JP6619345B2 - 人工三次元組織の製造方法、人工三次元組織灌流デバイス、人工三次元組織を用いた薬剤評価方法 - Google Patents
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Description
本願は、2014年9月23日に出願された米国特許仮出願62/054,066号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
本実施形態では、人工三次元組織として人工皮膚組織を製造する例を用いて説明する。
なお、以下の実施の実施形態は、本発明の一態様を示すものであり、この発明を限定するものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で任意に変更可能である。また、以下の図面においては、各構成をわかりやすくするために、実際の構造と各構造における縮尺や数等を異ならせている。
まず、本発明に係る人工皮膚組織について、図1を参照して説明する。
図1は、人工三次元組織である人工皮膚組織1を模式的に示した斜視断面図である。
人工皮膚組織1は、真皮組織層10と表皮層20とを含む。人工皮膚組織1は、真皮組織層10と表皮層20とが積層された方向(図1における上下方向、以下、積層方向と称する)と直交する平面に沿った所定方向(図1における左右方向、以下、第1方向と称する)に延びて形成されている。
次に、上記の人工皮膚組織1を製造する人工皮膚組織製造装置について、図2乃至図5を参照して説明する。
図2は、人工皮膚組織製造装置30の概略的な構成図である。
図3は、灌流デバイス40の第1実施形態の外観斜視図である。
灌流デバイス40は、培養槽41、コネクタ(支持部)42およびワイヤー(線状部材、流路形成部材)43を備えている。培養槽41は、側壁44に囲まれた上部が開口する培養空間45と、底壁(底部)46に設けられた底板47を備えている。側壁44は、平面視で矩形状に設けられている。底壁46は、鉛直方向に貫通する開口部46aと、底面46bに設けられた溝部46cとを有している。溝部46cは、第1方向に延在して設けられ両端部において培養皿50の内部空間に開口している。底板47は、培養槽41に取り付けおよび取り外し自在である。底板47は、培養槽41の底壁46に取り付けられたときに開口部46aを閉塞する。
次に、人工皮膚組織1の製造方法について、図6乃至図20を参照して説明する。
本発明に係る人工皮膚組織(人工三次元組織)1の製造方法は、真皮組織層10上に表皮層20が形成され第1方向(所定方向)に延びる人工皮膚組織1の製造方法であって、側壁44に囲まれた培養空間45を有する培養槽41と、対向する側壁44を貫いて培養空間45に所定方向に沿って懸架されたワイヤー(線状部材、流路形成部材)43とを備えた灌流デバイス(人工三次元組織灌流デバイス、デバイス)40を準備することと、培養空間45で細胞外マトリックス成分11中の真皮細胞12を培養して、ワイヤー43が貫く真皮組織層10を形成することと、真皮組織層10からワイヤー43を抜去して真皮組織層10を貫通する灌流流路13を形成することと、真皮組織層10上に表皮細胞21を配置し灌流流路13に培地Mを灌流させながら、表皮層20を形成することと、を含む。また、本発明に係る人工皮膚組織1の製造方法は、対向する側壁44にそれぞれ設けた係合部42cに細胞外マトリックス成分11を係合させて所定方向への収縮を抑えながら真皮組織層10を形成することを含む。
図6乃至図20においては、適宜、灌流デバイス40のみを図示し、培養皿50、ポンプ60等の図示を省略している。
灌流デバイス40の準備としては、図6に示すように、上記の培養槽41の対向する側壁44に貫通孔42dが同軸となるようにコネクタ42を装着するとともに、底壁46に底板47を取り付けて開口部46aを閉塞する。同軸となっている貫通孔42dにワイヤー43を挿通し、培養空間45にワイヤー43を懸架させる。
灌流デバイス40の準備が完了すると、真皮組織層10を形成する。
真皮組織層10の形成は、まず、図7に示すように、細胞外マトリックス成分11と真皮細胞12との混合物を培養槽41の培養空間45に注ぎ込む。混合物は、ワイヤー43が浸漬される高さとなる量で注ぎ込まれる。本実施形態では、細胞外マトリックス成分11としてコラーゲンが用いられている。
