DE102004012010A1

DE102004012010A1 - Erfindung betreffend Bioreaktoren und Bioreaktorsysteme

Info

Publication number: DE102004012010A1
Application number: DE200410012010
Authority: DE
Inventors: Dirk Dipl.-Ing. Nehring; Peter Prof.Dr.-Ing. Czermak; Christian Dipl.-Ing. Weber (FH); Stephanie Dr.rer.nat. Gokorsch
Original assignee: Fachhochschule Giessen Friedberg
Current assignee: Technische Hochschule Mittelhessen 35390 Gies De; Technische Hochschule Mittelhessen De
Priority date: 2004-03-10
Filing date: 2004-03-10
Publication date: 2005-09-29
Also published as: WO2005087912A2; WO2005087912A3

Abstract

Es wird ein Bioreaktorsystem zur Druckstimulation von Zellen, Zell-Matrix-Kompositen oder anderen biologischen Proben bereitgestellt, bestehend aus einem Bioreaktor und einer Vorrichtung zur Druckstimulation, das vielseitige Anwendungsmöglichkeiten bezüglich der optimalen Versuchsparameter zur Kultivierung bzw. Züchtung von Zellen oder Zell-Matrix-Kompositen aufweist. Es zeichnet sich dadurch aus, dass die Stimulation der Zellen oder Komposite mit definiertem oder undefiniertem Druck erfolgen kann und Dauer und Frequenz der Druckstimulation frei programmierbar sind. Der Mediumwechsel und Probennahme erfolgen bei geschlossenem System und eine einfache Reinigung ist möglich. Das erfindungsgemäße Bioreaktorsystem weist zu dem Heiz- oder/und Kühlelemente und Pumpmittel sowie Sensoren und Regeleinheiten für pH-Wert, Temperatur und Druck auf und läuft wahlweise im Perfusions- (kontinuierlichen) oder batch-Betrieb.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur mechanischen programmgesteuerten Druckbelastung von Zellen, Zell-Matrix-Kompositen und/oder Gewebekulturen unter sterilen Bedingungen sowie damit aufgebaute Bioreaktoren und Bioreaktorsysteme. Die Herstellung von autologen Zellimplantaten als homogenes Zell-Biomaterial-Komposit ist ein vielversprechender Ansatz zur Rekonstruktion von zerstörten Gewebeteilen im Körper. Dazu ist es erforderlich, autologe Zellen beispielsweise Knorpelzellen in eine dreidimensionale Form zu bringen und das Komposit weiter zu kultivieren. Ziel ist es, reimplantierbare Gewebe mit besonders biokompatiblen Eigenschaften und hoher Stabilität herzustellen. Dazu ist es erforderlich, die Matrixsynthese der Gewebekulturen bei unterschiedlichen mechanischen Belastungen und Versorgungsbedingungen zu untersuchen.
Stand der Technik
Für die Druckstimulation von Zellen und Geweben sind bereits verschiedene Systeme im Stand der Technik bekannt. Dies sind z.B. die von Buschmann et al. (Buschmann MD, Gluzband YA, Grodzinsky AJ, Hunziger EB, Mechanical compression modulates matrix biosynthesis in chondrocyte/agarose culture 1995 Journal of Cell Science Vol. 108; 1497–1508), Mauck et al. (Mauck RL, Soltz MA, Wang CCB, Wong DD, Valhmu WB, Hung CT, Ateshian GA Influence of seeding density and dynamic deformational loading on the developing structure/function relationships of chondrocyte-seeded agarose hydrogels 2002 Annals of Biomedical Engineering Vol. 30, 1446–1456), Davisson et al. (Davisson T, Kunig S, Chen A, Sah R., Ratcliffe A, Static and dynamic compression modulate matrix metabolism in tissue engineered cartilage, 2002 Journal of Orthopaedic Research Vol. 20; 842–848) und Bonassar et. al. (Bonassar LJ, Grodzinsky AJ, Frank EH, Cavila SG, Bhaktav NR, Trippel SB, The effect of dynamic compression on the response of articular cartilage to insulin-like growth factor-I, 2001 Journal of Orthopaedic Research Vol. 19; 11–17) beschriebenen Apparaturen zur Druckstimulation, bei denen ein Kolben die Proben direkt belastet. Alternativ wird von Carver et al. (Carver SE, Heath CA, Increasing extracellular matrix production in regenerating cartilage with intermittent physiological pressure 1999 Biotechnology and Bioengineering Vol. 62; 166–174) eine Apparatur zur Druckstimulation verwendet, bei der ein Kolben auf das Medium wirkt und der Druck auf die Probe übertragen wird.
Folgende Bioreaktoren zur Kultivierung und Druckstimulation von Zell-Matrix-Kompositen sind bekannt:
Saini et. al. (Saini S, Wick M, Kenneth W, Concentric cylinder bioreactor for production of tissue engineered cartilage, 2002 Nethew International Symposium on Tissue Engineering, Atlanta GA, Oral Presentation) verwenden zur Druckstimulierung einen Reaktor, der einem konzentrischen Zylinder-Viskosimeter ähnelt, wobei ein äußerer Zylinder um einen inneren stationären Zylinder mit konischem Bo den rotiert. Zwischen den Zylindern befinden sich die Zell-Matrix-Komposite, auf die eine Scherbelastung ausgeübt wird. Die Scherbelastung ist von der Rotationsgeschwindigkeit des äußeren Zylinders und der Größe der Komposite abhängig. Der Spalt zwischen innerem und äußerem Zylinder beträgt 3 mm und bestimmt so den Durchmesser der Komposite. Nachteilig ist bei dieser Anordnung, dass es nur im batch-Vertahren und nicht kontinuierlich betrieben werden kann.
Kasra et al. (Kasra M, Goel V, Martin J, Wang ST, Choi W, Buckwalter J, Effect of dynamic hydrostatic pressure on rabbit intervertebral disc cells, 2003 Journal of Orthopaedic Research Vol. 21; 597–603) kultivieren und stimulieren die Zellen in einem Reaktor, bei dem der Druck über einen Stempel auf das Medium übertragen wird. Die in einer Gewebekulturplatte befindlichen Komposite werden zusammen mit dieser in die mediumgefüllte Hydraulikkammer gegeben. Mit einem Antrieb wird die gewünschte Kraft auf den Stempel übertragen und führt so zu dem Druckaufbau im Medium. Auch dieser Reaktortyp bietet keine Möglichkeit für einen kontinuierlichen Betrieb. Außerdem ist keine Konditionierung des Mediums durch Platzierung des Reaktors in einem Inkubator möglich, da die Hydraulikkammer gegenüber der Umgebung abgedichtet ist. Sehr nachteilig ist, dass das Medium bei diesem Typ häufiger gewechselt werden muss.
