EP2288688A2 - Perfundierbarer bioreaktor zur herstellung von menschlichen oder tierischen geweben - Google Patents

Perfundierbarer bioreaktor zur herstellung von menschlichen oder tierischen geweben

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EP2288688A2
EP2288688A2 EP09723972A EP09723972A EP2288688A2 EP 2288688 A2 EP2288688 A2 EP 2288688A2 EP 09723972 A EP09723972 A EP 09723972A EP 09723972 A EP09723972 A EP 09723972A EP 2288688 A2 EP2288688 A2 EP 2288688A2
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EP
European Patent Office
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tissue
bioreactor
bioreactor according
interior
production
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP09723972A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Bernhard Frerich
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NOVATISSUE GmbH
Original Assignee
NOVATISSUE GmbH
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Publication date
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Application filed by NOVATISSUE GmbH filed Critical NOVATISSUE GmbH
Publication of EP2288688A2 publication Critical patent/EP2288688A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/14—Bags
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/08—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing artificial tissue or for ex-vivo cultivation of tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/26—Constructional details, e.g. recesses, hinges flexible
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/14—Scaffolds; Matrices
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/10—Perfusion

Definitions

  • the invention relates to a perfusable bioreactor for the production of human or animal tissues or tissue equivalents, the preparation of which is based on a construct cultured in the interior, the interior is enclosed by a shell and has at least one inlet and an outlet for a liquid nutrient medium, the bioreactor is connectable to a unit for generating a perfusion pressure of the nutrient medium.
  • This tissue replacement is used in particular for clinical therapeutic application.
  • perfusable bioreactors are bioreactors which allow the construct introduced into them to be flowed through primarily by a liquid medium and can be flowed around secondarily.
  • constructs within the meaning of the invention are artificially produced three-dimensional tissue equivalents which contain living cells in a three-dimensional matrix, in particular combinations of scaffolds and living cells (scaffold-cell combinations), if appropriate also combined with matrix factors Designations Blood vessel equivalents and blood vessel wall equivalents used analogously to this definition.
  • tissue engineering cell and tissue engineering
  • tissue engineering Even at low tissue volumes, it is important to implement a vasculature or equivalent because, for distances greater than about 100-300 microns to the next blood capillary, diffusion to nutrition is no longer sufficient.
  • tissue therefore also requires its own blood vessel supply, which naturally has to be adapted to the shape of the implant.
  • bioreactors in which supplying blood vessels can be cultured in combination with any desired tissue and which, in addition, meet the physical / mechanical requirements of soft-tissue and / or vascular / microvascular engineering.
  • the tissue construct after implantation the Fills the defect as precisely as possible to achieve the desired aesthetic result.
  • soft tissues especially fatty tissue for surface contouring or defect compensation, but also for bone, which is used in contour effective localizations, it is desirable to achieve a targeted specific shape.
  • the preforming and definition of the outer shape of a tissue engineered tissue construct is typically achieved via the shape of a scaffold on which the cells grow and multiply, forming the outer shape of the scaffold in which the artificial tissue is formed with a specific differentiation.
  • the object of the invention is to provide a bioreactor which overcomes the disadvantages of the prior art.
  • Invention is essential that at least a sub-segment of this shell made of elastic Material exists.
  • the shell of the bioreactor is largely elastic and its elasticity along with that of the tissue or vascular equivalent inside has a mechanical "compliance" corresponding to that of the target tissue.
  • the elastic sub-segments of the sheath ensure the exercise of physiological mechanical stresses (pressures and forces), e.g. by a pulsatory perfusion from the inside with pressures targeted in the physiological or pathological area (blood pressure).
  • a pulsatile perfusion via the tissue and the hydrostatic pressure of the nutrient medium against the elastic sheath (wall) is forwarded and it can act on the tissue mechanical or hydrodynamic stresses.
  • the essential difference from previous solutions lies in the fact that this perfusion dynamics takes place in an elastic environment and, by adjusting the elasticity of the chamber wall, the compliance of natural blood vessels and tissue in a physiological and pathological situation can be modeled.
  • Connected thereto may also be a tight-fitting, form-fitting design of the reactor wall to the fabric to be produced, which has the advantage that the fabric elongation is adjustable by the elasticity of the reactor wall. Another advantage is that the form-fitting enclosure a perfusion of the scaffold is supported and a simple rinsing with medium is avoided.
  • the contour of the interior of the bioreactor substantially corresponds to the outer contour of the fabric to be produced.
  • the inner contour of the interior corresponds in at least more than 50% to the surface of the outer contour of the human or animal tissue or tissue equivalent to be produced.
  • the construct fills the bioreactor according to the invention to a large extent, the supply is not carried out by rinsing the Constructs with the medium, but primarily by perfusion of a hollow fiber or hollow conduit system, a preformed or growing, artificial vasculature, a porous framework or a combination of at least two of these principles (shown in Fig. 1 A to C).
  • the solution according to the invention thus also includes the individual, dimensionally accurate covering of a framework 4 (scaffold) in individual form, so that the framework narrows closely from the elastic shell 1, d. H. the elastic chamber wall, surrounded, and is perfused by the perfusion medium.
  • a microvascular vascular network should be able to develop that will ultimately take care of the supply.
  • This will receive its central inflow 2 and outflow 3 at the preformed channels or resorbable hollow fiber tubes, so that these connections can be connected as artificial supply blood vessels microsurgically in the recipient storage to local blood vessels and thus a blood flow to the tissue is guaranteed immediately after implantation.
  • the preformation, d. H. defined spatial configuration of the tissue to be implanted (tissue implant), which has the spatial configuration of the tissue produced with the bioreactor according to the invention, also has the advantage that the fabric produced fits exactly into the defect to be supplied, so that an optimal functional and aesthetic result is reached.
  • the preparation of these bioreactors can be carried out in a known manner via CAD / CAM techniques from three-dimensional image data sets of the defect to be supplied or by taking individual, dimensionally accurate defect models that have been produced by means of CAD / CAM techniques.
  • the erf ⁇ ndungswashe solution also includes the individual, dimensionally accurate wrapping (eg by coating, deep drawing) of a scaffold (scaffolds, which has also been prepared for example via imaging and CAD / CAM accurately) in individual form, so that the framework closely from the shell, ie the chamber wall, is surrounded, and perfusion medium is flowed through. Ports and tributaries are incorporated into this enclosure, piping systems may be incorporated in the framework in this case.
  • a particular advantage of the bioreactor according to the invention is, individually to the desired shape of the tissue to be implanted, d. H. of the tissue to produce tailored disposable bioreactors.
  • Inflow 2 and outflow 3 in Figure 1 A bi C reflect the direction of medium perfusion.
  • the perfusion medium is in the integrated into the chamber absorbable or non-resorbable waveguide system, by tissue engineering manufactured blood vessels or
  • the resorbable or permanent waveguide system integrated in the bioreactor or the distribution over the porous framework initially takes care of the tissue, if necessary, until it can supply itself due to the development of its own vascular system or until it is implanted.
  • the growth of a Gefrissasystems is possibly supported by the hydrodynamic stress, which acts due to the pulsatile perfusion in the vicinity of the hollow conduit system.
  • the transmission of the mechanical impulses and their intensity can be varied.
  • the production of an artificial vascular system can be done by means of a predefined two-dimensional matrix or a three-dimensional braid done.
  • a blood vessel system produced without tissue by means of tissue engineering and its developing vessel protrusions can take over the distribution of the perfusion medium and thus the supply of the surrounding tissue, or a combination of synthetic resorbable scaffolds and tissue engineering vessels.
  • devices for monitoring can be integrated into the elastic wall of the cavity of the bioreactor.
  • These include, for example, viewing windows for direct optical observation (eg by microscopy, fluorescence microscopy, laser scanning microscopy, etc.).
  • the functional monitoring is carried out via a probe system which monitors substance concentrations and physical or chemical parameters such as O 2 and CO 2 concentration, pressure in the chamber and in the remaining bioreactor, oxygen partial pressure, pH, flow rate and temperature. Elongation of the elastic walls can be monitored with strain gauges.
