DE60204352T2 - Haut/haar-äquivalent mit rekonstruierten papillen - Google Patents

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Description

  • Diese Erfindung bezieht sich auf ein Haut/Haar-Äquivalent, im Besonderen ein Haut-/Haarmodell mit rekonstruierten Papillen (Pseudopapillen) in einer rekonstruierten Dermis (Pseudodermis), auf seine Herstellung und auf seine Verwendung, insbesondere auf medizinischem, pharmazeutischem und kosmetischem Gebiet.
  • Die Entdeckung wirksamer Substanzen mit zum Beispiel einem biologischen Effekt auf den Haarfollikel, so dass sie fähig sind, Haarpigmentierung, Haarwachstum und Haarstruktur zu beeinflussen, erfordern geeignete in vitro-Testsysteme, an denen solche Wirkungen bewertet werden können. Diese Testsysteme müssten auf ideale Weise das Überprüfen einer relativ großen Anzahl von Substanzen ermöglichen, standardisierbar und kostengünstig sein und – im Falle von in vitro-Systemen – die in vivo-Situation simulieren.
  • In der Haarforschung stehen gegenwärtig keine geeigneten in vitro-Modelle zum Beispiel zur Untersuchung des Haarwachstums, der Haarpigmentierung und Haarstruktur zur Verfügung. Eine Zusammenfassung von existierenden Methoden und eine Illustration der Nachteile dieser Systeme finden sich z. B. bei K. S. Stenn „Laboratory Assessment of Hair Follicle Growth" in Skin Pharmocol. Appl. Skon Physiol. 1999; 12: 154–157. Diese Systeme reichen von Monolagezellkulturen über Tiermodelle und ex vivo-Systeme bis hin zu in vitro-Systemen.
  • Monolagekulturen von Haarfollikelzellen haben den Nachteil, dass die Zellen, sobald sie von ihren komplexen dreidimensionalen Strukturen entfernt sind, sich anders verhalten als im Organ als Ganzem. Aus diesem Grund ist die Information über die Wirkung von Substanzen auf als Monolage gezüchteten Haarfollikelzellen von geringer Relevanz für die in vivo-Situation. Gemäß den Richtlinien für Kosmetika dürfen Tiermodelle bei der Entwicklung kosmetischer Produkte nicht herangezogen werden. Dementsprechend stehen ex vivo-Modelle, die in vitro-Methoden mit in vivo-Methoden am Tier kombinieren, ebenfalls außer Frage. Ähnliche Probleme, wie die Verfügbarkeit von Material und Standardisierbarkeit spielen bei der Verwendung von Hautexplantaten mit Haaren in Kultur eine Rolle. Obwohl in vivo-Studien an Menschen durchgeführt werden, um die Wirkung zu ermitteln, sind sie nicht ratsam, solange nicht ein potenter Wirkstoff entdeckt und in eine Formel eingebaut worden ist, weil solche Studien entsprechend kostspielig und komplex sind. Es gibt auch keine geeigneten in vitro-Systeme zur Überprüfung von Substanzen, die die Haarfarbe beeinflussen.
  • In vitro-Tests zur Veränderung der Haarpigmentierung durch Beeinflussung der Melaninproduktion der Melanozyten werden auch hauptsächlich an einzelnen Zellkulturen durchgeführt. Epidermale Melanozyten oder B16-Melanomzellen werden häufig zu diesem Zweck verwendet und die mit diesem Zelltyp erhaltenen Resultate werden auf Haarmelanozyten extrapoliert, weil Haarmelanozyten schwierig zu isolieren und züchten sind. Hinzukommt, dass bei diesen Systemen die komplexe Wechselwirkung der Melanozyten mit dem Haarfollikel fehlt, so dass ihre Relevanz für die in vivo-Situation am Haarfollikel in Frage gestellt werden muss. Dasselbe gilt für rekonstruierte Haarmodelle, die (epidermale) Melanozyten enthalten. Tiermodelle, ebenfalls ein beliebtes Testmodell für Substanzen mit einer Wirkung auf die Haarpigmentierung, sind nach den Richtlinien für Kosmetika, bei denen die Substanzen für kosmetische Produkte verwendet werden sollen, verboten. In vivo-Studien an Menschen sind aufwändig und kostspielig und demzufolge erst zu empfehlen, nachdem eine potente wirksame Substanz gefunden sein wird.
