nahtmaterial angebracht war, in den röhrenförmigen Teil eingesetzt und befestigt ist, wie in Beispiel 1 dargestellt, wurde auf der Innenwand einer hydrophoben Polystyrol-Petrischale (Laborschale: ⌀ 35 mm Falcon #1008) mit Siliconklebstoff vertikal montiert. Nach Abschneiden der Überschussmenge von Gaze an der Bodenoberfläche der Petrischale wurde die ganze Schale mit Ultraviolettstrahlen sterilisiert. Der Gazeteil auf der Bodenoberfläche der Petrischale (eine Größe von ungefähr 2,0 × 2,0 cm) wurde mit etwa 0,3 ml von 0,5%tiger Typ-I-Collagenlösung (CELLGEN I-PC. Hergestellt von KOKEN Co.) bedeckt und in der Luft aseptisch trocknen gelassen, wodurch bewirkt wurde, dass sich der Gazeteil ausdehnte, um auf der Bodenoberfläche der Petrischale fest adhäriert zu werden, und dass er gleichzeitig mit Zelladhäriervermögen versehen wird.
In der Petrischale, die wie oben angemerkt gefertigt worden ist, wurden in 2 ml eines Zellzüchtungsmediums* suspendierte menschliche dermale Fibroblaste mit einer Enddichte von 3,3 × 10⁵ Zellen/Petrischale zur Kultur angesetzt und bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO₂ und 95% Luft gezüchtet. Am ersten Tag einer Kultur wurde das Kulturmedium durch ein Zellkulturmedium ersetzt, das 0,1 mM L-Ascorbinsäurephosphat-Magnesiumsalz enthielt (hergestellt von WAKO Pure Chemical Industries Ltd.). Danach wurde das Kulturmedium alle zwei Tage durch ein frisches von derselben Zusammensetzung ausgewechselt, wobei man zuließ, dass sich die Zellen in einem Multilayerzustand auf dem Gazenetz vermehrten (siehe 3-Fotografie: Phasenkontrastmikrofotografie am 8ten Tag einer Kultur). Am zehnten Tag wurde gefunden, dass die Zellen in einem Multilayer auf dem Gazenetz vermehrt worden waren, wenn die Probe durch den Siliconbefestigungsteil, der mit einem chirurgischen Messer zerbrochen wurde, zusammen mit der Pipette physisch herausgenommen wurde (4-Fotografie: Phasenkontrastmikrofotografie bei einer Probe, die am 10ten Tag einer Kultur herausgenommen wurde). Der röhrenförmige Teil der Pipette wurde auf dem Acrylplattentraggestell vertikal befestigt, wie in Beispiel 1 angegeben, um die Multilayerzellen auf dem Gazenetz in gasförmiger Phase zu halten und das untere Ende der Gaze in das Zellkulturmedium im Innern der Petrischale eingetaucht zu halten.
Wenn das Kulturmedium in den röhrenförmigen Teil der Pipette eingefüllt war, wurde ein Kulturmedium mit einem Durchsatz von etwa 1,0 ml/Stunde zugeführt, wobei die Zellen dreidimensional vermehrt gelassen wurden.
Vergleichsbeispiel 1
In Beispiel 2 waren, selbst in dem Fall, wo das Kulturmedium* alle zwei Tage nach dem 1en Tag einer Kultur ersetzt wurde, wobei ein normaler Typ von Zellkulturmedium* verwendet wurde, das kein L-Ascorbinsäurephosphat-Magnesiumsalz enthielt, die Zellen nicht in einem Multilayerzustand auf einem Gazenetz vermehrt, sondern bildeten bloß einen zusammengewachsenen Monolayer auf dem Gazenetz (5-Fotografie: Phasenkontrastmikrofotografie am 8ten Tag einer Kultur). Am 10ten Tag einer Kultur wurde die Pipette durch den Siliconbefestigungsteil, der mit einem chirurgischen Messer zerbrochen wurde, physisch aus dem Körper herausgenommen, es wurde gefunden, dass fast keine der Zellen auf dem Gazenetz adhäriert war (6-Fotografie: Phasenkontrastmikrofotografie, nachdem die Probe am 10ten Tag einer Kultur herausgenommen wurde). Das Ergebnis zeigt deutlich, dass die Zugabe von Ascorbinsäure die Vermehrung der Zellen in einer Multilayer (dreidimensionalen)-Form auf dem Medium-durchdringenden Zellkulturträger bewirkt.