  • the monitoring also actively contributes to the regulation of growth conditions in the bioreactor system, since it is integrated into a control loop as sensor technology.
  • a particular advantage of this approach is to tailor to the desired shape of the tissue to be implanted, i. H. of the tissue to produce tailored disposable bioreactors.
  • a three-dimensional data set is calculated with which the planning of the shape of the bioreactor is carried out in order to be able to achieve the shape of the tissue to be produced according to the invention.
  • These raw data used for this purpose can come from various known imaging modalities (CT, MRI (magnetic resonance imaging), ultrasound, etc.) and are preprocessed with suitable image processing methods.
  • the three-dimensional wireframe model exported to a CAD / CAM system can be translated into a 3D model of the bioreactor with high precision from a 3D printer, a CNC miller or other three-dimensional shaping device.
  • the bioreactor is made directly from elastic biocompatible material (elastomers, e.g., silicones) or the 3D model serves as a mold for the casting.
  • elastic biocompatible material elastomers, e.g., silicones
  • 3D model serves as a mold for the casting.
  • CT three-dimensional patient data
  • MRT further modalities
  • a three-dimensional wireframe model with corresponding spatial resolution in the respective shape of the required tissue is produced by means of a CAD / CAM system.
  • the geometry data of the wireframe model are then loaded into an adequate three-dimensional shaping system (3D printer, CNC milling machine, etc.) and the bioreactor is thus manufactured with very high precision.
  • Fig. 1 A to C show variants of the elastic bioreactor for the production of tissues with an elastic sheath 1 in defect form. Another alternative possibility is the dimensionally accurate wrapping 1 of scaffolding
  • piping systems, hollow fiber systems, or negative molds for piping systems which leave behind channels after removal can be incorporated into the cavity or the walls.
  • Possibilities of incorporating a vascular or conduit system into the tissue include incorporation of preformed hollow fiber or conduit systems, tissue engineering of vessels, or a combination of both.
  • a piping system by a casting process.
  • Wires 6 of a suitable, smooth material are laid in the bioreactor and connect the inlet opening 2 with the outlet opening 3.
  • the filling of the bio-factor takes place with particles of a carrier material which has been colonized with the cells of the target tissue (overgrown microcarriers). These are initially cultivated separately until the cells (stem cells, pre-differentiated or differentiated cells) have a certain density achieved.
  • FIG. 1A shows a bioreactor for the production of tissue with removable wires as placeholders for channels and conduits). Possibly. is an additional colonization of the channels with vascular wall cells (smooth muscle cells, endothelial cells) possible sequentially.
  • vascular system The growth of a vascular system is possibly promoted by the hydrodynamic stress, which acts on the close environment of the artificial vessel walls due to the pulsatile perfusion.
  • This tissue-engineered, artificial, blood vessel system and its vascular sprouts that develop during the cultivation period take over the distribution of the perfusion medium and thus the supply of the surrounding tissue.
  • a preformed, possibly resorbable hollow fiber system 5 which then serves as a pipe system for the supply (FIG. 1B, elastic bioreactor for the production of tissue using a hollow fiber system).
  • the resorbable or permanent waveguide system 5 integrated into the bioreactor or the distribution via the porous framework initially takes care of the supply of the tissue, if necessary, until it can supply itself due to the development of its own vascular system or until it is implanted. It is later resorbed and replaced with vessels or functionally resorbed if blood flow through collateral blood supply after transplantation is sufficient.
  • Fig. 1 C shows an elastic
  • Bioreactor for the production of tissue using a porous framework for medium distribution can channels and lines 7 (with a larger pore or Channel diameter), if necessary, be incorporated from resorbable material, so that even with proliferation of the cells, a flow is maintained, and a settlement with the vessel wall cells is possible, so that vessels can form.
  • the arrows which can be seen in the interior in FIG. 1C indicate the direction of flow of the medium in the porous framework.
  • the soft tissue defect to be treated is used to create a virtual 3-D model, on the basis of which a shapely framework (scaffold) 4 (soft) with CAD / CAM
  • the framework is porous and contains channels 7 for perfusion which open at the pre-calculated locations for inlet 2 and outlet 3. Due to the porosity of the
  • the framework ensures that the medium can be distributed sufficiently throughout the framework from the lines. (The arrows visible in FIG. 1C in the interior indicate the direction of flow of the medium in the porous framework.)
  • the framework is then sheet-like covered with an elastic plastic, e.g. by deep drawing or by coating (preferably silicones).
  • an elastic plastic e.g. by deep drawing or by coating (preferably silicones).
  • prefabricated fittings are polymerized. This creates an individual reactor for an individual defect.
  • the colonization can then be carried out by inoculation with suspended cells (possibly several times), possibly sequentially (first mesenchymal cells of the mesenchyme, then vessel wall and endothelial cells for the vessels).
  • the method can in principle be applied to any vascularized tissue.
  • Example 4 Additional integration of devices into the elastic sheath (chamber wall) of the bioreactor
  • the monitoring (monitoring and control) of the growth parameters inside the bioreactor can be done via a responsive probe system which is installed via predefined ports in the chamber.
  • substance concentrations and physical or chemical parameters such as O 2 and CO 2 concentration, pressure, oxygen partial pressure, pH, viscosity, flow rates and temperature are measured.
  • the monitoring also actively contributes to the regulation of growth conditions in the bioreactor system, since it is integrated into the control loop as sensor technology.
  • An artificial, supplying blood vessel system produced by means of tissue engineering and its vessel sprouts developing during the cultivation period take over the distribution of the perfusion medium and thus the supply of the surrounding tissue.
  • Example 6 Preparation of blood vessels or blood vessel nets, other tissues (FIGS. 2a and b and 3a and b)
  • the bioreactor for the production of a blood vessel according to Fig. 2a and Fig. 2b consists only of a cylindrical elastic body 8, which corresponds to the outer diameter of the blood vessel.
  • the vessel / vessel equivalent 10 eg an elastic, resorbable Framework material with a tubular shape
  • Fig.2a the vessel / vessel equivalent 10
  • Schlaucholiven 11 it is pushed onto Schlaucholiven 11 and this in turn placed in a Luer-lock holder on the connection 9 of the bioreactor, whereby the seal is achieved (on both sides).
  • the construct can be perfused with medium and colonized with cells, if not already done before clamping (smooth muscle cells and / or progenitor cells and / or endothelial cells, possibly sequentially).
  • the arrows in Fig. 2a and Fig. 3a correspond to the direction of the medium flow.
  • the compartmentalized version of the bioreactor For some applications it makes sense not to make the whole construct in one step. This is possible with the compartmentalized version of the bioreactor.
  • the blood vessel network as described in Example 6, is first prepared in a compartment and then a dividing wall is opened to the second, sterile, still unused compartment. There, the actual graft tissue or equivalent is then deposited (as a scaffold with cells, settable scaffold or particles, or scaffold-free with cells), so that it is fed via the existing vascular network.
  • Example 8 - Connection and operation of the self-regulating pulsatile perfusion system
  • a self-regulating pulsatory perfusion system is connected to the bioreactor or to the hollow conduit system established in it and serves to simulate physiological or experimental pressure conditions.
  • FIG. 4a and b A miniaturized variant for experimental applications, in which a Vascular equivalent or blood vessel 10 together with a tissue section (Kontrukt / tissue piece) 21 is cultivated so that it can be subjected to comprehensive monitoring (monitoring and control) is described below ( Figure 4a and b). It consists in that a slim holder 14 is integrated into the chamber wall and connects the two end faces, at the ends (of the holder) are fastened in each case connections 16.1 and 16.2, which serve to connect a blood vessel or blood vessel equivalent.
  • the port 16.2 at the inlet 2 must be designed so that the vessel / vessel equivalent 10 through the large opening for loading and assembly 17, with screw cap 25, introduced sterile and can be coupled to the end face 18.2.
  • the end face 18.2 is provided with a smaller opening with a flange through which a coupling 19 can be introduced from the outside with a Schlaucholive on which the vessel / Gefubbäquivalent 10 is fixed.
  • This coupling 19 is for example attached to the flange in a liquid-tight manner with a Luer-Lock principle and fixes the vessel / vessel equivalent.