  • Bei der Technik der Gewebeherstellung werden verschiedene Zelltypen aus Gewebe, zum Beispiel Hautgewebe, isoliert und in Zellkultur als so genannte Monolage vervielfacht. Das Gewebe wird dann aus den einzelnen Zellen rekonstruiert. Handelt es sich um Haut, können zum Beispiel Fibroblasten in ein Kollagengel oder eine sonstige Matrix „gesät" werden, so dass sie wuchern und eine Pseudodermis bilden. Epidermale Keratinozyten können auf die so gebildete Pseudodermis aufgetragen werden, wo sie ebenfalls wuchern und eine Pseudoepidermis bilden. Durch Anheben der Kultur in die Luft (Luft/Flüssigkeit-Schnittstelle) beginnen die Zellen, sich zu differenzieren und ein Stratum corneum zu bilden.
  • Bisher wurden hauptsächlich Zellkulturen, zum Beispiel Keratinozyten der äußeren Haarwurzelhülle (ORS-Keratinozyten, ORS = outer root sheath), dermale Papillenzellen, usw. in der Haarforschung verwendet. Jedoch wurden auch wiederholt Versuche unternommen, Haarfollikel oder Teile von Haarfollikeln als ein dreidimensionales Modell, zum Beispiel in einem Kollagengel, zu züchten oder ganze Haarfollikel durch die Kombination verschiedener Haarfollikelzellen zu rekonstruieren.
  • In „Characterization of a new tissue-engineered human skin equivalent with hair„, veröffentlicht in In Vitro Cell. Dev. Biol. – Animal 35: 318–326, Juni 1999, berichten M. Michel et al. zum ersten Mal über das Einfügen eines Haarfollikels in ein rekonstruiertes Haarmodell zur Anwendung bei Penetrationsstudien. Die Autoren verwandten dabei ganze Haarfollikel, die zuvor aus mit Haaren bedeckter Haut präpariert werden mussten. Abgesehen von der begrenzten Verfügbarkeit des Materials ist die Standardisierbarkeit bei Verwendung präparierter Haare auf Grund der beträchtlichen biologischen Unterschiede gering.
  • Die Dokumente EP 0 285 471 A1 und EP 0 285 474 A1 beschreiben auch die Produktion einer künstlichen Haut, die aus einer dermalen Schicht kontraktiler Zellen (Fibroblasten) und extrazellulärer Matrixkomponenten besteht, in die ganze Haarfollikel oder Follikelsegmente eingefügt werden. Die dermale Schicht wird sodann zusätzlich mit Keratinozyten überzogen, die eine epidermale Schicht bilden. Der Nachteil hierbei ist, dass die Papillen nicht rekonstruiert werden, sondern es wird nur ein Teil des Haarfollikels ohne eine Papille verwendet.
  • Das von einer Gruppe japanischer Forscher (M. Inamatsu et al. „Hair Follicle Development in Organotypic Culture„, Third Intercontinental Meeting of Hair Research Societies (Abstract) Tokio 2001) für die frühe Phase der Haarentwicklung verwandte Modell besteht aus frisch isolierten dermalen Papillen von Rattenbarthaaren, die zwischen ein Kollagengel, das Fibroblasten enthält, und eine epidermale Schicht von Rattenkeratinozyten eingefügt werden. Diese organtypische Kultur wird an der Luft-/Flüssigkeit-Schnittstelle gezüchtet. Nach 7 Tagen soll sich die Epidermis in der Nähe der dermalen Papillen verdicken. Erstens werden hier keine menschlichen Zellen oder Papillen verwendet, zweitens sind die Papillen nicht rekonstruierte Papillen sondern ganze, aus Haarfollikeln isolierte Papillen und drittens werden die Papillen nicht in die Epidermis eingefügt (zum Beispiel injiziert oder implantiert), sondern zwischen die dermalen und epidermalen Schichten gelegt. Die Verwendung isolierter Papillen bringt dieselben Probleme der Verfügbarkeit und Standardisierbarkeit wie die Verwendung isolierter Haarfollikel mit sich.
