DE19962456A1

DE19962456A1 - Verfahren und Apparatur zur Herstellung, Untersuchung und mechanischen Stimulation dreidimensionaler Gewebezellkulturen

Info

Publication number: DE19962456A1
Application number: DE19962456A
Authority: DE
Inventors: Ingo Wilke; Dirk Nehring
Original assignee: FORSCHUNGSZENTRUM fur MEDIZIN; Forschungszentrum Borstel Zentrum fuer Medizin und Biowissenschaften; Biotechnologie Gesellschaft Mittelhessen mbH
Current assignee: FORSCHUNGSZENTRUM FUER MEDIZINTECHNIK UND BIOTECHNO; Nehring Dirk Dipl-Ing 35037 Marburg De
Priority date: 1999-12-22
Filing date: 1999-12-22
Publication date: 2001-07-12

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Apparatur zur Herstellung, Untersuchung und Stimulation von dreidimensionalen Zellkulturen sowie ein in-vitro Testsystem von medizinischen Wirkstoffen. Die Zellen werden dabei in ein schützendes Fluid z. B. Hyaloronsäure oder Collagen mit Hilfe eines neuartigen Verfahrens gebracht und können zyklisch oder permanent mechanisch belastet werden. DOLLAR A Die Versorgung der Zellen wird durch eine Membran, einen Filter oder ein poröses Sintermaterial durch Diffusion gewährleistet.

Description

Stand der Technik und Anwendungsgebiete

Beim Tissue Engineering von künstlichen Binde- oder Epithelgewebe ist die Herstellung möglichst körperspezifischer Eigenschaften gefordert.

Anwendungsgebiete des Tissue Engineering sind z. B. physiologische Untersuchungen an in-vitro Modellen, um Tierversuche zu vermeiden. Es wird aber auch zunehmend versucht, Implantate aus lebenden z. T. autologen Zellen oder Stammzellen zu generieren.

Insbesondere für die Herstellung von Gelenkflächenimplantaten aus Chondrozyten scheint es, nach dem derzeitigen Stand des Wissens, erforderlich zu sein, die physiologische Funktionalität durch eine möglichst homogene, druckstabile Matrix, in der die Zellen eingebettet sind, und durch Bereitstellung von entsprechenden Versorgungsbedingungen zu verbessern. Des weiteren ist es offenbar notwendig, das entsprechende Implantat durch zyklische mechanische Belastung zu stimulieren, um einen stabileren Aufbau der extrazellulären Matrix des Implantates zu erhalten.

Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und Apparatur zur Herstellung, Untersuchung und Stimulation von dreidimensionalen Zellkulturen sowie ein in-vitro Testsystem von medizinischen Wirkstoffen. Die Zellen werden dabei in eine schützendes Fluid z. B. Hyaloronsäure oder Collagen eingebettet und zyklisch oder permanent mechanisch belastet.

Die Versorgung der Zellen wird durch eine Membran, einen Filter oder ein poröses Sintermaterial durch Diffusion gewährleistet.

Zunächst werden die Zellen mit den späteren Matrixbestandteilen in einem durchmischten Gefäß in eine homogene Mischung gebracht. Vorab kann die Gesamtzellzahl, die sich im Implantat wiederfinden soll; eingestellt werden. Alle Bestandteile sind im festen Zustand im Zellkulturmedium suspendiert. Insbesondere können Gesamtzellzahlen von 1×10⁵ bis 1×10⁹ in dem System verarbeitet werden. Die festen Matrixbestandteile können Collagene, Hyaluronsäuren, Polylaktide, Polyuretane, uronsäurereiche Polymere aus Pflanzen (auch aus gentechnologisch veränderten Pflanzen), Polyglactone und Polydioxäne sowie andere resorbierbare. Polymere in Form von fadenförmigen oder runden Partikeln bzw. Gelen sein. Alle diese Bestandteile sollten suspendierbar sein, damit sich eine möglichst homogene Verteilung der Bestandteile im Gefäß realisieren läßt. Das Gefäß ist durch eine beliebig geformte Grundfläche, die auch gewölbt sein kann, und vertikalen Seitenwänden gekennzeichnet, die eine Führung eines Kolbens ermöglichen.