Der von Mauck et al. (Mauck RL, Soltz MA, Wang CCB, Wong DD, Valhmu WB, Hung CT, Ateshian GA, Functional tissue engineering of articular cartilage through dynamic loading of chondrocyte-seeded agarose gels, 2000 Journal of Biomechanical Engineering Vol. 122; 252–260) eingesetzte Bioreaktor besteht aus einer Petrischale, die die Funktion eines batch-Reaktors hat. Die in der Petrischale befindlichen Komposite werden durch einen Stempel mechanisch stimuliert, wobei der Stempel durch eine exzentrische Nockenwelle zyklisch ausgelenkt wird. Die Frequenz der Belastung ist somit von der Drehgeschwindigkeit der Nockenwelle abhängig. Der Reaktor wird in einem Inkubator platziert, wodurch das Medium konditioniert wird (Sauerstoffeintrag, pH-Regulierung bei Kohlensäure/Hydrogencarbonat-gepufferten Medien, Temperatur).
Diese Apparatur weist den Nachteil auf, dass durch den mechanischen Antrieb mittels einer Nockenwelle erhebliche Dichtungsprobleme auftreten, deren Lösung den gängigen Anforderungen an Sterilität kaum oder nur mit sehr hohem apparativen Aufwand gerecht werden. Darüber hinaus ist kein Perfusionsbetrieb möglich.
Im System von Domm et al. (Domm C, Fay J, Schünke M, Kurz B, Die Redifferenzierung von dedifferenzierten Gelenkknorpelzellen in Alginatkultur, 2000 Der Orthopäde Vol. 29; 91–99) und Hansen et al. (Hansen U, Schünke M, Domm C, Ioannidis N, Hassenpflug J, Gehrke T, Kurz B, Combination of reduced oxygen tension and intermittent hxdrostatic pressure: a useful tool in articular cartilage tissue engineering, 2001 Journal of Biomechanics Vol. 34; 941–949) werden Gewebekulturplatten mit den Kompositen in eine Arbeitskammer gegeben (max. 6 Gewebekulturplatten) und mit einem definierten Gasgemisch beaufschlagt. Der Gasdruck wird durch das in den Kavitäten der Zellkulturplatten befindliche Medium auf die Komposite übertragen. Das Gasgemisch wird durch Öffnen eines Ventils in die Arbeitskammer geleitet. Ist der Solldruck in der Arbeitskammer erreicht, wird das Ventil geschlossen. Am Ende der Belastungsphase wird das Gasgemisch bei geöffnetem Ventil mit einer Pumpe aus der Arbeitskammer in die Vorratskammer gepumpt. Am Ende der Entlastungsphase strömt das Gasgemisch wieder durch ein Ventil in die Arbeitskammer. Druckverluste werden durch den Drucksensor in der Arbeitskammer registriert und durch Zuleitung von Gasgemisch bis zum Erreichen des Sollwertes beseitigt. Ein Wasserbad am Boden der Arbeitskammer sorgt für eine konstante Temperatur. Die intermittierende hydrostatische Druckbelastung und die Regelung des Druckes werden durch ein Computerprogramm gesteuert. Allerdings ist bei diesem System kein kontinuierlicher Mediumaustausch in den Kavitäten der Gewebekulturplatten möglich.
Die von Handa et al. (Handa T, Ishihara H, Oshima H, Osada R, Tsuji H, Obata K, Effects of hydrostatic pressure on matrix synthesis and matrix metalloproteinase production in the human lumbar intervertebral disc, 1997 Spine Vol. 22; 1085–1091) und Hutton et al. (Hutton WC, Elmer WA, Boden SD, Hyon S, Toribatake Y, Tomita K, Hair GA, The effecf of hydrostatic pressure on intervertebral disc metabolism, 1999 Spine Vol 24; 1507–1515) beschriebenen Apparaturen werden zur statischen Druckapplikation eingesetzt. Ein mit Wasser gefülltes Druckgefäß enthält eine Plastik-Spritze, die als batch-Reaktor dient. In der Spritze befinden sich Medium und die Testkörper. Das Druckgefäß wird mit Stickstoffgas beaufschlagt. Der Druck wird über das Wasser auf den Spritzenkolben und durch diesen auf das Medium übertragen. Am Deckel der Apparatur befindet sich ein Manometer zur Messung des aufgebauten Druckes. Diese Apparatur ist nicht einfach zu steri lisieren und weist insgesamt einen sehr komplexen Aufbau auf. Weiterhin ist mit dieser Apparatur kein kontinuierlicher Betrieb möglich.
Nehring et al. (Nehring D, Adamietz P, Meeren NM, Pörtner R, Perfusion cultures and modelling of oxygen uptake with three dimensional chondrocyte pellets, 1999 Biotechnology techniques 13, 701–706) setzten ein System ein, bei dem die Proben in einer Kulturkammer mit 10 Wells, ähnlich einer Gewebekulturschale, kontinuierlich mit konditioniertem Medium versorgt werden. Eine Druckstimulation ist mit diesem System nicht möglich.
Aufgabe
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Bioreaktorsystem und eine Vorrichtung zur Druckstimulation bereitzustellen, das zur Kultivierung (Herstellung) und mechanischen Druckstimulation von Zellen und Zell-Matrix-Kompositen unter sterilen Bedingungen geeignet ist, ein hohes Maß an Variabilität hinsichtlich der Stimulation, Kultivierung und Handhabung aufweist und einfach zu reinigen ist.
Lösung der Aufgabe
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die Bereitstellung einer Vorrichtung zur Druckstimulation, die auf eine Gewebekulturplatte gesetzt ein neuartiges Bioreaktorsystem darstellt. Das Bioreaktorsystem gemäß der Ansprüche 10 bis 16 und die Vorrichtung zur Druckstimulation gemäß der Ansprüche 1–9 sind besonders einfach aufgebaut, leicht sterilisierbar und zur Kultivierung und mechanischen Druckstimulation von Zellen und Zell-Matrix-Kompositen geeignet.