  • the vessel / vessel equivalent is attached to the port 16.1 (eg Schlaucholive).
  • the conduit for the drain 3 is guided in the holder 8 or along it (14.1).
  • a blood vessel can be produced or simulated by means of tissue engineering that is in direct contact with a supplied tissue section (construct / tissue piece) 21.
  • tissue engineering that is in direct contact with a supplied tissue section (construct / tissue piece) 21.
  • sprouts small blood vessels
  • tissue engineered constructs one can also study physiological or pathological processes in vitro that were previously reserved for animal experiments. This preferably applies to pathological and physiological processes on vessels or to the circulatory system, for obesity research and for the testing of pharmacological substances in which the interactions between blood vessels and tissue play a role.

Abstract

Die Erfindung betrifft einen perfundierbaren Bioreaktor zur Herstellung von menschlichen oder tierischen Geweben oder Gewebeäquivalenten, wobei deren Herstellung auf einem in den Innenraum kultivierten Konstrukt basiert, der Innenraum von einer Hülle umschlossen ist und zumindest einen Einlass und einen Auslass für ein flüssiges Nähr-Medium besitzt, der Bioreaktor mit einer Einheit zur Erzeugung eines Perfusionsdrucks des Nähr-Medium verbindbar ist. Dieser Gewebeersatz dient insbesondere zur klinisch-therapeutischen Anwendung.

Description

BESCHREIBUNG
Perfundierbarer Bioreaktor zur Herstellung von menschlichen oder tierischen Geweben
Die Erfindung betrifft einen perfundierbaren Bioreaktor zur Herstellung von menschlichen oder tierischen Geweben oder Gewebeäquivalenten, wobei deren Herstellung auf einem in dem Innenraum kultivierten Konstrukt basiert, der Innenraum von einer Hülle umschlossen ist und zumindest einen Einlass und einen Auslass für ein flüssiges Nähr-Medium besitzt, der Bioreaktor mit einer Einheit zur Erzeugung eines Perfusionsdrucks des Nähr-Medium verbindbar ist. Dieser Gewebeersatz dient insbesondere zur klinisch-therapeutischen Anwendung.
„Perfundierbare Bioreaktoren" im Sinne der Erfindung sind Bioreaktoren, welche es erlauben, dass das in diese eingebrachte Konstrukt primär durch ein flüssiges Medium durchströmbar ist; sekundär umströmbar ist.
„Konstrukte" im Sinne der Erfindung sind artifiziell hergestellte dreidimensionale Gewebeäquivalente, die lebende Zellen in einer dreidimensionalen Matrix enthalten, insbesondere Kombinationen aus Gerüsten und lebenden Zellen (Gerüst-Zell- Kombinationen), ggf. auch kombiniert mit Matrixfaktoren. Im Sinne der Erfindung werden die Bezeichnungen Blutgefäßäquivalente und Blutgefäßwandäquivalente analog dieser Definition verwendet.
Für die Herstellung von Geweben in vitro wurden bis heute verschiedenste Typen von perfundierbaren Bioreaktoren entwickelt. Allerdings konzentrierte man sich bisher hauptsächlich auf die Herstellung von Bioreaktoren mit starren Wandungen, deren Form nicht an das zu züchtende Gewebe angepasst ist. Deshalb entsprechen Belastungen und Einflüsse auf das in vitro wachsende Gewebe nicht denen eines natürlichen Gewebes in vivo. Allerdings sind es gerade mechanische Belastungen, welche einen nicht zu unterschätzenden Einfluss auf das Gewebewachstum in vivo haben und in vitro ebenfalls modelliert werden sollten. Außerdem besteht der Nachteil, dass auch, wenn eine Perfusion des Gewebe oder Gewebeäquivalents beabsichtigt ist, es sich meist nicht um eine Durchströmung i.e. S., sondern mehr um eine Umströmung handelt, und somit keine optimale Versorgung im Inneren eines solchen Konstruktes vorliegt. Dieses Problem spielt insbesondere eine Rolle für Weichgewebe und Blutgefäße. Die Bereitstellung oder Herstellung von Ernährung und Durchblutung durch Blutgefäße ist ein wesentliches ungelöstes Problem beim Tissue Engineering (Zell- und Gewebezüchtung). Schon bei geringen Gewebevolumina ist es wichtig, ein Gefäßsystem oder ein entsprechendes Äquivalent zu implementieren, da für Distanzen von mehr als etwa 100-300 μm bis zur nächsten Blutkapillare die Diffusion zur Ernährung nicht mehr ausreicht. Ein solches Gewebe benötigt also auch eine eigene Blutgefaßversorgung, die natürlicherweise der Form des Implantats angepasst sein muss. Es besteht daher ein Bedarf an Bioreaktoren, in denen versorgende Blutgefäße in Kombination mit einem beliebigen Gewebe kultiviert werden können und die zudem den physikalischen/mechanischen Ansprüchen eines weichgewebigen und/oder vaskulären/mikrovaskulären Engineering gerecht werden.
In bisherigen Bioreaktoren sind zwar bereits pulsatorische Perfusionen realisiert worden, die den Blutdruck simulieren sollen, insbesondere um artifizielle Gefäßkonstrukte an die Blutdruckkräfte in vivo zu konditionieren. In dem Umfeld einer starren Bioreaktorwand sind diese jedoch häufig nicht physiologisch oder werden unphysiologisch reflektiert, was auch zur Zerstörung der Zellen im Reaktor fuhren kann. Es ist somit die Bereitstellung einer physiologischen Gewebecompliance (Dehnbarkeit des Gewebes) im dreidimensionalen Environment erforderlich, was mit bisherigen Systemen nicht möglich ist. Ein weiteres Problem ist die Gestaltung der Form von Gewebekonstrukten, die z.B. Defekte im subkutanen Fettgewebe oberflächennah ausgleichen sollen. Das herzustellende Gewebe benötigt in Abhängigkeit des jeweiligen Einsatzes, insbesondere als Gewebeersatz eine individuelle Form, d. h. eine definierte räumliche Konfiguration. Hierbei ist es von besonderer Bedeutung, dass das Gewebekonstrukt nach Implantation den Defekt möglichst genau ausfüllt, um das gewünschte ästhetische Ergebnis zu erreichen. Für das Engineering von Weichgeweben, insbesondere Fettgewebe für die Oberflächenkonturierung oder zum Defektausgleich, aber auch für Knochen, der an konturwirksamen Lokalisationen verwendet wird, ist es wünschenswert, gezielt eine spezifische Form zu erzielen.
Auch hinsichtlich der Herstellung der Blutversorgung ist es wichtig, die Form schon bei der Herstellung des Gewebes zu berücksichtigen, damit die Blutgefäß Versorgung gleich in der richtigen Dimensionierung angelegt wird und nicht später durch Formkorrekturen zerstört wird.
In bisherigen Ansätzen wird die Präformierung und Festlegung der äußeren Form eines mittels Tissue Engineering hergestellten Gewebekonstrukts in der Regel über die Form eines Gerüsts („Scaffold") angestrebt, auf dem die Zellen anwachsen und sich vermehren. Die äußere Form des Gerüsts bildet die Leitschiene bilden, in der sich das artifizielle Gewebe mit einer spezifischen Differenzierung ausbildet.
Es wäre aber ein idealer Ansatz, gerüstfrei oder mit rasch resorbierbaren Gerüstmaterialien arbeiten zu können. Gleichzeitig muss dann aber die äußere Form vorgegeben sein und idealerweise den individuellen Defekt wiedergeben, in den das Konstrukt später passen soll. Auch bei Verwendung von Gerüsten birgt die Kultivierung in Perfusionsbioreaktoren, die in ihrer Form nicht auf das Gerüst angepasst sind, einen möglichen Nachteil. Es wird in diesen Bioreaktoren häufig nur eine Umströmung mit dem Nähr-Medium erreicht und nicht eine Perfusion, so dass die zentralen Gerüstanteile u. U. nicht ausreichend ernährt werden.
Aufgabe der Erfindung ist es, einen Bioreaktor bereit zu stellen, welcher die Nachteile des Standes der Technik überwindet.