次に、コネクタ42に支持されているワイヤー43を抜去する。これにより、図9に示すように、真皮組織層10には、第1方向に延びる空洞である灌流流路13が形成される。このとき、真皮組織層10は、両端部において係合部42cに係合しているため、ワイヤー43の抜去時にコネクタ42から脱離することなく安定してコネクタ42に支持される。
次に、表皮層20を形成するための準備を行う。
図11に示すように、培養槽41の底壁46から底板47を取り外すとともに、図2に示したように、培養槽41を培養皿50の内部に載置する。次いで、第1方向の一方側のコネクタ42の接続部42bに配管61を接続し、第1方向の他方側のコネクタ42の接続部42bに配管63を接続する。各側の接続部42bに接続する配管61または配管63については3つのコネクタ42全てに接続してもよいし、一部のみに接続してもよい。
本発明は、さらにその他の態様として、本発明の人工皮膚組織1を用いた薬剤の皮膚に対する刺激性を評価する方法に関する。本発明における薬剤とは、医薬品等の薬物、化粧品や医薬部外品等を含む。1本発明の評価方法によれば、例えば、従来の方法と比較して実際の皮膚に近い環境で薬剤の評価を行うことができる。また、本発明の評価方法は、例えば、新薬の創出(スクリーニング)等における各種分子量の薬物の動態評価、化粧品や医薬部外品等の開発における評価において極めて有用である。
図13は、上述の製造方法により製造された人工皮膚組織1を示す図である。この図に示されるように、コネクタ42によって第1方向および第2方向の収縮が抑制された状態の人工皮膚組織1が得られた。
続いて、灌流デバイス40Aの第2実施形態について、図21乃至図27を参照して説明する。
これらの図において、図1乃至図20に示す第1実施形態の構成要素と同一の要素については同一符号を付し、その説明を省略または簡略化する。
第1実施形態では平面状の人工皮膚組織1を製造する場合を例示したが、第2実施形態では、断面形状が曲面の人工皮膚組織1を製造する例を用いて説明する。
他の構成は、上記第1実施形態の灌流デバイス40と同様である。
続いて、上記の灌流デバイス40Aを用いて人工皮膚組織1を製造する方法について説明する。ここでは、灌流デバイス40Aの準備は完了しているものとして説明する。
まず、真皮組織層10を形成するために、図23に示すように、細胞外マトリックス成分11と真皮細胞12との混合物を培養槽41の培養空間45に注ぎ込む。混合物は、ワイヤー43が浸漬される高さとなる量で注ぎ込まれる。
Claims (15)
- 所定方向に延びる人工三次元組織の製造方法であって、
側壁に囲まれた培養空間を有する培養槽と、対向する前記側壁を貫いて前記培養空間に前記所定方向に沿って懸架された流路形成部材と、前記対向する側壁にそれぞれ設けられ前記流路形成部材が挿通される貫通孔を有し前記側壁を貫通する支持部であって、前記培養槽の外側で培地供給管または培地排出管に接続され、前記培養槽の内側の前記培養空間で前記流路形成部材を取り付けおよび取り外し自在に支持する前記支持部とを備えたデバイスを準備することと、
前記培養空間で細胞を培養して、前記流路形成部材が貫く前記人工三次元組織を形成することと、
前記人工三次元組織から前記流路形成部材を抜去して前記人工三次元組織を貫通する灌流流路を形成することと、
を含み、
前記支持部は、前記貫通孔を有し前記側壁に貫通して装着されている筒状の装着部と、前記培養槽の内側の前記装着部に設けられ前記人工三次元組織の一部を係合して前記所定方向への収縮を抑える係合部とを有し、
前記係合部は、前記装着部の外周面の直径よりも大きい直径の内周面及び外周面を有する、前記装着部と同軸の筒状の第2筒部と、前記装着部の周方向に間隔をあけて複数配置され前記第2筒部の内周面と前記装着部の外周面とを接続するリブ部とを有し、
前記第2筒部及び前記リブ部は、それぞれ前記培養空間の中心とは逆側で前記培養空間を介して前記側壁と対向し、
前記係合部のうち、前記培養空間を介して前記側壁と対向する前記第2筒部及び前記リブ部は、前記所定方向の中央側から前記人工三次元組織の一部と係合することを特徴とする人工三次元組織の製造方法。 - 前記第2筒部及び前記リブ部が前記中央側から前記人工三次元組織の一部と係合する前記所定方向の位置は、前記流路形成部材が前記培養空間に露出する前記所定方向の位置よりも外側であることを特徴とする請求項1に記載の人工三次元組織の製造方法。