Das Bioreaktorsystem besteht aus einem Bioreaktor und einer Vorrichtung zur Druckstimulation. Es zeichnet sich durch ein hohes Maß an Variabilität hinsichtlich der Stimulation, Kultivierung und Handhabung aus:

– Die Stimulation der Komposite erfolgt mit definiertem oder undefiniertem Druck
– Die mechanische Druckstimulation erfolgt mit Kolben bzw. Stempeln
– Die Stimulation wird wahlweise statisch und dynamisch durchgeführt
– Frequenz und Dauer der Druckbelastung sind frei programmierbar
– Der Austausch von Medium und Probennahme erfolgt bei geschlossenem System
– Einfache Reinigung und Sterilisierbarkeit
– Wahlweise Einstellung auf Perfusions- oder batch-Betrieb
– Messung des Stress-Relaxations-Verhaltens und/oder der Belastbarkeit der Komposite erfolgt während der Kultivierung im Reaktor
– Die Komposite werden getrennt mit Medium versorgt

Als Basis des Bioreaktors dienen handelsübliche Gewebekulturplatten (Fa. Techno Plastic Products, Trasadingen, Schweiz; Fa. Nunc, Wiesbaden, Deutschland; Fa. Böttger Bodenmais; etc.), die je nach Typ 6, 12 oder 24 Kavitäten besitzt. Auf diese Gewebekulturplatte wird eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur Druckstimulation mit Stempeln oder Kolben aufgesetzt. Diese Anordnung hat den Vorteil, dass in der Gewebekulturplatte gleichzeitig mehrere Komposite und/oder Zellproben und/oder Gewebproben kultiviert und druckstimuliert werden können.
In den Gewebekulturplatten sorgen Lochscheiben (20), vorzugsweise aus VA-Stahl oder Teflon, für eine genau definierte Kompression der Komposite und/oder Zellproben und/oder Gewebeproben, da durch die Lochscheiben der Abstand zwischen dem „Auflager" des Konstrukts (Boden der Kavität der Gewebekulturplatte) und dem Stempel (4–6) bestimmt wird. Weiterhin wird durch die Lochscheiben verhindert, dass die in den Löchern der Scheibe (19 und/oder 41) befindlichen Komposite aus dem Bereich der Stempel herausschwimmen und dadurch der Druckbelastung entgehen.
Die auf die Gewebekulturplatten aufgesetzte Vorrichtung zur Druckstimulation bietet darüber hinaus die Möglichkeit, bei geschlossenem System Medium auszutauschen und Proben des Mediums zu entnehmen. Die Prozessführung erfolgt alternativ im batch-Betrieb, bevorzugt jedoch kontinuierlich im Perfusionsbetrieb. Beim kontinuierlichen Betrieb ist zusätzlich ein externes Konditionierungsgefäß angeschlossen, in dem z.B. der Sauerstoffgehalt und der pH-Wert gemessen und reguliert wird. Dadurch herrschen im Bioreaktor konstante Verhältnisse, und inhibierende Stoffwechselprodukte werden ausgespült.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Druckstimulation besteht aus einer vorzugsweise rechteckigenGrundplatte (1), die auf eine Gewebekulturplatte (2) aufgesetzt wird. In der Grundplatte (1) befinden sich Bohrungen, so angeordnet, dass direkt über jeder Vertiefung (Well) der darunter liegenden Gewebekulturplatte eine Bohrung vorhanden ist. In die Bohrungen werden etwa T-förmige Kolben (3) mit diese umfassende Federelementen (7), eingesetzt, die wie ein Stempel (4–6) in die Kavität der darunter liegenden Gewebekulturplatte (2) ragen. Auf der rechteckigenGrundplatte (1) wird ein Deckel (8) mit einem Anschluss (9) für eine Druckbeaufschlagung, z. B. durch einen Druckluftschlauch aufgesetzt. Die rechteckigeGrundplatte (1) und der Deckel (8) werden so aufeinander gesetzt, dass zwischen der rechteckigenGrundplatte (1) und dem Deckel (8) ein Hohlraum entsteht, der eine Druckkammer bildet und der durch den Anschluss (9) pneumatisch mit Druck beaufschlagt wird. Die Druckapplikation am Anschluss (9) lenkt die Kolben gegen die Federkraft der Federelemente (7) aus. Die Druckfedern ermöglichen die Rückführung der Stempel (4–6) bei der Druckentlastung.
Alternativ ist der Anschluss (9) zur Durchführung von elektrischen Leitungen ausgelegt und ist in dem Hohlraum zwischen der rechteckigenGrundplatte (1) und dem Deckel (8) mindestens eine mit den elektrischen Leitungen verbundene Wicklung zur Erzeugung einer elektromotorischen Kraft vorgesehen, welche mit einem/einer an dem Stempel (4–6) oder Kolben (3) angebrachten Magneten/Wicklung derart elektromagnetisch wechselwirkt, dass bei Zuführung von elektrischer Energie über die elektrischen Leitungen über den Anschluss (9) der Stempel (4–6) oder Kolben (3) nach oben oder unten bewegt wird.
Die Vorrichtung dient der dynamischen Druckbelastung von Gewebekulturen, Zellen, Explantaten oder Implantaten jeglicher Art; sie wird komplett ohne Gewebekulturplatte sterilisiert. Es ist dem Fachmann ersichtlich, dass das Prinzip der Vorrichtung zur Druckstimulation auch ohne weiteres auf handelsübliche Gewebekulturplatten mit 12, 24, 48 und 96 Kavitäten (Wells) übertragbar ist.
Durch die gleichzeitige Kultivierung und Stimulation mehrerer Komposite ist eine statistische Aussage der Ergebnisse möglich. Es ist vorgesehen, jede Kavität über eigene Anschlüsse mit Medium zu versorgen, damit vergleichende Tests mit verschiedenen Medien und Zusätzen durchgeführt werden. Darüber hinaus können die Testkörper (Probe, Gewebe, Zellen, Komposite etc.) unterschiedlich stark komprimiert werden. Nach der kontinuierlichen Kultivierung kann die Gewebekulturplatte zusammen oder unabhängig vom Bioreaktor als batch-Kultur im Brutschrank weiterkultiviert werden, oder durch die Vorsehung von Heiz- und/oder Kühlelementen als Teil der Vorrichtung, z.B. integriert in oder an den Zu- und/oder Abführleitungen der Medien, können die Testkörper (Proben, Gewebe, Zellen, Komposite etc.) auch in der Vorrichtung verbleibend weiter kultiviert werden.
Während der Kultivierung von Zell-Matrix-Kompositen baut sich eine extrazelluläre Matrix auf, die die Druckbelastbarkeit der Komposite erhöht. Kultiviert man die Komposite direkt auf Drucksensoren, kann die Zunahme der Belastbarkeit mit der Kultivierungszeit online gemessen werden. Für diesen Einsatz werden piezoresistive Druckaufnehmer vorzugsweise auf der Basis von Silizium verwendet, da diese eine Reihe von Vorteilen haben:

– hoher k-Faktor → hohe Empfindlichkeit
– kurze Einstellzeiten → geeignet für dynamische und statische Messungen
– lineare Kennlinie
– geringe Abmessungen

Zur Verstärkung des Drucksensorsignals kann beispielsweise ein Subtrahierverstärker eingesetzt werden.