Die Aufgabe der Erfindung wird durch die Merkmale des Anspruchs 1 gelöst.
Erfindungs wesentlich ist, dass zumindest ein Teilsegment dieser Hülle aus elastischem Material besteht.
Wesentlich ist, dass die Hülle des Bioreaktors zu großen Teilen elastisch ist und ihre Elastizität zusammen mit der des Gewebe- oder Gefäßäquivalents im Inneren eine mechanische "Compliance" entsprechend der des Zielgewebes besitzt.
Die elastischen Teilsegmente der Hüllegarantieren die Ausübung physiologischer mechanischer Belastungen (Drücke und Kräfte), z.B. durch eine pulsatorische Perfusion von innen mit Drücken gezielt im physiologischen oder pathologischen Bereich (Blutdruck). So wird beispielsweise eine pulsatile Perfusion über das Gewebe und den hydrostatischen Druck des Nähr-Mediums gegen die elastische Hülle (Wandung) fortgeleitet und es können mechanische bzw. hydrodynamische Belastungen auf das Gewebe einwirken. Der wesentliche Unterschied zu bisherigen Lösungen liegt darin, dass diese Perfusionsdynamik in einem elastischen Umfeld erfolgt und durch Einstellung der Elastizität der Kammerwand die Compliance natürlicher Blutgefäße und Gewebe in physiologischer und pathologischer Situation modelliert werden können.
Damit verbunden kann auch eine enganliegende, formschlüssige Gestaltung der Reaktorwand an das herzustellende Gewebe sein, was den Vorteil hat, dass die Gewebedehnung durch die Elastizität der Reaktorwand einstellbar ist. Ein weiterer Vorteil ist, dass durch die formgenaue Umhüllung eine Perfusion des Gerüsts unterstützt wird und eine einfache Umspülung mit Medium vermieden wird.
Dann entspricht die Kontur des Innenraums des Bioreaktors im Wesentlichen der äußeren Kontur des herzustellenden Gewebes.
Bevorzugt ist weiterhin, dass die innere Kontur des Innenraums in zumindest mehr als 50% der Oberfläche der äußeren Kontur des herzustellenden menschlichen oder tierischen Gewebes oder Gewebeäquivalents entspricht.
Im Unterschied zu anderen Bioreaktoren füllt das Konstrukt den erfindungsgemäßen Bioreaktor zu großen Teilen aus, die Versorgung erfolgt nicht durch Umspülung des Konstrukts mit dem Medium, sondern primär durch Perfusion eines Hohlfaser- oder Hohlleitungssystems, eines präformierten oder wachsenden, künstlichen Gefäßsystems, eines porösen Gerüsts oder eine Kombination aus mindestens zweier dieser Prinzipien (dargestellt in Fig. 1 A bis C).
Die erfindungsgemäße Lösung beinhaltet somit auch die individuelle, formgenaue Umhüllung eines Gerüsts 4 (scaffold) in individueller Form, so dass das Gerüst eng von der elastischen Hülle 1 , d. h. der elastischen Kammerwandung, umgeben ist, und vom Perfusionsmedium durchströmt wird. Durch die Perfusion, die Regulierung der Drücke und Kräfte und die Gewebecompliance in physiologischen Grenzwerten soll sich ein mikrovaskuläres Gefäßnetz heranbilden können, dass die Versorgung schlussendlich übernehmen wird. Dieses wird seinen zentralen Zufluss 2 und Abfluss 3 an den präformierten Kanäle oder resorbierbaren Hohlfaserröhren erhalten, so dass diese Anschlüsse als künstliche versorgende Blutgefäße mikrochirurgisch im Empfängerlager an ortständige Blutgefäße angeschlossen werden können und somit eine Durchblutung des Gewebes unmittelbar nach Implantation gewährleistet ist. Die Präformierung, d. h. definierte räumliche Konfiguration, des zu implantierenden Gewebes (Gewebeimplantats), welches die räumliche Konfiguration des mit dem erfindungsgemäßen Bioreaktor hergestellten Gewebes besitzt, hat zudem den Vorteil, dass das hergestellte Gewebe exakt in den zu versorgenden Defekt passt, so dass ein optimales funktionelles und ästhetisches Ergebnis erreicht wird.
Die Herstellung dieser Bioreaktoren kann in bekannter Art und Weise über CAD/CAM Techniken aus dreidimensionalen Bilddatensätzen des zu versorgenden Defekts oder durch Abformung von individuellen, formgenauen Defektmodellen erfolgen, die mittels CAD/CAM Techniken hergestellt worden sind. Die erfϊndungsgemäße Lösung beinhaltet auch die individuelle, formgenaue Umhüllung (z.B. durch Beschichtung, Tiefziehung) eines Gerüsts (scaffolds, das ebenfalls z.B. über Bildgebung und CAD/CAM formgenau hergestellt worden ist) in individueller Form, so dass das Gerüst eng von der Hülle, d. h. der Kammerwandung, umgeben ist, und vom Perfusionsmedium durchströmt wird. Anschlüsse und Zuflüsse werden an diese Umhüllung eingearbeitet, Leitungssysteme können in diesem Falle in das Gerüst eingearbeitet sein.
Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Bioreaktor ist es, individuell auf die gewünschte Form des zu implantierenden Gewebes, d. h. des herzustellenden Gewebes, zugeschnittene Einmalbioreaktoren herstellen zu können.
Die Unteransprüche 2 bis 14 geben weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung gemäß Anspruch 1 wieder, ohne diese zu begrenzen.
Die Versorgung des im Bioreaktor wachsenden Gewebes erfolgt über ein angeschlossenes selbstregulierendes, vorzugsweise pulsatil wirkendes Perfusionssystem, mittels welchem ein angepasstes Ernährungsmedium ("Perfusionsmedium") transportiert wird. Die Pfeile an
Zufluss 2 und Abfluss 3 in Fig. 1 A bi C geben die Richtung der Mediumperfusion wieder.
Das Perfusionsmedium wird in das in der Kammer integrierte resorbierbare oder nicht resorbierbare Hohlleitungssystem, mittels Tissue engineering hergestellter Blutgefäße oder
Blutgefäßäquivalente oder poröse Gerüst gepumpt und so unter Berücksichtigung der
Form des zu züchtenden Gewebekonstruktes verteilt. Nachdem das Perfusionsmedium das
Gerüst bzw. Hohlleitungssystem durchströmt und das in der Kammer befindliche Gewebe damit mit Sauerstoff und Nährstoffen versorgt hat, fließt es durch den Ausfluss aus dem Inneren (Hohlraum) des Bioreaktors heraus.
Das in den Bioreaktor integrierte resorbierbare oder permanente Hohlleitungssystem bzw. die Verteilung über das poröse Gerüst übernimmt zunächst die Versorgung des Gewebes, ggf. bis sich dieses aufgrund der Herausbildung eines eigenen Gefäßsystems versorgen kann oder bis es implantiert wird. Das Wachstum eines Gefaßsystems wird ggf. durch die hydrodynamische Belastung, welche aufgrund der pulsatilen Perfusion auf die nahe Umgebung des Hohlleitungssystems einwirkt, gefördert. Je nach Flexibilität der gewählten Materialzusammensetzung des Hohlleitungssystems kann die Weiterleitung der mechanischen Impulse und deren Intensität variiert werden. Die Herstellung eines künstlichen Gefäßsystems kann mittels einer vordefinierten zweidimensionalen Matrix oder eines dreidimensionalen Geflechtes erfolgen.
Alternativ zu einem künstlich, also mit Gerüstmaterialien hergestellten Hohlleitungssystem oder einfach eines porösen, perfundierbaren Gerüstes kann auch ein gerüstfrei mittels Tissue Engineering hergestelltes Blutgefäßsystem und dessen sich entwickelnde Gefäßaussprossungen die Verteilung des Perfusionsmediums und somit die Versorgung des umliegendes Gewebes übernehmen, oder eine Kombination synthetischer resorbierbarer Gerüste und mittels Tissue Engineering hergestellter Gefäße.