  • Dasselbe gilt für die Arbeiten von S. A. J. Watson et al. „Sheep vibrissa dermal papillae induce hair follicle formation in heterotypic skin equivalents" in British Journal of Dermatology (1994) 131, 827–835. Hier werden in einem Kollagengel gezüchtete dermale Papillen oder Papillenzellen zwischen die Dermis und Epidermis eines Haut-Äquivalents eingefügt mit dem Ziel, ein Modell für die Entwicklung des Haarfollikels zu erhalten. Unter diesen Bedingungen wandern die dermalen Papillenzellen jedoch in die dermale Matrix und bilden sich nicht selbst in eine Papille um, so dass das Modell abgeändert werden muss, indem Papillen oder Papillenzellen auf ein dermales Substrat aufgetragen werden, das dann mit einer fetalen Mausepidermis bedeckt und auf haarlose Mäuse transplantiert wird.
  • 1993 gelang es A. B. Jahoda et al. „Dermal-Epidermal Interactions – Follicle-Derived Cell Populations in the Study of Hair-Growth Mechanisms" in J. Invest. Dermatol. 101: 33S–38S, 1993, eine follikelähnliche Struktur aus einer Kombination von Haarzellen herzustellen, indem sie zunächst äußere Harrwurzelhüllenzellen (ORS Zellen) in der Kollagenkapsel des Follikels eines Rattenbarthaares züchteten und sodann eine Mixtur von unterschiedlichen Haarfollikelzellen – dermale Papillenzellen, dermale Hüllenzellen und Matrixzellen hinzufügten. Sie benötigten jedoch die stabile Kollagenkapsel des Rattenbarthaares, um die Struktur zu stabilisieren.
  • A. Limat et al. „Outer Root Sheath (ORS) cells organize into epidermoid cyst-like spheroids when cultured inside Matrigel®: a light-microscopic and immunohistological comparison between human ORS cells and interfollicular keratinocytes" in Cell Tissue Res. (1994) 275: 169–176 bringen ebenfalls unterschiedliche Haarfollikelzellen und Hautzellen in einer dreidimensionalen Struktur zusammen, um ihre Wechselwirkung zu untersuchen. Sie verwenden ein Gel aus Kollagen (I) als Basis und betten auf dieses eine Schicht Matrigel® oder eine Mixtur der Basalmembrankomponenten, die verschiedene Zellen oder Zellmixturen enthalten. In dem Matrigel® bilden die epidermalen oder ORS Keratinozyten (= Keratinozyten der äußeren Haarwurzelhülle) rundliche, aber nicht follikuläre Strukturen. Hierbei werden unterschiedliche Zelten enthaliende Schichten übereinander gelegt. Es wird jedoch in diesen Schichten keine neue Struktur wie die dermale Papille aufgebaut. Obwohl Limat et al. berichten, dass ORS Keratinozyten fähig seien, zystoide Strukturen zu bilden, die innen hornig werden, handelt es sich hier nicht um die physiologische Natur der Haarschaftbildung, sondern eher um die Differenzierung und Bildung der Hornschicht der Epidermis durch zystoid angeordnete Keratinozyten. Haarschäfte werden indessen normaler weise durch Matrixzellen, die über der dermalen Papille liegen, gebildet.
  • Die veröffentlichte japanische Patentanmeldung 10-136977 (Toyobo Co., Ltd., Japan) beschreibt ein künstliches Gewebe und seine Rekonstruktion, die haarschaftähnliche Strukturen an der Grenze zwischen einer Schicht von Fibroblasten in einer Kollagenschicht und einer Haarpapillenzellen enthaltenden Kollagenschicht umfasst. Dieses Modell soll als Testsystem zur Bestimmung der Verträglichkeit und Effizienz wirksamer Substanzen und Kosmetika dienen.