Ausführungsbeispiele
1. Isolierung und Vermehrung von Zell-Matrix-Kompositen
Zur beispielhaften Kultivierung und Druckstimulation von Zell-Matrix-Kompositen werden Bandscheibenzellen isoliert und in Agarose immobilisiert.
Dazu werden die Nuclei pulposi und Anuli fibrosi beispielsweise aus Schweinen oder Schafen entnommen, in Verdauungsmedium (ca. 10 ml pro Gramm Gewebe) aufgenommen und bei 40 UPM und 37°C auf einem Rüttler (Certomat R/H, Fa. B. Braun, Melsungen) inkubiert, um die Zellen zu vereinzeln. Das Medium besteht aus 25 mg Hyaluronidase und 7,5 mg Typ-II-Kollagenase in 100 ml PBS (Phosphate Buffered Saline) mit Calcium gelöst, mit 125 U/ml Penicillin und 125 μg/ml Streptomycin versetzt. Nach 24 Stunden werden die Zellen mit 240 × g zentrifugiert (Labofuge 400, Fa. Heraeus-Instruments, Hanau), in Medium resuspendiert und in einer Dichte von ca. 5000 Zellen/cm² in Gewebekulturflaschen (Fa. Techno Plastic Products, Trasadingen, Schweiz; Fa. Nunc, Wiesbaden; Fa. Böttger Bodenmais etc.) ausgesät, bei 37°C kultiviert und bei Erreichen von ca. 90% Konfluenz passagiert.
Als Medium zur Kultivierung weiterer Zell-Matrix-Komposite wird jeweils das für diese Zell- bzw. Gewebesorte optimale Medium verwendet. Die Auswahl des geeigneten Mediums ist dem Fachmann anhand der Literatur leicht möglich.
Zur Kultivierung von beispielsweise Bandscheibenzellen wird beispielsweise sterilfiltriertes (Steritop (0,2 μm), Fa. Millipore, Eschborn) Ham's F12 (Fa. Biochrom, Berlin) 10% nicht hitzeinaktiviertem fetalem Kälberserum (Fa. PAA Laboratories), 50 mg/l Ascorbinsäure, 4 mM L-Glutamin, 100 μ/l Penicillin und 100 mg/l Streptomycin eingesetzt.
Die Pufferlösung zum Waschen der Zellen vor den Passagen (Subkultivierungen) ist in diesem Fall calcium- und magnesiumfrei und besteht beispielsweise aus einer 10-fach konzentrierten Vorratslösung (80 g Natriumchlorid, 2 g Kaliumchlorid, 2 g di-Natriumhydrogenphosphat und 15 g Kaliumdihydrogenphosphat in 1 l Reinstwasser gelöst mit einem pH-Wert von 7,4), die vor der Verwendung mit Reinstwasser verdünnt und anschließend autoklaviert (121°C, 20 Min.) oder sterilfiltriert wird.
2. Kultivierung von Zell-Matrix-Kompositen im Bioreaktor
Als Bioreaktor wird eine handelsübliche Gewebekulturplatten mit beispielsweise 6 Kavitäten (Fa. Techno Plastic Products, Trasadingen, Schweiz) verwendet. Dazu wird der Bioreaktor vor der Verwendung autoklaviert und anschließend die Zell-Matrix-Komposite mit 4 ml Medium (ohne Antibiotika) pro Kavität unter sterilen Bedingungen eingesetzt. Nach einer Inkubationszeit von einem Tag im Brutschrank bei 37°C, 95% Luftfeuchte, 5% CO₂ wird die Druckkammer des Bioreaktors kontinuierlich mit einem Druck von 1,5 × 10⁵ Pa und einer Frequenz von 0,1 Hz beaufschlagt.
An den Schlauchanschlüssen für Mediumwechsel und Probennahme werden Spritzenvorsatzfilter (0,2 μm, Ø 25 mm) mit Schraubverschluss angeschlossen. Über diese Filter werden per Einwegspritzen täglich 0,5 ml Medium pro Kavität ausgetauscht. Die Druckausgleichs- bzw. Belüftungskanäle werden mit Sterilluftfilter (Fa. Schleicher&Schuell) vor Kontaminationen geschützt.
Alternativ wird 4 Tage lang inkubiert. Nach der Inkubationszeit von vier Tagen wird der Reaktor von der Zellkulturplatte getrennt und diese noch weitere 3 Tage im Brutschrank inkubiert. Anschließend wird das Medium mikroskopisch auf etwaige Kontaminationen untersucht. Zusätzlich werden Ausstriche auf Caseinpepton-Sojamehlpepton-Agar (CASO-Agar) angefertigt und 3 Tage im Brutschrank inkubiert.
Zur Perfusion (Kontinuierlicher Betrieb) des Zell-Matrix-Aggregates mit Medium wird wie folgt verfahren: Über Schlauchpumpen wird das Medium alternierend zur Druckstimulation umgewälzt. Damit wird das Medium dem Konditionierungsgefäß zugeführt, wo verschiedenste Parameter gemessen und geregelt werden können und aber auch die Konditionierung des Mediums im Brutschrank stattfindet sowie Stimulantien, wie Cytokine u.ä. zugesetzt werden können. Dabei muss das Reaktor-Kernstück nicht geöffnet werden, und damit wird die Kontaminationsgefahr erheblich verringert.
3. Druckstimulation
Die Zellen im Bioreaktor werden mit der erfindungsgemäßen Druckapparatur mit einem oder mehreren Teflonstempeln mechanisch druckstimuliert. Die Auslenkung der Stempel (4–6) erfolgt pneumatisch. Dazu wird in der Druckkammer ein Druck aufgebaut, der auf die Stempel (4–6) wirkt und diese gegen die Federkraft von Druckfedern auslenkt. Für die zyklische Druckapplikation wird ein 3/2-Wege-Magnetventil (z.B. Typ 6014, Fa. Bürkert, Ingelfingen) eingesetzt. Das Ventil ist mit einer programmierbaren Steuereinheit (Typ 1078, Fa. Bürkert) verbunden, die die Druckstimulation der Komposite mit der gewünschten Frequenz ermöglicht. Die Dauer der Stimulation wird über eine Zeitschaltuhr (ML(P5)1007P, Fa. Malon; Shanghai, China) durch Ein- bzw. Ausschalten des Ventils gesteuert.
Druckfedern ermöglichen die Rückführung der Stempel (4–6) bei der Druckentlastung.