Weiterhin können Vorrichtungen zum Monitoring (Überwachung und Kontrolle) in die elastische Wandung des Hohlraums des Bioreaktors integriert werden. Hierzu zählen beispielsweise Sichtscheiben zur direkten optischen Betrachtung (z.B. durch Mikroskopie, Fluoreszenzmikroskopie, Laserscanning-Mikroskopie etc.). Das funktionelle Monitoring erfolgt über ein Sondensystem, welches Stoffkonzentrationen und physikalische bzw. chemische Kenngrößen wie z.B. O2- und CO2-Konzentration, Druck in der Kammer und im restlichen Bioreaktor, Sauerstoffpartialdruck, pH-Wert, Fließgeschwindigkeit und Temperatur überwacht. Die Dehnung der elastischen Wände kann mit Dehnungsmessstreifen überwacht werden. Das Monitoring trägt ausserdem aktiv zur Regulierung der Wachstumsbedingungen im Bioreaktorsystem bei, da es als Sensorik in einen Regelkreis eingebunden ist.
Ein besonderer Vorteil dieser Vorgehensweise ist es, individuell auf die gewünschte Form des zu implantierenden Gewebes, d. h. des herzustellenden Gewebes, zugeschnittene Einmalbioreaktoren herstellen zu können.
Alle eben aufgeführten Vorteile der Erfindung tragen somit deutlich zur Verbesserung bisheriger Bioreaktorsysteme, der Wachstumsverhältnisse in Bioreaktoren und der Qualität gezüchteter Gewebekonstrukte bei und haben positive Auswirkungen auf das Tissue Engineering(Zell- und Gewebezüchtung) im Allgemeinen und Speziellen. Die Erfindung wird nachfolgend an Ausführungsbeispielen näher erläutert, ohne damit alle Einsatzmöglichkeiten der Erfindung abschließend dargestellt zu haben.
Beispiel 1 - Herstellung eines individuellen, elastischen präformierten Bioreaktors
Nach dreidimensionaler Darstellung eines menschlichen oder tierischen Gewebedefekts mittels bekannter Bildgebungsverfahren wird ein dreidimensionaler Datensatz errechnet, mit dem die Planung der Form des Bioreaktors erfolgt, um die Form des herzustellenden Gewebes erfindungsgemäß erreichen zu können. Diese dazu verwendeten Rohdaten können hierbei aus diversen, bekannten Bildgebungsmodalitäten stammen (CT, MRT(Kernspintomografen), Ultraschall etc.) und werden mit geeigneten Bildverarbeitungsmethoden vorverarbeitet.
Das schließlich auf ein CAD/CAM-System exportierte dreidimensionale Drahtgittermodell kann mit hoher Präzision von einem 3D-Drucker, einer CNC-Fräse oder einem anderen Gerät zur dreidimensionalen Formgebung in ein 3D-Modell des Bioreaktors umgesetzt werden.
Hierbei wird der Bioreaktor direkt aus elastischem bio-kompatiblen Material (Elastomere, z.B. Silikone) hergestellt oder das 3D-Modell dient als Form für den Abguss. Ausgehend von dreidimensionalen Patientendaten (CT, MRT, weitere Modalitäten) wird- nach entsprechender Vorverarbeitung der Rohdaten - mittels eines CAD/CAM- Systems ein dreidimensionales Drahtgittermodell mit entsprechender räumlicher Auflösung in der jeweiligen Form des benötigten Gewebes erzeugt. Die Geometriedaten des Drahtgittermodells werden danach in ein adäquates System zur dreidimensionalen Formgebung (3D-Drucker, CNC-Fräse etc.) geladen und der Bioreaktor wird auf diese Weise mit sehr hoher Präzision hergestellt.
Entweder erfolgt die Herstellung des Bioreaktors direkt, oder es wird zunächst die Form für den Abguss des Bioreaktors mit einem entsprechenden Material hergestellt. Es können sowohl einmalig, als auch mehrmalig, d. h. wieder verwendbare Bioreaktoren hergestellt werden. Fig. 1 A bis C zeigen Varianten des elastischen Bioreaktors für die Herstellung von Geweben mit einer elastischen Hülle 1 in Defektform. Eine weitere alternative Möglichkeit ist die formgenaue Umhüllung 1 von Gerüsten
(scaffolds), z.B. durch Tiefziehung oder Beschichtung mit geeigneten Kunststoffen. Dabei wird die Form durch das scaffold 4 vorgegeben, d.h. dieses ist ggf. mittels CAD/CAM nach den Bilddaten des Defekts hergestellt worden. Anschlüsse 2 und Zuflüsse 3 werden an diese Umhüllung 1 eingearbeitet, Leitungssysteme können in diesem Falle in das Gerüst eingearbeitet sein. Nach dem Umhüllen und Anbringen der Anschlüsse ist der Bioreaktor einschließlich des umhüllten Gerüstes für den einmaligen Einsatz einsatzfähig. Die Pfeile in Fig 1 A bis C an der Einlassöffnung 2 und der Auslassöffnung 3 zeigen die Richtung der Mediumperfusion.
Auf entsprechende Anschlüsse für Monitoring- und Perfusionssysteme, sowie Kraftübertragungspunkte für mechanische Belastungen wird bereits in der Planungsphase des Bioreaktors Rücksicht genommen und diese werden im CAD/CAM- System in das dreidimensionale Drahtgittermodell eingearbeitet.
In derselben Form können Leitungssysteme, Hohlfasersysteme, oder Negativformen für Leitungssysteme, die nach Entfernung durchströmbare Kanäle hinterlassen, mit in den Hohlraum oder die Wandungen eingearbeitet werden.
Beispiel 2 - Implementierung von versorgenden Gefäßen (Fig. 1 A bis C)
Möglichkeiten, ein versorgendes Gefäß- oder Leitungssystems in das Gewebe einzubauen, bestehen durch den Einbau präformierter Hohlfaser- oder Leitungssysteme, durch das Tissue Engineering von Gefäßen oder eine Kombination von beidem. So wäre es beispielsweise möglich, ein Leitungssystem durch ein Abgussverfahren herzustellen. Drähte 6 aus einem geeigneten, glatten Material werden in dem Bioreaktor verlegt und verbinden die Einlassöffnung 2 mit der Auslassöffnung 3. Die Befüllung des Bioeraktors erfolgt mit Partikeln eines Trägermaterials, das mit den Zellen des Zielgewebes besiedelt wurde (bewachsene Mikroträger). Diese sind zunächst separat kultiviert worden, bis die Zellen (Stammzellen, vordifferenzierte oder differenzierte Zellen) eine gewisse Dichte erreicht haben. Sie werden dann zusammen mit Fibrin in den Bioreaktor gegeben, das durch Zugabe von Thrombin polymerisiert, so dass die bewachsenen Mikroträger / Partikel eines Trägermaterials ggf. in einer Fibrinmatrix vorliegen. Ggf. können auch Endothelzellen zugegeben werden, so dass sich ein kapillarartiges System ausbilden kann. Die Drähte 6 werden entfernt und es verbleiben Leitungen, Röhren oder Kanäle vom Einlass 2 bis zum Auslass 3, über die die Perfusion mit Medium erfolgen kann. (Fig. 1 A zeigt einen Bioreaktor für die Herstellung von Gewebe mit herausnehmbaren Drähten als Platzhalter für Kanäle und Leitungen). Ggf. ist eine zusätzliche Besiedlung der Kanäle mit Gefäßwandzellen (glatte Muskelzellen, Endothelzellen) sequentiell möglich. Das Wachstum eines Gefäßsystems wird ggf. durch die hydrodynamische Belastung, welche aufgrund der pulsatilen Perfusion auf die nahe Umgebung die artifiziellen Gefäßwände einwirkt, gefördert. Dieses mittels Tissue Engineering hergestellte, artifizielle, Blutgefäßsystem und dessen sich während der Kultivierungsperiode entwickelnde Gefäßaussprossungen übernehmen die Verteilung des Perfusionsmediums und somit die Versorgung des umliegendes Gewebes.