  • Hier gilt dasselbe wie für den Artikel von A. Limat et al.: in diesem Modell werden dermale Papillen, die wie der Haarfollikel eine dreidimensionale Struktur aufweisen, nicht rekonstruiert, sondern die Zellen werden in Schichten übereinander angeordnet und es bildet sich keine neue Struktur. Melanozyten werden offensichtlich bei dem beschriebenen Modell auch nicht verwendet. Effektivitätstests werden als eine potentielle Anwendung für das Modell erwähnt. Jedoch gibt es keinen Hinweis darauf, welche Endpunkte an dem Modell bewertet werden sollen, d.h. wie die Anwendung wirksamer Substanzen die Struktur des rekonstruierten Modells berührt und was hineingelesen werden kann insoweit die Wirkung dieser Substanz auf Haarwachstum und Haarstruktur betroffen ist.
  • Das „Philpott Model" (M. P. Philpott „Human hair growth in vitro", J. Cell. Sci. 97, 463–471, 1990), bei welchem isolierte Haarfollikel 9 Tage lang in einer Kultur gehalten werden, hat den Nachteil einerseits der signifikanten Unterschiedlichkeit zwischen den individuellen Follikeln und somit geringer Standardisierbarkeit, und andererseits der geringen Verfügbarkeit der Haarfollikel. Aus diesem Grund kann nur eine sehr begrenzte Menge wirksamer Substanzen innerhalb eines festgelegten Zeitraums ausgewertet werden. Des Weiteren können nur in dem Medium lösliche Substanzen und Formulierungen, jedoch keine wasserunlöslichen Substanzen oder Formulierungen wie zum Beispiel Cremes verwendet werden.
  • Worin das Philpott-Model eine wirkliche Weiterentwicklung darstellte war die Tatsache, dass auch ein Versuch unternommen wurde, isolierte Haarfollikelsegmente in rekonstruierte Hautmodelle einzufügen (siehe M. Inamatsu et al. und M. Michel et al.). Obwohl Follikel, Follikelsegmente oder dermale Papillen auf diese Weise mit der Dermis in Berührung sind, was der in vivo-Situation näher kommt, als dies bei anderen bekannten Modellen der Fall ist, sind die Nachteile dieser Systeme, wenn sie zur Untersuchung wirksamer Substanzen verwendet werden sollen, ähnlich denen, die dem Philpott Modell anhaften (geringe Verfügbarkeit der Haarfollikel, keine Standardisierbarkeit, hohe Kosten, usw.).
  • Dementsprechend bestand die Aufgabe vorliegender Erfindung darin, ein Haut/Haar-Äquivalent („Hautmodell") vorzuschlagen, insbesondere ein Haar/Hautmodell mit rekonstruierten Papillen in einer rekonstruierten Dermis, das mindestens teilweise die oben erwähnten Nachteile der früheren Technik vermeiden würde.
  • Eine weitere Aufgabe vorliegender Erfindung bestand darin, ein Haut/Haar-Äquivalent zu entdecken oder vorzuschlagen, das als ein in vitro-Modellsystem, insbesondere zum Testen und/oder Bewerten wirksamer Substanzen, insbesondere am Haarfollikel, geeignet sein würde. Ein solches Modell würde besonders zum Entdecken und Testen pharmazeutischer/medizinischer und kosmetischer Wirkprinzipien geeignet sein. Es würde auch die in vitro-Bewertung des Effekts solcher Wirkprinzipien auf den Haarfollikel, das Haarwachstum, die Haarpigmentierung, die Haarstruktur und Ähnliches ermöglichen.