Alternativ wird als Bioreaktor eine Edelstahl-(VA-Stahl-) Zellkulturplatte (Fa. Gerber-Feinmechanik, Mücke-Bernsfeld) mit integrierten Drucksensoren verwendet, so dass die Zunahme der Druckstabilität durch synthetisierte extrazelluläre Matrix oder das Stress-Relaxations-Verhalten der Komposite gemessen wird. Die Komposite werden dabei auf den von einem Edelstahlgehäuse umgebenen piezoresistiven Drucksensoren kultiviert. Eine dünne richtkraftlose Membran überträgt die einwirkende Kraft auf Silikonöl, das sich zwischen der Membran und der Druckmesszelle befindet.
4. Druckmesssystem
Der Bioreaktor wird durch ein Druckmesssystem ergänzt, das es ermöglicht, die Komposite mit genau definiertem Druck zu belasten und die Zunahme der Belastbarkeit der Zell-Matrix-Komposite sowie das Stress-Relaxations-Verhalten der Komposite online zu messen. Dazu werden die Komposite in einer Edelstahl-Gewebekulturplatte mit integrierten Drucksensoren kultiviert. Die auf die Edelstahl-Gewebekulturplatte aufgesetzte Apparatur zur Druckstimulation komprimiert die Komposite um einen bestimmten Betrag. Der auf die Sensoren wirkende resultierende Druck erzeugt ein Spannungssignal, das verstärkt und an eine Anzeigeap paratur geführt wird. Drucksensoren, Spannungsverstärkung und Signaldarstellung bilden das Messsystem.
Die Edelstahl-Gewebekulturplatte mit Drucksensoren ist in 3 dargestellt. Die Gewebekulturplatte (24) aus VA-Stahl besitzt sechs Bohrungen, die jeweils in drei Durchmessern abgesetzt sind. Die oberen Durchmesser (25) bilden den Sterilraum (26) für die Aufnahme der Proben und des Nährmediums. Die mittleren Bohrungen (27) dienen als Führung für die höhenverstellbaren Aufnahmen (29) der Drucksensoren (28). Die Drucksensoraufnahmen (27) sind vorzugsweise aus PEEK (Polyetheretherketon) gefertigt. O-Ringe (30) dichten die sterilen Bereiche gegenüber dem Außenbereich ab.
Die dritten Bohrungen (31) ermöglichen die Durchführung der Anschlussleitungen für die Drucksensoren. Die Aufnahmen mit den Drucksensoren lassen sich jeweils mittels zwei M2-Schrauben (32) in der Höhe verstellen, so dass die Kompression der Proben definiert werden kann. Die Stempelauslenkung wird durch die Stufen (33) begrenzt. Die höhenverstellbaren Sensoraufnahmen ermöglichen auch eine definierte Druckapplikation. In der Regel nimmt die Stabilität der Komposite mit fortschreitender Kultivierung zu. Soll der Druck während der Kultivierung konstant bleiben, muss die Kompression mit den höhenverstellbaren Sensoraufnahmen nachreguliert werden.
Die Empfindlichkeit der Sensoren ist in der Mitte der richtkraftlosen Membran am größten und nimmt in radialer Richtung kontinuierlich ab. Eine reproduzierbare Druckmessung von elastischen Testkörpern ist daher nur möglich, wenn die aus der Druckbelastung resultierende Kraft immer an der gleichen Stelle auf die Membran wirkt. Die Testkörper bzw. Komposite werden deshalb in Aufnahmen (34) aus PEEK aufgenommen, die die resultierenden Kräfte über einen zylindrischen Fortsatz (35) mit 1,5 mm Durchmesser mittig auf die Membran übertragen. Mit M3-Schrauben (36) kann die Drucksensorplatte mit dem Bioreaktor verbunden werden.
Den zeitlichen Verlauf der Ausgangsgröße eines Messsystems bei einer sprunghaften Änderung der Eingangsgröße bezeichnet man als Sprungantwort. Die Ausgangs- oder Messgröße nähert sich einem stationären Wert. Die Sprungantwort kann z.B. ein Verzögerungsglied erster oder höherer Ordnung sein, abhängig von der Größe und Anzahl der Energiespeicher (Kapazitäten) des Systems. Für die Messung des Stress-Relaxations-Verhalten von Zell-Matrix-Kompositen oder Knorpelgeweben ist eine Sprungantwort mit relativ kleiner Zeitkonstante nötig, da die Trägheit des Systems ansonsten die Messung von dynamischen Eingangsgrößen verfälscht. Die ideale Sprungantwort wäre eine Funktion, bei der die Ausgangsgröße zeitgleich mit der Eingangsgröße einen stationären Wert erreicht.
Zur Untersuchung der Sprungantwort des Messsystems wurde eine 3%-Agarose-Scheibe 17–22% komprimiert. Der resultierende Druck wurde über einen Zeitraum von ca. 50 Sekunden gemessen. Zur Simulation der Belastbarkeitszunahme durch synthetisierte extrazelluläre Matrix sowie der Messung des Stress-Relaxations-Verhaltens von Zell-Agarose-Kompositen wurden 2%-, 4%- und 5%-Agarose-Scheiben 17–22% komprimiert und der resultierende Druck über einen Zeitraum von ca. 5 Minuten gemessen.
Weitere Ausführungsbeispiele werden an Hand der 1 und 2 dargestellt. 1 und 2 zeigen dazu die Vorrichtung zur mechanischen Druckbelastung in einer bevorzugten Ausführungsform.
Die Vorrichtung ist – in der in 1 gezeigten Ausführungsform – aus einer rechteckigenGrundplatte (1), bevorzugt aus VA-Stahl, gefertigt, die auf einer Gewebekulturplatte (2), vorzugsweise eine 6-, 12-, 24-, 48- oder 96-Well-Platte, aufgesetzt wird. Über jeder Kavität ist eine Bohrung vorhanden, in die z.B. ein zylindrischer, T-förmiger Kolben (3) oder Stempel (4–6) eingesetzt wird, wobei der T-förmige Kolben oder Stempel bevorzugt aus Teflon besteht. Die Bohrung kann in mehrere Durchmesser abgesetzt sein, z.B. mit 33 mm an der Oberkante der Grundplatte (37), mit 27 mm in der Mitte (38) und mit 21 mm an der Unterkante der Grundplatte (39), wodurch drei Stufen entstehen. In dieser Ausführung der Erfindung dient die untere Stufe (40) als Widerlager für zylindrische, den Kolben (3) umschließende Federelemente (7, hier Druckfedern). Der Kolben des zylindrischen Stempels (3) wird in die Bohrung geführt, d.h. in diesem Ausführungsbeispiel im oberen und unteren Bereich der Bohrung. Auf die Grundplatte (1) ist ein vorzugsweise aus aus Edelstahl, besonders bevorzugt aus VA-Stahl gefertigter Deckel (8) mit einem Anschluss (9) für eine Druckbeaufschlagung durch Gase oder Flüssigkeiten vorgesehen, der z.B. mit Hilfe einer Schraubverbindung an der Grundplatte (1) befestigt ist. In diesem Ausführungsbeispiel erfolgt die Befestigung des Deckels (8) an der Grundplatte (1) mit Hilfe von vier in den Ecken befindlichen M3-Schraubverbindungen (10). Der zwischen Deckel (8) und Grundplatte (1) entstehende Hohlraum ist als Druckkammer (z.B. durch Anbringung von Dichtungen und druckfesten Verbindungen zwischen Grundplatte (1) und Deckel (8)) ausgeführt, die über den Anschluss (9) pneumatisch mit Gasen oder Flüssigkeiten unter Druck und damit mit Druck beaufschlagt werden kann. Durch Druckapplikation am Anschluss (9) werden die Kolben (3) gegen die entsprechend vorgespannten Federelemente (7) ausgelenkt und drücken auf die unter der Grundplatte (1) und unter den Bohrungen angebrachte Gewebekulturplatte (2).