Alternativ ist es auch möglich, ein präformiertes, ggf. resorbierbares Hohlfasersystem 5 zu verlegen, dass dann als Rohrsystem für die Versorgung dient (Fig. 1 B, elastischer Bioreaktor für die Herstellung von Gewebe unter Verwendung eines Hohlfasersystems). Das in den Bioreaktor integrierte resorbierbare oder permanente Hohlleitungssystem 5 bzw. die Verteilung über das poröse Gerüst übernimmt zunächst die Versorgung des Gewebes, ggf. bis sich dieses aufgrund der Herausbildung eines eigenen Gefäßsystems versorgen kann oder bis es implantiert wird. Es wird später resorbiert und durch Gefäße ersetzt oder funktionslos resorbiert, wenn die Durchblutung über kollaterale Blutversorgung nach Transplantation ausreicht.
Es ist des Weiteren möglich, lediglich ein poröses Gerüst (scaffold) 4, zu verwenden, dessen Poren durch das Nähr-Medium durchströmt werden. Fig. 1 C zeigt einen elastischen
Bioreaktor zur Herstellung von Gewebe unter Verwendung eines porösen Gerüsts zur Mediumverteilung. Ggf. können Kanäle und Leitungen 7 (mit größerem Poren- bzw. Kanaldurchmesser), ggf. aus resorbierbarem Material eingearbeitet werden, so dass auch bei Proliferation der Zellen eine Durchströmung erhalten bleibt, und eine Besiedlung mit den Gefäß wandzellen möglich ist, so dass sich Gefäße ausbilden können. Die in Figur 1 C im Inneren ersichtlichen Pfeile zeigen die Fließrichtung des Mediums in dem porösen Gerüst an.
Beispiel 3 - Bioreaktor für Weichgewebeersatz (Fig. 1 C)
Von dem zu versorgenden Weichgewebedefekt wird ein virtuelles 3 D-Modell erzeugt, auf dessen Grundlage ein formgenaues Gerüst (Scaffold) 4 (weichbleibend) mittels CAD/CAM
Techniken hergestellt wird. Das Gerüst ist porös und enthält Kanäle 7 für die Perfusion, die an den vorberechneten Stellen für Einlass 2 und Auslass 3 münden. Durch die Porosität des
Gerüsts ist gewährleistet, dass sich von den Leitungen aus das Medium ausreichend im gesamten Gerüst verteilen kann. (Die in Figur 1 C im Innern ersichtlichen Pfeile zeigen die Fließrichtung des Mediums in dem porösen Gerüst an.)
Das Gerüst wird dann mit einem elastischen Kunststoff folienartig überzogen, z.B. durch Tiefziehen oder durch Beschichten (vorzugsweise Silikone). An den vorbestimmten Zuflüssen und Eintritten von Sonden werden vorgefertigte Anschlussstücke einpolymerisiert. Somit entsteht ein individueller Reaktor für einen individuellen Defekt. Die Besiedlung kann dann durch Beimpfung mit suspendierten Zellen (ggf. mehrfach) erfolgen, ggf. sequentiell (zuerst mesenchymale Zellen des Mesenchyms, dann Gefäßwand- und Endothelzellen für die Gefäße). Das Verfahren kann im Prinzip auf beliebige vaskularisierte Gewebe angewendet werden.
Beispiel 4 - Zusätzliche Integration von Vorrichtungen in die elastische Hülle (Kammerwandung) des Bioreaktors
Je nachdem welches Material bei der Herstellung des Bioreaktors Verwendung findet, wirkt sich dies auf die Transparenz der Kammerwandung aus. Deshalb kann es, insbesondere bei nicht oder nicht ausreichend transparenten Materialen, notwendig sein, Sichtscheiben für das optische Monitoring (Überwachung und Kontrolle) in die Wandung zu integrieren (siehe Beispiel durchsichtige Folie als Monitoringfenster 26 im experimentellen Bioreaktor nach Fig. 4a und 4b). Weiterhin können zusätzliche Vorrichtung zur Regulierung der lokalen oder gesamten Resilienz des Bioreaktorsystems auf Basis von z.B. hochelastischen, biokompatiblen Membranen in die Wandung integriert werden.
Das Monitoring (Überwachung und Kontrolle) der Wachstumsparameter im Inneren des Bioreaktors kann über ein einsprechendes Sondensystem erfolgen, welches über vordefinierte Anschlüsse in der Kammer installiert wird. Hierbei werden Stoffkonzentrationen und physikalische bzw. chemische Kenngrößen, wie z.B. O2- und CO2-Konzentration, Druck, Sauerstoffpartialdruck, pH-Wert, Viskosität, Fließgeschwindigkeiten und Temperatur, gemessen. Das Monitoring trägt außerdem aktiv zur Regulierung der Wachstumsbedingungen im Bioreaktorsystem bei, da es als Sensorik in den Regelkreis eingebunden ist.
Beispiel 5 - Herstellung eines Blutgefäßsystems mittels Tissue Engineering
Ein mittels Tissue Engineering hergestelltes, artifizielles, versorgendes Blutgefäßsystem und dessen sich während der Kultivierungsperiode entwickelnde Gefäßaussprossungen übernehmen die Verteilung des Perfusionsmediums und somit die Versorgung des umliegendes Gewebes.
Beispiel 6 - Herstellung von Blutgefäßen oder Blutgefäßnetzen, anderen Geweben (Fig.2a und b sowie 3a und b)
Die einfachste Geometrie liegt bei der Herstellung eines einzelnen Blutgefäßes vor. Hierbei besteht der Bioreaktor für die Herstellung eines Blutgefässes nach Fig. 2a und Fig. 2b lediglich aus einem zylinderförmigen elastischen Körper 8, der dem Außendurchmesser des Blutgefässes entspricht. An den Enden (Fig. 2) befinden sich jeweils Kupplungen / Anschlüsse 9, an denen das Gefäß / Gefäßäquivalent 10 (z.B. ein elastisches, resorbierbares Gerüstmaterial mit rohrförmiger Gestalt) eingespannt werden kann (Fig.2a). Es wird dabei auf Schlaucholiven 11 aufgeschoben und diese wiederum in einer Luer-Lock-Halterung auf den Anschluss 9 des Bioreaktors aufgesetzt, womit die Abdichtung erzielt wird (auf beiden Seiten). Dann kann das Konstrukt mit Medium perfundiert und mit Zellen besiedelt werden, wenn dies nicht bereits vor dem Einspannen geschehen ist (glatte Muskelzellen und/oder Vorläuferzellen und/oder Endothelzellen, ggf. sequentiell). Die Pfeile in Fig. 2a und Fig. 3a entsprechen der Richtung des Mediumflusses.
Perfundiert wird nach Möglichkeit mit einem pulsatorischen Perfusionsmodus, der die Blutdruckverhältnisse in natürlichen Gefäßen simuliert, bzw. langsam ansteigend bis von geringen Drücken bis zu physiologischen Drücken gesteigert. Dadurch bildet sich langsam eine natürliche, widerstandsfähige (gegen Druck) Gefaßwand aus, mit physiologischer Compliance etc. (In Figur 2a sind zwei Punktlinien eingezeichnet, welche die elastische Hülle 1 bei Auslenkung durch Perfusionsdruck (überzeichnet) darstellen.) In gleicher Art wird ein Blutgefäßnetz hergestellt, nur dass statt dem röhrenförmigen Konstrukt und Bioreaktor eine kompliziertere Geometrie eines verzweigten Netzwerks 12 entsprechend Fig. 3 verwendet wird. (Figur 3a zeigt in Aufsicht und Figur 3b im Querschnitt den elastischen Bioreaktor für die Herstellung eines Blutgefäßnetzes oder eines Blutgefäßnetzäquivalents.) Das grundsätzliche Vorgehen ist identisch.