BEISPIEL 3
(Ein Verfahren zur dreidimensionalen Züchtung von Tierzellen in einem Collagen-Gel, das eine Medium-durchdringende Gaze enthält)
Eine Pipette, deren Festhalteende abgeschnitten war, in die die Gaze, die ein Nahtmaterial aufwies und in Beispiel 1 gefertigt war, eingesetzt war, wurde auf einem Acrylplattentraggestell an dem röhrenförmigen Teil befestigt. Der Teil der Gaze, der durch Zuführen eines Zellkulturmediums dazu im voraus benetzt war, wurde in eine Petrischale eingetaucht, in der, suspendiert in einem Zellkulturmedium*, das 2 ml von 0,24% Typ-I Collagen enthielt, menschliche dermale Fibroblaste in dieser Petrischale mit einer Enddichte von 3,3 × 10⁵ Zellen/Petrischale (⌀ 35 mm: Falcon #1008) zur Kultur angesetzt waren. Sie wurden bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO₂ und 95% Luft gezüchtet, und zusammen mit Zellen in ein Collagen-Gel eingebettet. Nach drei Stunden einer Kultur wurde das Collagen vollständig gelatinisiert und semitransparent. Eine Pinzette wurde verwendet, um die Petrischale vom Gel zu separieren, und es wurden 2 ml von Zellkulturmedium* hinzugefügt, wobei bewirkt wurde, dass das Gaze-enthaltende Gel in der Petrischale für eine fortdauernde Kultur schwimmt. Am 1en Tag einer Kultur und danach wurde, damit das Gaze-enthaltende Gel in gasförmiger Phase gehalten wurde und das untere Ende der Gaze in dem Zellkulturmedium* in der Petrischale eingetaucht war, der röhrenförmige Teil der Pipette auf dem Acrylplattentraggestell vertikal befestigt. Unter dieser Bedingung wurde das Kulturmedium in das Rohr der Pipette eingefüllt und dem Gel mit einem Durchfluss von 1,0 ml/Stunde zugeführt, wobei Zellen in einem dreidimensionalen Zustand in dem Gaze-enthaltenden Gel gehalten wurden. Nebenbei gesagt, das umgebende Gel, das keine Gaze enthielt, kontrahierte sich nach und nach, während der Gelteil, der die Medium-durchdringende Gaze enthielt, an einer physischen Kontraktion gehindert wurde. Selbst am 10ten Tag einer Kultur verteilten sich die Zellen in dem die Medium-durchdringende Gaze enthaltendem Gel gut in demselben. Eine günstige Zellmorphologie konnte mit einem Phasenkontrastmikros kop beobachtet werden (7: Fotografie: Phasenkontrastmikrofotografie am 10ten Tag einer Kultur).
Vergleichsbeispiel 2
In einer Petrischale wurden menschliche dermale Fibroblaste, die in einem Zellkulturmedium* suspendiert waren, das 0,24% Typ-I-Collagen enthielt, mit einer Enddichte von 3,3 × 10⁵ Zellen/Petrischale (⌀ 35 mm: Falcon #1008) zur Kultur angesetzt. Sie wurde bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO₂ und 95% Luft gezüchtet, wobei ermöglicht wurde, dass die Zellen in Collagen-Gel eingebettet wurden. Nach 3 Stunden einer Kultur wurde das Collagen vollständig gelatinisiert und semitransparent. Eine Pinzette wurde verwendet, um die Petrischale vom Gel zu separieren, und es wurden 2 ml von Zellkulturmedium* hinzugefügt, wobei bewirkt wurde, dass das Gaze-enthaltende Gel in der Petrischale für eine fortdauernde Kultur schwimmt. Danach wurde alle zwei Tage das Zellkulturmedium ausgewechselt, um zu ermöglichen, dass die Kultur fortdauert. Das Gel kontrahierte sich langsam. Am 10ten Tag einer Kultur wurde es scheibenförmig mit einem mittleren Durchmesser von ungefähr 7 mm. Nach sechs Stunden einer Kultur hatten sich die Zellen im Gel gut verteilt, wobei sich eine günstige Zellmorphologie zeigte (8: Phasenkontrastmikrofotografie in der sechsten Stunde einer Kultur), aber am 4ten Tag einer Kultur konnte aufgrund der Kontraktion des Gels keine günstige Zellmorphologie mit einem Phasenkontrastmikroskop beobachtet werden (9: Phasenkontrastmikrofotografie am 4ten Tag einer Kultur).