Um besonders hohen Druck auf die Zellen ausüben zu können, befindet sich zwischen der Gewebekulturplatte (2) und der darauf aufgesetzten Grundplatte (1) eine – nicht dargestellte – druckdichte, aber lösbare Verbindung. Diese kann z.B. dadurch hergestellt werden, dass am äußeren Rand der Gewebekulturplatte (2) elastische Dichtungen angebracht sind, so dass bei Druckbeaufschlagung der Gewebekulturplatte durch die Kolben (3) und den damit einhergehenden Druckaufbau innerhalb des Bereiches zwischen Kolben und Gewebekulturplatte sich die seitlichen Ränder der Gewebekulturplatte nach aussen verbiegen und damit die außen an den seitlichen Rändern angebrachten, elastischen Dichtungen (41) gegen den über den Rand hinunterragenden Teil der Grundplatte (1) drücken, so dass eine Abdichtung und Halterung der Gewebekulturplatte entsteht.
Um noch höheren Druck auf die Proben (21) in den Kavitäten und damit auf die Gewebekulturplatte (2) ausüben zu können, weist eine ganz besonders bevorzugte Grundplatte (1) – nicht dargestellt – an den Seiten etwa L-förmig verlängerte Seitenteile der Grundplatte (1) auf, die mit der Grundplatte (1) fest oder lösbar verbunden sind, wobei die Verlängerungen so ausgeführt sind, dass der kürzere oder längere Schenkel der etwa L-förmigen Verlängerung unter die Gewebekulturplatte (2) greift, so dass der Kolben (3) die Gewebekulturplatte (2) und damit den Inhalt der Kavitäten gegen ein festeres Widerlager drückt. Im Falle der lösbaren Verbin dung zwischen den etwa L-förmigen Verlängerungen an der Grundplatte (1) ist eine elastische Dichtung (41) zwischen den Verlängerungen und der Grundplatte (1) vorgesehen, so dass die Dichtung eine eventuelle Vergrößerung des Spaltes zwischen der etwa L-förmigen Verlängerungen und der Grundplatte (1 ), wie sie etwa durch die Druckausübung auf die Gewebekulturplatte und damit auf die L-förmigen Verlängerungen auftritt, ohne wesentlichen Druckverlust aufnimmt.
Alternativ – nicht dargestellt – werden Klammern, z.B. in Form von Schraubzwingen mit einem Anschlag auf dem Deckel (8) und dem zweiten Anschlag unterhalt der Gewebekulturplatte (2) angebracht, um das „Auseinanderdrücken" der Teile Deckel, Grundplatte und Gewebekulturplatte zu vermeiden. In diesem Fall können die oben genannten elastischen Dichtungen zwischen den jeweiligen Teilen durch zähe, wie z.B. Teflon- oder Kupfer-Ring-Dichtungen ersetzt werden.
In einer weiteren Ausführungsform ist, wie in 1 auch dargestellt – zur Ausbildung eines sterilen Bereiches (13) im Bereich oberhalb der Gewebekulturplatte – eine elastische Membran (12), z.B. in Form einer Silikonfolie im Übergangsbereich zwischen Deckel (8) und Grundplatte (1) angebracht, so dass das druckbeaufschlagende Medium, wie Gas oder Luft, nicht in den sterilen Bereich (13) eindringt. Die elastische Membran (12) trennt den pneumatischen Teil der Druckkammer (11) vom sterilen Teil (13) der Gewebekulturplatte und verhindert somit, dass druckbeaufschlagtes Medium wie z.B. Luft oder inertes Gas aus der Druckkammer (11) an den Kolben (3) vorbei in die Kavitäten der Gewebekulturplatte (2) strömt. Bei Druckentlastung sorgen die Federelemente (7) für eine Rückstellung der Kolben (3) oder Stempel (4–6) in die Ausgangsposition.
Zur Versorgung der Proben oder Gewebekulturen in den Kavitäten oder zur Rückführung von Flüssigkeiten aus den Kavitäten sind an der Seite der Grundplatte (1) Anschlüsse (14), insbesondere Schlauchanschlüsse und damit korrespondierende Druckausgleichs- und/oder Begasungskanäle (16) z.B. in Form von Bohrungen vorgesehen, wobei die Kanäle so ausgeführt sind, dass über die Anschlüsse (14) zugeführte Versorgungsmedien in die zugeordnete Kavität oder die zugeordneten Kavitäten eingebracht oder Flüssigkeiten von dort entnommen werden können.
Somit entsteht durch die Verbindung der Vorrichtung zur mechanischen Druckbelastung mit Kanälen zur Zuführung/Abführung von Medien zu/von den Kavitäten und der Gewebekulturplatte ein Bioreaktor.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind an der Grundplatte (1) pro Kavität zwei seitliche Anschlüsse (14), bevorzugt Schlauchanschlüsse, angebracht, die jeweils mit einem Medium- oder Probenkanal (15) in der Grundplatte verbunden sind. Über diese Kanäle (15) können Medien ausgetauscht und Proben aus den Kavitäten bei bei verschlossenem System entnommen werden. Die Kanäle enden in rohrartigen Verlängerungen (23) der Probenkanäle, auf die kurze (Silikon-)Schläuche aufgesteckt werden können, um bei kontinuierlicher Betriebsweise der Vorrichtung den Flüssigkeitsstand des Mediums in den Kavitäten einstellen zu können. Ein Druckausgleich in den Kavitäten bei Stempelauslenkung wird durch einen Druckausgleichs- oder Begasungskanal (16) im Mittelsteg der Grundplatte (1) gewährleistet (siehe B-Richtung in 2). Dieser Längskanal (16) verbindet in der entsprechenden Ausführungsform jeweils z.B. Paarweise von einander getrennte sterile Bereiche, so dass z.B. über davon seitlich nach unten abzweigende, zu jeder oder einzelnen, oder in jede einzelne Kavität führende Quer-Kanäle (17), ein Druckausgleich zwischen den einzelnen Wells stattfinden kann. An den beiden Öffnungen des Druckausgleichs- oder Begasungskanals (16) aus der Grundplatte (1) sind in dieser bevorzugten Ausführungsform Schlauchanschlüsse (18) für den Anschluss von Sterilfiltern vorgesehen. Zur Abdichtung des sterilen Bereiches (13) befindet sich eine Silikondichtung (19) zwischen der Grundplatte (1) und der Gewebekulturplatte (2).