Beispiel 7 - Herstellung eines vaskularisierten Gewebes mit kompartimentiertem Bioreaktor
Für manche Anwendungen ist es sinnvoll, nicht in einem Schritt das ganze Konstrukt herzustellen. Dies ist mit der kompartimentierten Version des Bioreaktors möglich. Zur Herstellung eines vaskularisierten Weichgewebes wird beispielsweise zunächst in einem Kompartiment das Blutgefäßnetz, wie in Beispiel 6 beschrieben, hergestellt und dann eine Trennwand zum zweiten sterilen, noch unbenutztem Kompartiment eröffnet. Dort wird dann das eigentliche Transplantatgewebe bzw. -äquivalent deponiert (als Gerüst mit Zellen, besiedelbares Gerüst oder Partikel, oder gerüstfrei mit Zellen), so dass es über das bereits vorhandene Gefäßnetz ernährt wird. Beispiel 8 - Anschluss und Betrieb des selbstregulierenden pulsatorischen Perfusionssystems
Ein selbstregulierendes pulsatorisch arbeitendes Perfusionssystem wird mit dem Bioreaktor bzw. mit dem in ihm etablierten Hohlleitungssystem verbunden und dient zur Simulation physiologischer oder experimenteller Druckverhältnisse.
Beispiel 9 - Anwendungen
Anwendungsmöglichkeiten für den erfindungsgemäßen Bioreaktor ergeben sich überall dort, wo die Interaktionen zwischen Gefäß und Stroma bzw. mesenchymalen oder anderen Geweben eine Rolle spielen. Dies sind viele Bereiche neben den bereits skizzierten Anwendungen in der regenerativen Medizin und beim Tissue engineering. Das System kann wie in den Vorbeispielen skizziert, analog zu den Gewebeäquivalenten bzw. artifiziellen Geweben genauso mit natürlichen, explantierten Geweben und Gefäßen betrieben werden. Damit ergibt sich ein breiter Anwendungsbereich. Dies können beispielsweise grundlagenorientierte Untersuchungen insbesondere in der Erforschung von Kreislauferkrankungen sein, aber auch vieler Stoffwechselstörungen, wie z.B. Adipositas, bei der das Wechselspiel von Gefäßen und Fettzellen eine wesentliche Rolle spielt. Weiterhin kann es als Metastasenmodell in der onkologischen Forschung nützlich sein. Fragen zur Wundheilung können damit beantwortet werden, und es kann auch als Angiogenesemodell in der Grundlagenforschung verwendet werden. Ein wesentlicher Zweig ist auch die Anwendung in der Testung von Pharmaka, z.B. die Testung des Übertritts von Pharmaka in das Interstitium oder andere Fragestellungen. Hier kann und bei anderen Anwendungen kann es auch als Ersatz für Tierversuche angewendet werden.
Beispiel 10 - Variante für experimentelle Zwecke (Fig. 4a und 4b)
Eine miniaturisierte Ausführungsvariante für experimentelle Anwendungen, bei der ein Gefäßäquivalent oder Blutgefäß 10 zusammen mit einem Gewebeabschnitt (Kontrukt/Gewebestück) 21 so kultiviert wird, dass er einem umfassenden Monitoring (Überwachung und Kontrolle) unterworfen werden kann, wird im Folgenden beschrieben (Fig.4a und b). Sie besteht darin, dass eine schlanke Halterung 14 in die Kammerwandung integriert ist und die beiden Stirnseiten verbindet, an deren Enden(der Halterung) jeweils Anschlüsse 16.1 und 16.2 befestigt sind, die zum Anschluss eines Blutgefässes oder Blutgefäßäquivalents dienen. Der Anschluß 16.2 am Zufluss 2 muss so gestaltet werden, dass das Gefäß/Gefäßäquivalent 10 durch die große Öffnung für Beladung und Zusammenbau 17, mit Schraubverschluß 25, steril eingeführt und an der Stirnseite 18.2 angekuppelt werden kann. Dazu ist die Stirnseite 18.2 mit einer kleineren Öffnung mit einem Flansch versehen, durch den von außen eine Kupplung 19 mit einer Schlaucholive eingeführt werden kann, auf der das Gefäß/Gefaßäquivalent 10 fixiert wird. Diese Kupplung 19 wird z.B. mit Luer-Lock Prinzip flüssigkeitsdicht an dem Flansch befestigt und fixiert das Gefäß/Gefaßäquivalent. Danach wird das Gefäß/Gefäßäquivalent an dem Anschluß 16.1 (z.B. Schlaucholive) befestigt. Die Leitung für den Abfluss 3 wird in der Halterung 8 oder an ihr entlang geführt (14.1). Somit wird ein röhrenförmiges Konstrukt perfundiert, alle anderen Merkmale der Kammer bleiben erhalten. Es kann auf diese Art und Weise ein Blutgefäß mittels Tissue Engineering hergestellt werden oder simuliert werden, dass in direktem Kontakt zu einem versorgten Gewebeabschnitt (Konstrukt/Gewebestück) 21 steht. Dadurch können zum Beispiel die Bedingungen untersucht werden, unter denen es zum Einwachsen von Aussprossungen (kleinen Blutgefäßen) von dem zentralen Gefäß in das anhängende Gewebe kommt. Wenn man statt mittels Tissue Engineering hergestellter Konstrukte menschliche oder tierische Blutgefäße oder Gewebe nimmt, kann man auch physiologische oder pathologische Prozesse in vitro untersuchen, die bislang nur Tierversuchen vorbehalten waren. Dies gilt vorzugsweise für pathologische und physiologische Prozesse an Gefäßen oder am Kreislaufsystem, für die Adipositasforschung und für die Testung pharmakologischer Substanzen, bei denen die Interaktionen zwischen Blutgefäßen und Gewebe eine Rolle spielen.

Claims

PATENT ANSPRÜCHE
1. Perfundierbarer Bioreaktor zur Herstellung von menschlichen oder tierischen Geweben oder Gewebeäquivalenten durch Kultivierung auf einem im Innenraum angeordneten Konstrukt, wobei der Innenraum von einer Hülle (1) umschlossen ist und zumindest einen Einlass (2) und einen Auslass (3) für ein flüssiges Nähr- Medium besitzt, der Bioreaktor mit einer Einheit zur Erzeugung eines
Perfusionsdrucks des Nähr-Medium verbindbar ist, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein Teilsegment dieser Hülle (1) aus elastischem Material besteht.
2. Bioreaktor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das elastische Teilsegment mehr als 50% der inneren Oberfläche der Hüllenoberfläche beträgt, besonders bevorzugt mehr als 75%.
3. Bioreaktor nach Anspruch 1 gekennzeichnet dadurch, dass er perfundierbare resorbierbare oder nicht resorbierbare poröse Gerüste, Leitungssysteme, Hohlfasersysteme für die Verteilung des Kulturmediums im herzustellenden Gewebe oder Gewebeäquivalent enthält, oder eine Kombination mindestens zweier dieser Einrichtungen.
4. Bioreaktor nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass das in den Innenraum eingebrachte Konstrukt durch das Nähr-Medium durchströmbar ist.
5. Bioreaktor nach Anspruch 1 gekennzeichnet dadurch, dass die innere Kontur des Innenraums zu mindestens 50%, bevorzugt 70%, besonders bevorzugt 100% der äußeren Kontur des herzustellenden Gewebes oder Gewebeäquivalents vorgibt.
6. Bioreaktor nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass er ein Gerüst enthält, dass kongruent geformt den Innenraum ausfüllt.
7. Bioreaktor nach Anspruch 1 gekennzeichnet dadurch, dass dieser als Einheit in Verbindung mit einem selbstregulierenden pulsatorischen Perfusionssystem betrieben wird.
8. Bioreaktor nach Anspruch 1 gekennzeichnet dadurch, dass das physikalische Druck-Belastungsregime, welches im Innenraum erzeugbar ist, dem physikalischen
Druck-Belastungsregime entspricht, welches unter normalen physiologischen oder pathologischen Bedingungen im lebenden menschlichen oder tierischen Organismus auf die hergestellten Gewebe, Gewebeäquivalente, Blutgefäße oder Blutgefäßnetze einwirkt.
9. Bioreaktor nach Anspruch 1 gekennzeichnet dadurch, dass die Elastizität dieses elastischen Materials des Teilsegmentes so einstellbar ist, dass die Dehnung von Gewebe oder Gewebeäquivalent zusammen mit der Dehnbarkeit der Hülle durch den im Innenraum erzeugten Perfusionsdruck den physiologischen oder pathologischen Werten der Gewebecompliance des herzustellenden Gewebes entspricht.