BEISPIEL 4
(Kultur unter Verwendung eines einzigen Stücks von Gaze)
Ein Stück von Gaze mit einer Größe von etwa 2 × 2 cm wurde zuvor mit einem Zellkulturmedium* benetzt. Es wurde dann in eine Petrischale eingetaucht, in der menschliche dermale Fibroblaste, die in 2 ml von Zellkulturmedium* suspendiert waren, das 0,24 Typ-I-Collagen enthielt, bei einer Enddichte von 3,3 × 10⁵ Zellen/Petrischale (⌀ 35 mm: Falcon #1008) zur Kultur angesetzt waren. Es wurde bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO₂ und 95% Luft gezüchtet und wurde zusammen mit den Zellen in Collagen-Gel eingebettet. Nach drei Stunden einer Kultur wurde das Collagen vollständig gelatinisiert und semitransparent. Eine Pinzette wurde verwendet, um die Petrischale vom Gel zu separieren, und es wurden 2 ml von Zellkulturmedium* hinzugefügt, was zur Folge hat, dass das Gaze-enthaltende Gel in der Petrischale für eine fortdauernde Kultur schwimmt. Danach wurde alle zwei Tage Zellkulturmedium* ausgewechselt, um die Kultur fortdauern zu lassen. Das umgebende Gel, das keine Gaze enthielt, kontrahierte langsam, während der Gelteil, der die Gaze enthielt, physisch an der Kontraktion gehindert wurde. Am 10ten Tag einer Kultur wurde er scheibenförmig mit einem mittleren Durchmesser von ungefähr 25 mm. Die Zellen in dem Gel, das die Gaze enthielt, hatten sich in der 6ten Stunde einer Kultur gut verteilt, wobei sie eine gute Zellmorphologie zeigten (10-Fotografie: Phasenkontrastmikrofotografie in der 6ten Stunde einer Kultur). Selbst am zehnten Tag einer Kultur wurde gefunden, dass die Zellen im Gel, das die Medium-durchdringende Gaze enthielt, sich darin ausbreiteten, und eine gute Zellstruktur konnte mit einem Phasenkontrastmikroskop beobachtet werden (11-Fotografie: Phasenkontrastmikrofotografie am 10ten Tag einer Kultur).
BEISPIEL 5
(Dreidimensionales Kulturgerät)
Zusätzlich wurde sterilisierte Gaze Typ-III, aufgelistet in Japan Pharmacopoeia (K-Pine; hergestellt von Kawamoto Bandaging Materials Co., Ltd.) aseptisch zu einer kreisförmigen Form, wie in 12 dargestellt, mit einem Durchmesser von 5,0 cm und mit einem vorspringenden Teil, der zur Befestigung konstruiert war, zugeschnitten (13). Der vorspringende Teil der Gaze, die wie oben angezeigt geschnitten war, wurde in einem sterilisierten Verlängerungrohr (Serfield SF-ET 5527, mit einer Länge von 7,5 cm und einem Inhalt von 5,5 ml, hergestellt von Telmo Co., Ltd. 14) eingesetzt und befestigt. Der Sackteil des Endes desselben wurde aseptisch geschnitten ( 15). Wenn 3 bis 10 mm übrig waren, wurde das Rohr dann asep tisch geschnitten, wobei das Ende eines Gazebefestigungsrohrs gefertigt wurde (16). In der Kappe eines sterilisierten konischen Rohrs (Falcon #2070) mit einem Volumen von 50 ml wurde ein kreisförmiges Loch mit einem Durchmesser von ungefähr 7 mm gebohrt, in welches Loch (18) das sterilisierte Verlängerungsrohr mit dem Endsackteil aseptisch (17) eingesetzt und befestigt wurde. Weiter wurde auf diesem Ende das Rohr am Ende des Gazebefestigungsrohrs eingesetzt und befestigt (19). Danach wurde der konische Rohrkörper montiert ( 20). Dieses Verlängerungsrohr wurde auf einer peristaltischen Pumpe (MP-3A, hergestellt von Tokyo Rika) montiert. Das Ende, auf dem keine