  • Dementsprechend bezieht sich vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung eines Haut/Haar-Äquivalents, im Besonderen eines Haut/Haarmodells mit rekonstruierten Papillen (Pseudopapillen, PP) in einer rekonstruierten Dermis (Pseudodermis, PD), wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:
    • (a) Herstellung einer rekonstruierten Dermis (Pseudodermis, PD) oder eines Pseudodermispräparats,
    • (b) Herstellung rekonstruierter Papillen (Pseudopapillen, PP), die gezüchtete dermale Papillenzellen (Haarpapillenzellen) in einer geeigneten Matrix, insbesondere einer Gelmatrix umfassen, oder Herstellung entsprechender Vorläufer solcher rekonstruierter Papillen (Pseudopapillen, PP), die gezüchtete dermale Papillenzellen (Haarpapillenzellen) umfassen, in einem geeigneten, Matrix bildenden, insbesondere Gel bildenden Medium MFMPP, das fähig ist, eine Matrix, insbesondere eine Gelmatrix in situ, insbesondere in der rekonstruierten Dermis (Pseudodermis, PD) zu bilden,
    • (c) Einführung oder Einfügung der rekonstruierten Papillen (PP) oder deren beim Schritt (b) hergestellter Vorläufer in die Pseudodermis (PD) oder in das beim Schritt (a) hergestellte Pseudodermispräparat,
    • (d) als Option Auftrag einer rekonstruierten Epidermis (Pseudoepidermis, PE) oder eines rekonstruierten Periderms (Pseudoperiderms, PI) auf die Pseudodermis (PD).
  • Dementsprechend umfasst Schritt (a) des Verfahrens die Herstellung einer rekonstruierten Dermis oder Pseudodermis oder eines Pseudodermispräparats. Erfindungsgemäß kann jede nach der früheren Technik bekannte Pseudodermis verwendet werden, vorausgesetzt, dass sie für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet ist, was insbesondere bedeutet, dass sie mit den anderen Bestandteilen des erfindungsgemäßen Haut/Haar-Äquivalents kompatibel ist. Insbesondere umfasst die erfindungsgemäß verwandte Pseudodermis (PD) gezüchtete kontraktile Zellen, insbesondere Fibroblasten, vorzugsweise dermale Fibroblasten, in einer geeigneten Matrix. Die Matrix kann insbesondere eine auf Kollagen, vorzugsweise Kollagen vom Typ I und/oder Typ III und optional weiteren Komponenten basierende Matrix sein. Die für die Pseudodermis (PD) oder das Pseudodermispräparat gezüchteten kontraktilen Zellen können auf die bekannte Weise gewonnen werden, zum Beispiel durch Isolierung dermaler Fibroblasten aus menschlicher oder tierischer Haut und, nach Züchtung, durch Gewinnung der kontraktilen Zellen aus den resultierenden Monolagekulturen (zum Beispiel durch moderate Trypsinisation). Ein geeignetes Nährmedium, das insbesondere mit den kontraktilen Zellen kompatibel sein sollte, wird für die Züchtung solcher Zellen verwandt. Gemäß der Erfindung ist ein Beispiel eines geeigneten Nährmediums das essentielle minimale Medium MEM (Modified Eagle Medium = modifizierte Eagle-Medium).
  • Die Pseudodermis (PD) kann dann durch Mischen der kontraktilen Zellen, die aus Monolagekulturen gewonnen wurden und optional in einem geeigneten Nährmedium vorliegen, mit einem Matrix bildenden, insbesondere Gel bildenden Medium MFMPD, das mindestens einen Matrixbilder MFPD, im Besonderen einen Gelbilder, und optional weitere Bestandteile umfasst, hergestellt werden.
  • Im Zusammenhang der Erfindung wird die resultierende Mixtur das Pseudodermispräparat genannt. Je nach der Konzentration des Matrix bildenden Mediums bildet das Pseudodermispräparat eine Matrix, vorzugsweise eine Gelmatrix, relativ schnell (höhere Konzentration des Matrix bildenden Mediums) oder relativ langsam (niedrigere Konzentration) und schrumpft schließlich optional unter Ausstoß des eventuell vorhandenen Nährmediums zu einer Pseudodermis (PD) zusammen. Sämtliche Phasen und Stadien des Matrix bildenden Verfahrens und des Schrumpfungsprozesses werden insgesamt mit dem Begriff „Pseudodermispräparat" bezeichnet. Dementsprechend wird die Pseudodermis bei Vollendung der Matrixbildung und Schrumpfung des Pseudodermispräparats gewonnen.