Die Durchmischung erfolgt entweder durch Bewegung von außen, durch bewegte Einbauten im Gefäß oder durch den Eintrag einer zirkulierenden Strömung. Besonders eignet sich hierfür eine Schüttelbewegung von außen. Ganz besonders ist hierfür ein mechanischer Rührer geeignet, der gemäß der Abbildung (3) ausgeführt ist. Sind die festen Bestandteile incl. der Zellen suspendiert, erfolgt über einen porösen Körper das abpressen des Mediums. Dieser Körper ist im besonderen aus Sintermetall oder Keramik angefertigt. Ganz besonders zeichnet sich die Apparatur dadurch aus, daß auch die Wände aus porösen Material gefertigt sind. Während des Abpressens kann das aufkonzentrierte Fluid weiterhin suspendiert werden, um dauerhaft ein homogenes Gemisch einzustellen und das verblocken poröser Körper zu verhindern. Schließlich wird das Implantat durch Pressen zu einem festen Körper geformt, der im selben Apparat weiterkultiviert werden kann, bis das Implantat zur Weiterverwendung entnommen wird. Nach der Herstellung des Implantats ist lediglich eine leichte Modifikation der Apparatur notwendig, um eine kontinuierliche Versorgung bei gleichzeitiger mechanischer Stimulation zu gewährleisten. Die zwei Kompartimente der Apparatur sind nun durch eine Dialysemebran voneinander getrennt. Das obere Kompartiment ist, mit einer viskosen Flüssigkeit gefüllt, die besonders dadurch gekennzeichnet ist, daß die physiologischen Eigenschaften den in-vivo Bedingungen der zu kultivierenden Zellen entsprechen. Insbesondere bei der. Kultivierung von Knorpelimplantaten ist diese Flüssigkeit Hyäloronsäure oder kompressible. Die obere Kammer ist für die Aüfnahme von einer oder mehreren dreidimensionalen Gewebekulturen insbesondere Chondrozytengewebekulturen gedacht. Es kann aber auch ein konfluenter Zellmonolayer im oberen Kompartiment wachsen. Die obere Kammer kann sowohl kontinuierlich durchströmt als auch abgeriegelt werden. Mit Hilfe, von mechanischen Stößel kann eine definierte Kraft statisch oder zyklisch direkt oder indirekt auf die Zellen aufgebracht werden. Die Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Kraft indirekt durch eine Membran oder eine kompressible Flüssigkeit auf die Zellen übertragen wird. Besonders ist der Apparat dadurch gekennzeichnet, daß die Kraft durch eine Metall- oder eine durchsichtige Silikonmembran abgedeckt wird und die Kräfte mit Hilfe von Stößel über diese Membranen übertragen werden. Die Kraft kann sowohl zyklisch als auch statisch mit bestimmten Vortriebsgeschwindigkeiten aufgebracht werden. Dabei ist sowohl definierte Kontraktion als auch definierte Kraftübertragung mit Hilfe von Abstandsmessung und Kraftaufnehmern einstellbar. Das Grundgerüst aus beiden Kompartimenten ist dadurch, gekennzeichnet, daß es aus einem zellkulturverträglichen, drucktragenden Material insbesondere Edelstahl oder PEK gefertigt ist. Dabei wird das obere Kompartiment vom unteren durch eine Dialysemembran abgetrennt. Die Membran wird durch einen im unteren Kompartiment befindlichen porösen Körper oder Sintermetallkörper gestützt. Das System ist dadurch gekennzeichnet, daß das Gelenkflächenimplantat direkt durch die Membran versorgt wird. Die untere Kammer wird dabei kontinuierlich mit Nährstofflösung durchströmt, so daß über die Membran ein Austausch von Nährstoffen und Metaboliten stattfinden kann. Insbesondere besteht das Sintermetall aus Titandioxid und die Membran aus Kunststoff oder Keramik. Die Apparatur ist im besonderen dadurch gekennzeichnet, daß der Stoffaustausch der oberen Kammer durch den selben porösen Körper erfolgt, mit dem vorher das Implantat abgepreßt wurde.

Beschreibung von Ausführungsbeispielen

Weitere Merkmale, Einzelheiten und Vorzüge der Erfindung sind in den Zeichnungen dargestellt und werden im folgenden beschrieben.

Abbildungen

Fig. 1: Schema des Herstellungsverfahrens

Fig. 2: Schema der technischen Einrichtungen zum Durchmischen der Zellen bzw. Matrixbestandteile

Fig. 3: Konstruktionen der Apparatur

Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 zeigt das Herstellungsverfahren des Implantats. Mit Hilfe der Preßkraft wird die Suspension aus Zellen und Matrixbestandteilen aufkonzentriert und schließlich zum Implantat gepreßt. Der Medienüberstand kann abgezogen werden und durch andere Fluide ersetzt werden. Nach der Herstellung des Implantats, wird der Stempel wieder nach oben geführt und das Implantat kann weiter kultiviert werden. Zum Abpressen kann auch ein keramischer Träger verwendet werden, der schließlich als implantierbare Oberfläche dient. Dieser Träger kann z. B. aus poröser Hydroxylapatitkeramik bestehen.

Fig. 2 zeigt die unterschiedlichen Vorrichtungen, die die Durchmischung des Gefäßes gewährleisten. Dargestellt ist das Mischen mit Hilfe einer eingetragenen Strömung, eine speziellen Magnetrührers sowie die Möglichkeit des Mischens durch Bewegung der gesamten Apparatur.