10. Bioreaktor nach Anspruch 1 gekennzeichnet dadurch, dass bereits zu Beginn des Fertigungsprozesses, besonders bevorzugt bei Erstellung der Vorlage mit einem CAD/CAM-System, Anschlüsse und Vorrichtungen für ein Monitoring berücksichtigt und eingearbeitet worden sind.
1 1. Bioreaktor nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass der Innenraum in verschiedene, mindestens zwei, Kompartimente aufgeteilt ist, die über eigene Durchströmungskreisläufe verfugen und durch herausnehmbare oder nicht herausnehmbare Trennwände unterteilt sind.
12. Bioreaktor nach Anspruch 1 gekennzeichnet dadurch, dass eine Sichtscheibe zum optischen oder funktionellen Monitoring direkt in die elastische Hülle eingebracht ist.
13. Bioreaktor gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass dieser Bioreaktor für den einmaligen Gebrauch( Einwegreaktor) verwendbar ist.
14. Bioreaktor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die innere Kontur des Biorektors durch Umhüllen eines Gerüstes erzeugbar ist, wobei das Gerüst nach dem zu versorgendem Defekt geformt ist.
15. Verfahren zur Herstellung von menschlichen oder tierischen Geweben oder Gewebeäquivalenten unter Verwendung eines Bioreaktors gemäß zumindest einem der Ansprüche 1 bis 14.
16. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Herstellung eines Gewebeäquivalentes durch Füllung des Hohlraums mit einem partikulären, vorzugsweise resorbierbaren Trägermaterial erfolgt, das mit humanen oder tierischen Zellen, vorzugsweise mesenchymalen Zellen vorbesiedelt ist.
17. Verfahren gemäß Anspruch 15, gekennzeichnet dadurch, dass zusätzlich zu den mesenchymalen Zellen Endothelzellen zugegeben werden.
18. Verfahren gemäß Anspruch 15, gekennzeichnet dadurch, dass die Partikel bzw. Endothelzellen in einer Fibrinmatrix zugegeben werden.
19. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren zumindest folgende Schritte mit umfasst: das Konstrukt wird in den Innenraum des
Bioreaktors eingebracht und der verbliebene Hohlraum des Innenraumes wird mit flüssiges Nähr-Medium gefüllt und über Zufluss und Abfluss mit einem Nähr- Medium perfundiert.
20. Verfahren nach Anspruch 15, gekennzeichnet dadurch, dass sie zumindest teilweise durch Füllung des Hohlraums mit einem partikulären, vorzugsweise resorbierbaren
Trägermaterial erfolgt, das mit humanen oder tierischen Zellen, vorzugsweise mesenchymalen Zellen vorbesiedelt ist.
21. Verfahren nach Anspruch 15, gekennzeichnet dadurch, dass zusätzlich zu den mesenchymalen Zellen Endothelzellen zugegeben werden.
22. Verfahren nach Anspruch 15, gekennzeichnet dadurch, dass die Partikel oder Endothelzellen in einer Fibrinmatrix zugegeben werden.
23. Verfahren nach Anspruch 15, gekennzeichnet dadurch, dass die Herstellung über ein Gerüst erfolgt, das formgenau von der elastischen Hülle umgeben ist und durch seine Porosität oder Leitungsstrukturen durchströmbar ist.
24. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Konstrukt mit einem physikalischen Druck-Belastungsregime beaufschlagt wird, welches einem physikalischen Druck-Belastungsregime entspricht, das unter normalen
Lebensbedingungen im lebenden menschlichen oder tierischen Organismus auf das hergestellte Gewebe einwirkt, wobei das flüssige Nähr-Medium über einen Einlass in den Innenraum mit Überdruck und pulsierend eingebracht wird und zumindest über einen Auslass den Innenraum verlässt.
25. Verfahren zur Herstellung eines artifiziellen, versorgenden, mittels Tissue Engineering hergestellten Blutgefäßsystems, welches während der Kultivierungsperiode Gefäßaussprossungen entwickelt und dadurch die Verteilung des Perfusionsmediums oder die Versorgung des umliegendes Gewebes übernimmt, wobei zur Herstellung ein Biorektor gemäß zumindest einen der Ansprüche 1 bis 14 verwendet wird.
26. Verfahren zur Herstellung eines Bioreaktors gemäß zumindest eines der Ansprüche 1 bis 14.
27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass er nach Bildgebungsdaten eines gegebenen zu versorgenden Defekts mittels CAD/CAM Technologien hergestellt wird.
28. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass bereits zu Beginn des Fertigungsprozesses, nämlich bei Erstellung der Vorlage mit einem CAD/CAM- System, Anschlüsse, Kupplungen und Schnittstellen für Mediumführung oder für Mediumführung und Monitoring berücksichtigt und eingearbeitet worden sind.
29. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Herstellung zumindest teilweise durch Überzug, nämlich Tiefziehen oder Beschichtung eines individuellen Gerüstes erfolgt.
30. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass es den Einbau von Hohlfasersystemen, Leitungssystemen oder Gerüststrukturen im B ioreaktorinnenraum beinhaltet.
31. Verfahren zur Herstellung eines resorbierbaren, temporären Hohlfasersystems aus einem Gemisch verschiedener resorbierbarer, biokompatibler Materialien für die Versorgung des kultivierten Gewebes mit Sauerstoff und Nährstoffen in einem Biorektor gemäß zumindest eines der Ansprüchen 1 bis 14.
32. Hohlfasersystem hergestellt nach einem Verfahren zur Herstellung eines resorbierbaren, temporären Hohlfasersystems gemäß Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass das resorbierbare, temporäre Hohlfasersystem an die Form des Bioreaktors, und damit an das herzustellende Gewebe, räumlich angepasst ist und über Anschlüsse an ein Perfusionssystem verfügt.
33. Verwendung von einem Bioreaktor gemäß zumindest einem der Ansprüche 1 bis 14 für die Herstellung menschlicher oder tierischer Gewebe oder Gewebeäquivalenten (Gerüst-Zell-Kombinationen) für therapeutische Zwecke.
34. Verwendung von einem Bioreaktor gemäß zumindest einem der Ansprüche 1 bis 14 für die experimentelle Herstellung menschlicher oder tierischer Gewebe oder Gewebeäquivalenten (Gerüst-Zell-Kombinationen) .
35. Verwendung von einem Bioreaktor gemäß zumindest einem der Ansprüche 1 bis 14 für die Herstellung vaskularisierter Gewebe.
36. Verwendung von einem Bioreaktor gemäß zumindest einem der Ansprüche 1 bis 14 für die Herstellung von Weichgewebe oder Weichgewebsäquivalenten.
37. Verwendung von einem Bioreaktor gemäß zumindest einem der Ansprüche 1 bis 14 für die Herstellung von Blutgefäß- oder Blutgefaßäquivalenten.
38. Verwendung von einem Bioreaktor gemäß zumindest einen der Ansprüche 1 bis 14 für die Herstellung von Blutgefäßnetzen oder Blutgefäßnetzäquivalenten.
39. Verwendung von einem Bioreaktor gemäß zumindest einem der Ansprüche 1 bis 14 für die Herstellung von Hartgewebe oder Hartgewebsäquivalenten.
40. Verwendung von einem Bioreaktor gemäß zumindest einem der Ansprüche 1 bis 14 für die Herstellung von kombinierten Geweben aus Weichgewebe und/oder Hartgewebe und/oder Blutgefäße.
41. Verwendung eines Bioreaktors gemäß zumindest einem der Ansprüche 1 bis 14 für die Testung pharmakologischer Substanzen
42. Verwendung eines Bioreaktors gemäß zumindest einem der Ansprüche 1 bis 14 für die Testung pharmakologischer Substanzen auf dem Gebiet der Kreislauf- und Adipositasforschung.
43. Verwendung eines Bioreaktors gemäß zumindest einem der Ansprüche 1 bis 14 für onkologische Fragestellungen, insbesondere Metastasierung oder Testung pharmakologischer Substanzen.
44. Verwendung eines Bio reaktors gemäß zumindest einem der Ansprüche 1 bis 14 für den Ersatz von Tierversuchen.
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