Gaze befestigt war, wurde in eine Flasche platziert, die voll von einem Zellkulturmedium war, das zu dem Ende zugeführt war, auf dem die Gaze befestigt war. Dann wurde, absorbiert durch die die Gaze enthaltenden Filamente, das Kulturmedium über die ganze Gaze verteilt. Als es übermäßig langsam wurde, begann das Medium damit, mit der Gaze als ein Medium-durchdringender Träger zu sinken, bis es das konische Rohr füllte. Die durchdringende Menge des Kulturmediums kann von 10 μl bis 3,3 ml/min durch jegliches von dem Folgenden gesteuert werden:

<1> durch Einstellen der Einstellscheibe auf der peristaltischen Pumpe;
<2> durch Verwenden eines anderen Verlängerungsrohrs mit einem unterschiedlichen Durchmesser; oder
<3> durch Ersetzen von inneren Zahnrädern der peristaltischen Pumpe.

Außerdem wurde in der Kappe des konischen Rohrs ein kreisförmiges Loch mit einem Durchmesser von ungefähr 4 mm gebohrt, eine sterilisierte Kunststoffpipette wurde zu einer geeigneten Länge (Falcon #7520, 1 ml) zugeschnitten und wurde in dieses Loch eingesetzt (21). Danach wurde in diese Kappe ein Stück von Gaze montiert, wie oben beschrieben, und das Rohrende, auf dem keine Gaze befestigt ist, wird auf dem oberen Ende der Pipette montiert. Dies macht sie bereit, ein Zellkulturmedium in einem einzigen konischen Rohr zirkulieren zu lassen (22).
BEISPIEL 6
(Ein Verfahren zum dreidimensionalen Züchten von Tierzellen)
Ein kreisförmiges Stück von Gaze, an dem eine Verlängerung angebracht war (ein Durchmesser von 5,0 cm), wie in Beispiel 5 erzeugt, wurde auf die Bodenoberfläche der hydrophoben Polystyrol-Kulturpetrischale (Falcon #1007, ⌀ 60 mm) platziert. Der kreisförmige Gazeteil wurde mit ungefähr 0,8 ml von 0,25% Typ-I-Collagenlösung (CELLGEN I-PC; hergestellt von Koen Co., Ltd.) bedeckt, um in der Luft aseptisch getrocknet zu werden; und, wenn erforderlich wurde die Bodenoberfläche der Schale, an der Gaze angebracht war, durch Ultraviolettstrahlung (eine kurze Wellenlänge von 254 mm) für etwa 30 Minuten bestrahlt.
In der vorgenannten Petrischale wurden menschliche dermale Fibroblaste, die in 5,0 ml von Zellkulturmedium* suspendiert waren, das 0,1 mM L-Ascorbinsäurephosphat-Magnesiumsalz (hergestellt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) enthält, bei der Enddichte von 8,0 × 10⁵ Zellen/Schale zur Kultur angesetzt und bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO₂ und 95% Luft gezüchtet. Während des Prozesses wurde das Kulturmedium alle zwei Tage zum frischen Medium gewechselt, wobei ermöglicht wurde, dass die Zellen bis zum 10ten Tag einer Kultur in einem Multilayerzustand auf dem Gazenetz vermehrt wurden. (23 Fotografie-Phasenkontrastmikrofotografie).
Am 10ten Tag einer Kultur wurde ein vorspringender Teil der Gaze durch eine Pinzette physisch aufgenommen, wobei ermöglicht wird, dass die Zellen, die in einer Multilayerform auf dem Gazenetz vermehrt waren, von der Schale losgelöst wurden. Es wurde gefunden, dass im Wesentlichen keine der Zellen auf der Schale zurückblieb, von der die Gaze losgelöst wurde (24: Fotografie: Phasenkontrastmikrofotografie). Vielmehr waren die meisten der Zellen auf der Gaze angeklebt, die von der Schale entfernt war (25: Fotografie: Phasenkontrastmikrofotografie).