Fig. 3 zeigt den konstruktiven Aufbau der Apparatur. Dargestellt ist die Möglichkeit des Absenkens der unteren Auflagefläche auf die das Implantat gepreßt wird. In der zweiten Darstellung ist aufgezeigt, wie eine direkte mechanische Belastung mit Hilfe eines Stößels erfolgt. Das obere Kompartiment ist hier ebenfalls mit Medium gefüllt, das kontinuierlich zu und abgeführt werden kann. Die dritte Darstellung veranschaulicht die Möglichkeit, das Implantat mit einem Fluid zu schützten und Druckkräfte mit einer Membran zu übertragen. Bei allen Apparaturen findet eine austauschende Versorgung über eine Dialysemembran statt.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Gewebeimplantaten dadurch gekennzeichnet, daß die Herstellung durch das Abpressen eines homogen, suspendierten Fluids erfolgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß lebende Zellen oder Gewebebestandteile zu einer festen Matrix gepreßt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß diese lebenden Zellen Chondrozyten sind und die Matrixbestandteile aus handelsüblichen resorbierbaren oder autologen- oder homologen Materialien (Polylaktide, Polygalactin, Ethisorb, Vicryl Rapid, Collagen, Hyaloronsäure) bestehen, die suspendierbar bzw. vermischbar sind.

4. Verfahren nach Anspruch 2 dadurch gekennzeichnet, daß das Abpressen mit Hilfe eines porösen Materials in einem durchmischten Gefäß erfolgt. Insbesondere ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß eine schonende Aufkonzentrierung der festen Bestandteile erfolgt, indem das Medium, über das poröse Material abgeschieden wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet, daß die Durchmischung des Gefäßes mit einem Rührer, durch Bewegung des gesamten Gefäßes oder durch den Eintrag von Strömung erfolgt.

6. Verfahren nach Anspruch 5 und 2 dadurch gekennzeichnet, daß ein Implantat bestehend aus Chondrozyten, Collagen und Hyaloronsäure abgepresst wird und die Gesamtzellzahl 3 × 10⁴ bis 3 × 10⁹ beträgt.

7. Verfahren nach Anspruch 3 dadurch gekennzeichent, daß das hergestellte Implantat kontinuierlich weiterkultiviert werden kann.

8. Apparatur dadurch gekennzeichnet, daß ein steriles durchmischtes Gefäß eine Abpressvorrichtung aus durchlässigem Material zum Trennen von Medium und festen Bestandteilen insbesondere Zellen und die beschriebenen Materialien besitzt und das Abpressen mit einem definierten Druck erfolgen kann. Besonders ist die Apparatur dadurch gekennzeichnet, daß das Gefäß Volumia von 1-100 ml hat und beliebige horizontale Querschnitte aufweisen kann.

9. Apparatur nach Anspruch 8 dadurch gekennzeichnet, daß in dem sterilen Gefäß ein Rührer integriert ist und daß dieser Rührer insbesondere ein Magnetrührer ist.

10. Apparatur nach Anspruch 8 dadurch gekennzeichnet, daß in dem Gefäß die Durchmischung durch radialen Eintrag eines Fluides erfolgt.

11. Apparatur nach Anspruch 8 dadurch gekennzeichnet, daß nach dem Abpressen des Implantats eine kontinuierliche Versorgung durch eine Dialysemembran bzw. durch den porösen Körper erfolgen kann.

12. Apparatur nach Anspruch 8 dadurch gekennzeichnet, daß nach dem Apressen des Implantats mit Hilfe eines Stempels definierte, zyklische Druckbelastung auf das Implantat ausgeübt werden kann. Die Apparatur ist ganz besonders dadurch gekennzeichnet, daß Drücke von 10 N bis 1 kN auf das Implantat ausgeübt werden können.

13. Apparatur nach Anspruch 11 oder 12 dadurch gekennzeichnet, daß während der Weiterkultivierung Testsubstanzen zugeführt werden können und ihre Wirkung auf die Implantate getestet werden kann. Die Apparatur ist besonders dadurch gekennzeichnet, daß in ihr Chondrozytenimplantate getestet werden können und mit Hilfe der mechanische Belastung athrotische Zustände herbeigeführt werden können.

14. Apparatur nach Anspruch 12 dadurch gekennzeichnet, daß das Implantat in Hyaloronsäure eingebettet ist und die mechanische Kontraktion durch das Fluid übertragen wird. Besonders ist die Apparatur dadurch gekennzeichnet, daß die Druckübertragung über einen Stahlkörper und eine Silikonmembran oder eine Stahlmembran stattfindet. Ganz besonders ist die Apparatur dadurch gekennzeichnet, daß die Druckübertragung direkt durch einen abgedichteten Stößel erfolgt.