  • Der Matrixbilder MFPD, insbesondere Gelbilder des Matrix bildenden, insbesondere Gel bildenden Mediums MFMPD kann insbesondere ein Matrixbilder sein, der auf Kollagen, vorzugsweise Kollagen vom Typ I und/oder Typ III und optional weiteren Komponenten basiert (zum Beispiel Bestandteilen der extrazellulären Matrix der Dermis, vorzugsweise Matrix- und/oder Skleroproteinen wie das Laminin).
  • Ein geeignetes Nährmedium, insbesondere essentielles minimales Medium MEM und optional weitere Komponente können optional auf die so hergestellte oder erzeugte Pseudodermis (PD) aufgetragen werden.
  • Die beim Schritt (b) hergestellten Pseudopapillen (PP) umfassen gezüchtete dermale Papillenzellen (Haarpapillenzellen) auf einem geeigneten Träger und/oder in einer geeigneten Matrix. Die Matrix kann vor allem eine auf Kollagen, insbesondere Kollagen vom Typ IV und optional weiteren Komponenten basierende Matrix sein. Die gezüchteten dermalen Papillenzellen (Haarpapillenzellen) können auf die bekannte Weise hergestellt werden, zum Beispiel durch Isolierung dermaler Papillenzellen (Haarpapillenzellen) aus Haarfollikeln menschlicher oder tierischer Haut und, nach Züchtung, durch Gewinnung der dermalen Papillenzellen aus den resultierenden Monolagekulturen, insbesondere durch moderate Trypsinisation. Die Anzahl der Durchgänge sollte klein sein, wobei die Anzahl der Durchgänge für die dermalen Papillen im Allgemeinen zwischen 1 und 10 und vorzugsweise zwischen 1 und 3 beträgt. Die dermalen Papillenzellen werden in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet, wobei das verwendete Nährmedium insbesondere ein essentielles minimales Medium (MEM) ist, zum Beispiel das DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) und/oder RPMI Medium (ein vom Roswell Park Memorial Institute entwickeltes Medium) und/oder Chang Medium, optional zusammen mit anderen Komponenten, zum Beispiel mit fetalem Kalbserum (FCS), Kollagen, insbesondere vom Typ I, und Ähnlichem. Beispiele von erfindungsgemäß zur Züchtung von dermalen Papillenzellen geeigneten Nährmedien sind alle auf RPMI oder DMEM basierende Zellkulturmedien, wie zum Beispiel RPMI 1640 (Sigma), das 20 % FCS enthält, Chang Medium (Irvine Scientific), das 10 % FCS enthält, und Ähnliches.
  • Die Pseudopapillen (PP) werden dann durch Mischen der Papillenzellen hergestellt, die aus Monolagekulturen gewonnen wurden und optional in einem geeigneten Nährmedium mit einem Matrix bildenden, insbesondere Gel bildenden Medium MFMPP, das mindestens einen Matrixbilder MFPP, insbesondere einen Gelbilder und optional weitere Bestandteile enthält, vorliegen; die resultierende Mixtur bildet eine Matrix, vorzugsweise ein Gel, und schrumpft dann unter Ausstoß des eventuell vorhandenen Nährmediums zusammen. Die Pseudopapillen (PP) können dann gebildet werden (zum Beispiel durch Stanzen oder Ausschneiden) aus der geschrumpften Matrix oder dem geschrumpften Gel.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführung werden die Pseudopapillen (PP) durch Wachstum von dermalen Papillenzellen auf einem geeigneten Träger gewonnen. Bereits wechselwirkende Zellgruppen können so vorteilhaft auf ähnliche Weise wie die Papille hergestellt werden.