In einer weiteren Ausführungsform weisen die Wells der Gewebekulturplatte (2) Lochscheiben (20) auf, welche vermeiden, dass die unterhalb der oder in den Löchern der Scheiben befindlichen Proben (21) – bei Druckausübung – aus dem Bereich der Kolben (3) z.B. seitlich herausschwimmen und dadurch nicht druckbelastet werden. Durch verschieden starke Lochscheiben, d.h. verschieden hohe Lochscheibenwandungen, kann vorteilhaft der Druck weiter variiert werden, wozu ansonsten die ebenfalls vorgesehene – nicht dargestellte – Einzel-Druckansteuerung der Kolben (3) eingesetzt wird.
In einer weiteren Ausführungsart wird das Herausschwimmen der Proben oder Komposite oder Pellets durch Auflegen eines Netzes oder einer Gaze aus handelsüblichen biokompatiblen Materialien verhindert.
In einer weiteren Ausführungsart – nicht dargestellt – sind in den Zuführungen zu den Anschlüssen (14) und/oder (15) Filter zur Sterilisierung oder generellen Reinigung der zugeführten/abgeführten Medien (Anschlüsse 15) oder der Medien zur Druckbeaufschlagung (Anschlüsse 9) vorgesehen. Diese verhindern eine Kontamination des sterilen Bereichs mit Mikroorganismen.
In einer weiteren – nicht dargestellten – Ausführungsform weist die Vorrichtung etwa im sterilen Bereich (13), auf der Oberfläche der Gewebekulturplatte (2), im Bereich zwischen Deckel (8) und Grundplatte (1) oder/und in Wirkverbindung mit jeder Kavität, mindestens einen Druck- oder/und Temperatursensor auf, so dass in Verbindung mit einer ebenfalls nicht dargestellten Rechen- und Speichereinheit eine Regelung von Druck und/oder Temperatur in der Vorrichtung oder – im Zusammenspiel mit einer Gewebekulturplatte oder Komposit-Platte (2) – im Bioreaktorsystem ermöglicht wird.
In einem weiteren – nicht dargestellten – Ausführungsbeispiel weist der Deckel (8) Trennwände zur Abgrenzung von einem oder mehreren Stempeln (4–6) oder Kolben (3) voneinander auf. Die dadurch entstehenden Kammern können durch ebenfalls in den Trennwänden des Deckels (8) vorgesehenen Ventilen von einer Ansteuerungseinheit einzeln oder zusammen geöffnet oder geschlossen werden, so dass alle Kombinationsmöglichkeiten der Druckbeaufschlagung von Kolben (3) oder Stempeln (4–6) möglich sind.
In einem weiteren – nicht dargestellten – Ausführungsbeispiel ist vorgesehen, dass die Kanäle (14) und (18) auch als Zulauf für den Perfusionsbetrieb (kontinuierlicher Betrieb) der Vorrichtung oder des Bioreaktorsystems verwendet werden können, so dass seitlich für jede Kavität nicht zwei Kanäle und Anschlüsse (14) notwendig sind.
In einer weiteren, besonders vorteilhaften – nicht dargestellten – Ausführungsform ist der Anschluss (9) alternativ oder zusätzlich zur Durchführung von Medien zur Druckbeaufschlagung oder auch zur Durchführung von elektrischen Leitungen ausgelegt und ist weiterhin in dem Hohlraum zwischen der rechteckigen Grundplatte (1) und dem Deckel (8) mindestens eine, mit den elektrischen Leitungen verbundene Wicklung zur Erzeugung einer elektromotorischen Kraft vorgesehen, welche mit einem/einer an dem Stempel (4–6) oder Kolben (3) angebrachten Magneten/Wicklung derart elektromagnetisch wechselwirkt, dass bei Zuführung von elektrischer Energie über die elektrischen Leitungen über den Anschluss (9) der Stempel (4–6) oder der Kolben (3) nach oben oder unten bewegt wird.
Weiterhin ist dem Fachmann unmittelbar ersichtlich, dass Deckel (8) und Grundplatte (1) auch einstückig gefertigt sein können.
Ebenso ist dem Fachmann unmittelbar ersichtlich, dass die Federelemente -bei anderer Stufung der Bohrung in der Grundplatte (1) auch so vorgespannt sein können, dass die Kolben (3) bei Normaldruck in der Kammer (13) permanent auf die Proben oder Zellen (21) drücken und erst bei Anlegung von Unterdruck eine Reduktion der Druckausübung erfolgt.