- 前記人工三次元組織を形成することにおいては、前記培養空間で細胞外マトリックス成分と細胞との混合物を培養し、
前記支持部の前記培養空間に露出する領域に前記細胞外マトリックス成分に対する親液化処理が施されていることを特徴とする請求項1または2に記載の人工三次元組織の製造方法。 - 前記培養槽の底部に、前記所定方向に延びる曲面部を設け、
前記人工三次元組織を前記曲面部上に形成することを特徴とする請求項1から3のいずれか一項に記載の人工三次元組織の製造方法。 - 前記曲面部は、生体モデルの一部であることを特徴とする請求項4記載の人工三次元組織の製造方法。
- 前記灌流流路の表面に血管系細胞を培養して管腔層を形成することを含むことを特徴とする請求項1から5のいずれか一項に記載の人工三次元組織の製造方法。
- 前記培養槽の底部に設けた開口部を開放して前記培養槽を培養皿に載置することと、
前記灌流流路を灌流し前記開口部を介して前記培養皿に溜まった培地を回収することとを含むことを特徴とする請求項1から6のいずれか一項に記載の人工三次元組織の製造方法。 - 前記人工三次元組織を形成することは、細胞外マトリックス成分中の真皮細胞を培養して、前記流路形成部材が貫く真皮組織層を形成することと、
前記真皮組織層から前記流路形成部材を抜去して前記真皮組織層を貫通する灌流流路を形成することと、
前記真皮組織層上に表皮細胞を配置し前記表皮層を形成することと、
を含むことを特徴とする請求項1から7のいずれか一項に記載の人工三次元組織の製造方法。 - 前記灌流流路に培地を灌流させながら前記表皮層を培養することを特徴とする請求項8記載の人工三次元組織の製造方法。
- 請求項1から9のいずれか一項に記載の製造方法で人工三次元組織を製造することと、
薬剤を前記人工三次元組織に接触させることと、
前記薬剤の接触による刺激に対する前記人工三次元組織の応答を測定することと、
を含むことを特徴とする人工三次元組織を用いた薬剤評価方法。 - 所定方向に延びる人工三次元組織に灌流が行われる人工三次元組織灌流デバイスであって、
側壁に囲まれた培養空間を有する培養槽と、
対向する前記側壁を貫いて前記培養空間に前記所定方向に沿って懸架された流路形成部材と、
前記対向する側壁にそれぞれ設けられ前記流路形成部材が挿通される貫通孔を有し前記側壁を貫通する支持部であって、前記培養槽の外側で培地供給管または培地排出管に接続され、前記培養槽の内側の前記培養空間で前記流路形成部材を取り付けおよび取り外し自在に支持する前記支持部と、
を備え、
前記支持部は、前記貫通孔を有し前記側壁に貫通して装着されている筒状の装着部と、前記培養槽の内側の前記装着部に設けられ前記人工三次元組織の一部を係合して前記所定方向への収縮を抑える係合部とを有し、
前記係合部は、前記装着部の外周面の直径よりも大きい直径の内周面及び外周面を有する、前記装着部と同軸の筒状の第2筒部と、前記装着部の周方向に間隔をあけて複数配置され前記第2筒部の内周面と前記装着部の外周面とを接続するリブ部とを有し、
前記第2筒部及び前記リブ部は、それぞれ前記培養空間の中心とは逆側で前記培養空間を介して前記側壁と対向し、
前記係合部のうち、前記培養空間を介して前記側壁と対向する前記第2筒部及び前記リブ部は、前記所定方向の中央側から前記人工三次元組織の一部と係合することを特徴とする人工三次元組織灌流デバイス。 - 前記第2筒部及び前記リブ部が前記中央側から前記人工三次元組織の一部と係合する前記所定方向の位置は、前記流路形成部材が前記培養空間に露出する前記所定方向の位置よりも外側であることを特徴とする請求項11記載の人工三次元組織灌流デバイス。
- 前記培養空間では、細胞外マトリックス成分と細胞との混合物が培養され、
前記支持部の前記培養空間に露出する領域に前記細胞外マトリックス成分に対する親液化処理が施されていることを特徴とする請求項11または12に記載の人工三次元組織灌流デバイス。 - 前記培養槽の底部に、前記所定方向に延びる曲面部が設けられ、
前記人工三次元組織は前記曲面部上に配置されることを特徴とする請求項11から13のいずれか一項に記載の人工三次元組織灌流デバイス。 - 前記曲面部は、生体モデルの一部であることを特徴とする請求項14記載の人工三次元組織灌流デバイス。
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