Man ließ die Gazeprobe, die so gefertigt war, dass auf ihr ein Multilayer von vermehrten Zellen anhaftete, auf dem Medium-durchdringenden Gerät anhaften, einschließlich demjenigen, das in Beispiel 5 erzeugt war. Während 10 ml eines ähnlichen Kulturmediums mit einem Durchsatz von etwa 0,8 ml/min zirkuliert wurden, wurde sie bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO₂ und 95% Luft gezüchtet (die 26 und 27). Alle zwei Tage wurde das Kulturmedium zu einem frischen Medium gewechselt, und dann wurde der Gazeteil nach 3 Wochen einer Kultur herausgenommen, während man ein Kulturmedium eindringen ließ. Wenn er mittels eines Phasenkontrastmikroskops beobachtet wurde, zeigte das Resultat, dass jede von diesen Zellen ein Spontanaggregationvermögen überall im dünnen Gewebe von Gaze zeigten, wobei ein multizelluläres Aggregat gebildet wurde, in dem die Gazefaser über den ganzen Körper verteilt war (28: Fotografie-Phasenkontrastmikrofotografie). Anschließend wurde das obige multizelluläre Aggregat mit Formalin befestigt und dehydriert. Danach wurde das Aggregat zur optischen mikroskopischen Beobachtung in Harz eingebettet, in 4 μm dicke Scheiben geschnitten und mit Comdssi-Blau und Hämatoxylin mit doppelter Farb-Färbung versehen, wobei die Probe einer internen histologischen Strukturbeobachtung ausgesetzt gelassen wurde.
Ein Vergleich wurde zwischen der Probe in diesem Beispiel und dem Sphäroid mit einem Durchmesser von etwa 600 μm gemacht und das für drei Wochen gezüchtet war, nachdem es durch die herkömmlichen Prozesse unter Verwendung derselben menschlichen dermalen Fibroblaste erzeugt war. Die Ergebnisse offenbarten, dass es trotz der Tatsache, dass ziemlich viele pyknotische Gewebereste oder Zelltrümmer im Innern des Sphäroids gesehen wurden (die 29 und 30), es größtenteils keine von den pyknotischen Zellen gab, die auf dem Abschnitt eines multizellulären Aggregats beobachtet wurden, das in dem Stück von Gaze enthalten war, das einen größeren Durchmesser von mehr als 5 mm und einen kleineren Durchmesser von ungefähr 2 mm aufwies. Zwischen den Zellen wurde positive Comdssi-Blau-Faser-Biosynthese bemerkt (die 31 und 32), und es wurde vermutet, dass die innere Struktur, die die Zellen bildet, eine außerordentlich günstige Lebendzellenaktivität aufwies.
Vergleichsbeispiel 3
Im Beispiel 6 wurde ein anderer Versuch gemacht. Die Zellen wurden in einem normalen Zellkulturmedium* suspendiert, das kein L-Ascorbinsäurephosphat-Magnesiumsalz enthielt, und in derselben Enddichte zur Kultur angesetzt, dann wurde das Kulturmedium alle zwei Tage ausgewechselt, und es wurde eine Zellkultur für 10 Tage fortgesetzt. Am 10ten Tag einer Kultur wurde es beobachtet, dass die Zellen auf dem Gazenetz nicht in einer Multilayerform vermehrt waren; vielmehr war auf dem Gazenetz ein zusammengewachsener Monolayer gebildet (33: Fotographie: Phasenkontrastmikrofotografie).
Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 6 dargestellt, wurde der vorspringende Gazeteil durch eine Pinzette aufgenommen, wobei ermöglicht wurde, dass das Gazenetz von der Petrischale entfernt wurde (34: Fotographie: Phasenkontrastmikrofotografie). Es wurde dann gefunden, dass nahezu keine der Zellen an der entfernten Gaze angebracht war (35: Fotografie: Phasenkontrastmikrofotografie). Die Ergebnisse des vorhergehenden Versuchs zeigten deutlich die Tatsache, dass eine Zugabe von Ascorbinsäure die Zellen in einer Multilayer (dreidimensionalen)-Form auf dem Medium-durchdringenden Zellkulturträger zusammenwachsen ließen.