1: Grundplatte
2: Gewebekulturplatte
3: Stempel oder Kolben
4: Obere Stempelführung
5: Mittlere Stempelführung
6: Untere Stempelführung
7: Federelemente
8: Deckel
9: Anschluss für Druckbeaufschlagung
10: M3-Schraube
11: Druckkammer
12: Elastische Membran, z.B. Silikonfolie
13: Sterilbereich
14: (Schlauch-)Anschluss
15: Seitliche Anschlüsse (Medium-/Probenkanal)
16: Druckausgleichs-/Begasungskanal
17: Verbindung des Druckausgleichs-/Begasungskanals mit den Kavitäten
18: Schlauchanschluss für Sterilluftfilter
19: Dichtung, z.B. Silikondichtung
20: Lochscheibe
21: Bereich der Probenkörper
22: Zwingen
23: Rohrartige Verlängerung der Probenkanäle
24: Gewebekulturplatte aus VA-Stahl
25: Oberer Bohrungsdurchmesser
26: Sterilbereich der z.B. aus VA-Stahl bestehenden
: Gewebekulturplatte
27: Führung der Sensoraufnahme
28: Drucksensor
29: Sensor-Aufnahme
30: O-Ring-Dichtung
31: Durchführung der Sensoranschlussleitung
32: M2-Schraube zur Höhenverstellung der Sensoren
33: Begrenzung der Stempelauslenkung
34: Aufnahme der Probenkörper
35: Fortsatz zur Kraftübertragung der Sensormembran
36: M3-Schrauben zur Verbindung der VA-Stahl-Gewebekulturplatte mit der Vorrichtung
37: Oberkante der Grundplatte
38: Mitte der Grundplatte
39: Unterkante der Grundplatte
40: Untere Stufe
41: elastische Dichtung

Claims

Vorrichtung zur mechanischen Druckbelastung von Gewebekulturen, Zellen oder biologischen Proben bestehend aus – einer Grundplatte (1) zur Auflage auf eine Gewebekulturplatte (2), wobei sich in der Grundplatte (1) Bohrungen befinden, die so angeordnet sind, dass direkt über jeder Vertiefung (Well) der darunter befindlichen Gewebekulturplatte eine Bohrung vorhanden ist, in die Kolben (3), z.B. T-förmige Kolben mit Federelementen (7) eingesetzt werden, so dass sie wie ein Stempel in das Well der darunter befindlichen Gewebekulturplatte einführbar sind – einem Deckel (8), mit einem Anschluss (9) für die Zu- oder Abführung von Medien, der auf der Grundplatte (1) so aufgesetzt wird, dass zwischen-Grundplatte (1) und Deckel (8) ein Hohlraum entsteht, der eine Druck- oder Vakuumkammer (11) bildet, die durch den Anschluss (9) mit Druck oder Unterdruck (z.B. durch Zu- oder Abführung von Medien in Form von Gasen oder Flüssigkeiten) beaufschlagt wird, so dass bei Zu- oder Abführung von Medien, die in die Bohrungen der Grundplatte (1) eingesetzten Kolben gegen die Vorspannung der Federelemente (7) nach oben oder unten gedrückt werden.
Vorrichtung insbesondere nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Anschluss (9) für die Zuführung von elektrischer Energie etwa durch Leitungen ausgelegt ist und sich im Hohlraum zwischen Deckel (8) und Grundplatte (1) mindestens eine mit den elektrischen Leitungen verbundene Wicklung zur Erzeugung einer elektromotorischen Kraft vorgesehen ist, welche mit einem oder einer an dem Stempel (4–6) oder Kolben (3) angebrachten Magneten oder Wicklung derart elektromagnetisch wechselwirkt, dass bei Zuführung von elektrischer Energie etwa über die elektrischen Leitungen über den Anschluss (9) der Stempel (4–6) oder der Kolben (3) nach oben oder unten bewegt wird.
Vorrichtung zur mechanischen Druckbelastung von Gewebekulturen und Zellen nach Anspruch 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, dass sie z.B. im Bereich der Grundplatte (1) seitliche Anschlüsse (14) sowie seitliche Kanäle (16) aufweist, die eine Zu- oder Abführung von Medien zu den Proben oder Geweben in den Kavitäten der Gewebekulturplatte (2) ermöglichen.
Vorrichtung zur mechanischen Druckbelastung von Gewebekulturen und Zellen nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie – im Falle von mehreren Kavitäten und zugeordneten Stempeln (4–6) oder Kolben (3) Längskanäle (16) oder/und Querkanäle (17), z.B. in Form von Bohrungen in der Grundplatte (1) zur Verbindung der Wells und zum Ausgleich von Druckunterschieden zwischen des Wells aufweist.
Vorrichtung zur mechanischen Druckbelastung von Gewebekulturen und Zellen nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine elastische Membran (12), vorzugsweise aus Silikon, aufweist, welche sich oberhalb der Stempel (4–6) oder Kolben (3) erstreckt und vorzugsweise im Bereich des Übergangs von Deckel (8) zu Grundplatte (1) seitlich befestigt ist, so dass sich unterhalb der Membrane ein nahezu steriler, d.h. von den Medien zur Druckbeaufschlagung abgetrennter Bereich ausbildet.
Vorrichtung zur mechanischen Druckbelastung von Gewebekulturen und Zellen nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Grundplatte (1) aus Kunststoff, vorzugsweise aus Edelstahl gefertigt ist.
Vorrichtung zur mechanischen Druckbelastung von Gewebekulturen und Zellen nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Bohrung für die Stempel (4–6) oder Kolben (3) in mehreren Durchmessern abgesetzt ist, so dass Stufen entstehen, vorzugsweise in nach innen hin kleiner werdenden Durchmessern, bevorzugt mit 33 mm an der Oberkante, mit 27 mm in der Mitte und mit 21 mm an der Unterkante.
Vorrichtung zur mechanischen Druckbelastung von Gewebekulturen und Zellen nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Stempel (4-6) oder Kolben (3) zylindrisch und vorzugsweise T-förmig sind und aus zähem Material, vorzugsweise aus Edelstahl oder Metall, besonders bevorzugt aus Teflon oder PEEK, gefertigt sind.
Vorrichtung zur mechanischen Druckbelastung von Gewebekulturen und Zellen nach Anspruch 1 bis 8 dadurch gekennzeichnet, dass der Deckel (8) aus Metall, vorzugsweise Edelstahl gefertigt ist und mit einer druckdichten, lösbaren, vorzugsweise einer Schraubverbindung oder Zwingen an der Grundplatte (1) befestigt ist.
Bioreaktorsystem umfassend einen Bioreaktor und eine Vorrichtung zur mechanischen Druckbelastung nach einem der Ansprüche 1 bis 9.
Bioreaktorsystem nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Bioreaktor eine Gewebekulturplatte ist.
Bioreaktorsystem nach Anspruch 10 bis 11 dadurch gekennzeichnet, dass der Bioreaktor eine Gewebekulturplatte mit integrierten Drucksensoren oder/und Temperatursensoren ist oder der Bioreaktor oder die Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 9 Heiz- oder/und Kühlelemente oder/und Pumpmittel und/oder Druckmess- oder/und Temperaturmesselemente oder/und pH-Messelemente und entsprechende Regelsysteme umfasst.
Bioreaktorsystem nach Anspruch 11 dadurch gekennzeichnet, dass die Gewebekulturplatte eine 6-, 12-, 24-, 48-, oder 96-Well- Gewebekulturplatte ist.
Bioreaktorsystem nach Anspruch 10 bis 13 dadurch gekennzeichnet, dass es autoklavierbar ist.
Bioreaktorsystem gemäß Anspruch 10 bis 14 dadurch gekennzeichnet, dass es für den Perfusionsbetrieb oder batch-Betrieb ausgelegt ist.
Bioreaktorsystem gemäß Anspruch 12 dadurch gekennzeichnet, dass es eine Rechner- oder eine Rechner- und Speicher-, sowie eine Ausgabeeinheit umfasst, so dass der Betrieb etwa durch in den Rechner eingehende Signale von im System angebrachten Sensoren, z.B. für Druck, pH-Wert und Temperatur regelbar ausgeführt ist.