Wie oben in Einzelheit beschrieben, macht es die vorliegende Erfindung möglich, Tierzellen dreidimensional zu züchten, so dass sie ihr eigenes Gewebe auf dieselbe Weise spontan aggregieren, wie sie im Gewebe oder Organ vorliegen, von dem sie abgeleitet sind.
Ein als ein Träger offenbarter Netzkörper gemäß der vorliegenden Erfindung liefert insbesondere nicht nur Medium-durchdringende Eigenschaften, sondern läßt auch die zu züchtenden Zellen unter größerer Spannung stehen, wobei eine dreidimensionale, sehr wirkungsvolle Kultur von Zellen ermöglicht wird, um den Zustand von Zellen in einem lebenden Organismus genauer zu simulieren.
Weiter ist das Trägergerät gemäß der vorliegenden Erfindung außerordentlich leicht zu handhaben. Im Vergleich mit dem dreidimensionalen Aggregat, das durch das herkömmliche Kultur verfahren gegeben ist, einschließlich des Sphäroidkulturverfahrens, kann das Aggregat, das durch das Kulturverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wird, hinsichtlich Größe und der Anzahl von konstituierenden Zellen freier gesteuert werden. Dies ist insofern nützlich, als eine ausreichende Anzahl von Zellen für den Assay der Zellaktivität gewährleistet werden kann.

Claims

Vorrichtung für eine Zellkultur, umfassend: a) ein Kulturgefäß; b) in dem Kulturgefäß verwendbar: einen Medium-durchdringenden Zellkulturträger für das dreidimensionale Kultivieren von Tierzellen, wobei der Zellkulturträger eine Mehrzahl von Seidenfäden oder einen Webkörper derselben umfasst und wobei der Webkörper entweder ein Netzkörper oder ein gazeartiger Körper ist; und c) eine Einrichtung zur Zufuhr von Kulturmedien zu dem Kulturgefäß, wobei ein Ende des Kulturträgers, der in dem Kulturgefäß vorhanden ist, mit der Einrichtung zur Zufuhr von Kulturmedien verbunden ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der der Webkörper in einem lebenden Organismus biologisch abbaubar ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der bei Gebrauch Ascorbinsäure zum Kulturmedium hinzugefügt wird, um eine Proliferation von Zellen und eine Bildung von Multilayerzellen zu beschleunigen.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der der Träger mit dem Vermögen versehen ist, Zellen darauf adhärieren zu lassen.
Vorrichtung nach Anspruch 4, bei der der Träger mit dem Vermögen versehen ist, Zellen darauf selektiv und örtlich adhärieren zu lassen.
Vorrichtung nach Anspruch 4 oder 5, bei der der Träger mit extrazellulärer Matrix, Gelatine, Lektin, Mytilidae-abgeleitetem adhäsivem Protein, Polylysin, adhäsivem Oligopeptid oder Thrombospongin behandelt ist, um das Vermögen bereitzustellen, Zellen darauf adhärieren zu lassen.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der der Träger als ein indirekter adhäsiver Träger dient.
Vorrichtung nach Anspruch 7, bei der der Träger im Innern eines Gels eingebettet ist, das extrazelluläre Matrixkomponenten enthält.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der die Einrichtung zur Zufuhr von Kulturmedien eine Pipette oder eine Tropfpipette oder eine andere ähnliche Einrichtung ist, die durch ein Traggestell vertikal getragen wird.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der die Einrichtung zur Zufuhr von Kulturmedien ein rohrförmiges Element ist, das so konstruiert ist, dass es in dem Kappenelement des Gefäßes zu montieren ist.
Vorrichtung nach Anspruch 10, bei der das andere Ende des rohrförmigen Elements in ein Kulturmedium eingesetzt ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der die Einrichtung zur Zufuhr von Kulturmedien mit einer peristaltischen Pumpe ausgerüstet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, die eine Einrichtung zum Steuern der Menge von zugeführtem Kulturmedium aufweist, die an einer Verbindung zwischen dem Träger und der Einrichtung zur Zufuhr von Kulturmedien angeordnet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, umfassend eine Einrichtung zur Zirkulation von Kulturmedien.