  • Der Träger kann sowohl porös als auch nicht porös sein und keine Poren oder kleine oder große Poren aufweisen. Eine poröse Oberfläche wird bevorzugt, damit die Papillenzellen besser die natürlichen dreidimensionalen Aggregate imitieren können. Ein quellendes Trägermaterial (zum Beispiel auf der Basis von Polysacchariden oder Polypeptiden) oder ein nicht quellendes Trägermaterial (wie zum Beispiel Polymere) kann auch verwendet werden.
  • Die Trägergröße (oder Partikelgröße, d.h. der Durchmesser oder die größte Ausdehnung in einer Dimension) liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 50 bis 2.000 μm, bevorzugter im Bereich von 100 bis 1.000 μm. Partikelgrößen von etwa 100 bis 500 μm werden besonders bevorzugt, weil einerseits die Handhabungsfähigkeit bei der Herstellung der Pseudopapillen und andererseits eine genügend große Ähnlichkeit mit einer wirklichen Haarpapille gewährleistet sind. Geeignete Träger sind insbesondere die so genannten Mikroträger, kleine kugelförmige Partikel, auf denen Zellen in dreidimensionaler Geometrie wachsen.
  • Träger irgendeiner dreidimensionalen Form können verwendet werden. Kugelförmige, kegelförmige oder zylindrische und polyedrische, runde oder ellipsoidische, abgeflachte oder polygonale (zum Beispiel hexagonale) Träger sind geeignet, wobei kugelförmige besonders bevorzugt werden, weil sie fähig sind, die Form der Papille besonders gut zu imitieren.
  • Der Träger kann aus anorganischem und/oder organischem Material bestehen, das auf seiner Oberfläche sowohl verändert als auch unverändert sein kann.
  • Oberflächenveränderungen können physischer Natur sein, zum Beispiel in Form eines Überzugs des Trägers, um die Adhäsion von Partikeln, zum Beispiel Stahlpartikeln oder Polymeren (insbesondere Biopolymeren, vorzugsweise Polypeptiden und/oder Polysacchariden) zu verhindern. Eine Oberflächenveränderung kann mit Matrix bildenden Proteinen, insbesondere Kollagen, vorzugsweise Kollagen vom Typ I, III und IV, und Matrix- und/oder Skleroproteinen (vorzugsweise Laminin, Gelatine, Chitosan, Glukosaminen, Glukosaminoglukanen (GAG), Heparansulfatproteoglukanen, Sulfatglykoproteinen wie Nidogen (spezieller Entaktin), Gewebeplasminogenaktivator, Matrigel® und Mixturen der oben erwähnten Bestandteile geschehen.
  • Die Oberfläche kann jedoch auch durch chemische Veränderung verändert werden. Zum Beispiel können verschiedene Oberflächenchargen erreicht werden, wenn die Oberfläche nicht bereits durch das Trägermaterial selbst befrachtet ist. Träger, die durch Oberflächenveränderung einer vernetzten Dextranmatrix mit N,N-Diethylaminoethyl-Gruppen positiv befrachtet sind, werden beispielhaft erwähnt.
  • Glas, Silikone oder Polymermatrizen, zum Beispiel Polystyrene, usw., sind geeignet. Matrizen aus Polysacchariden wie Dextran oder Polypeptiden wie Gelatine sind besonders geeignet. Vernetzte Polymere wie vernetzte Gelatine (speziell hochvernetzte Gelatine zum Beispiel Cultisphere®, Percell) oder vernetztes Dextran sind auch besonders geeignet.
  • Die Pseudopapillen können einfach hergestellt werden durch Hinzufügen des Trägers zur Papillenzellkultur. Inkubationszeiten von einem bis mehreren Tagen oder sogar- mehreren Wochen können geeignet sein, je nach der Zellwachstumsdichte. Durchgehendes, aber nicht übertrieben intensives Mischen des Kulturmediums wird bevorzugt, um optimales Zellwachstum auf der Trägeroberfläche zu gewährleisten. Zum Beispiel sind leichtes Umrühren oder Schütteln oder sogar Züchtung in Wirbelbett- oder Rührreaktoren oder Schleuderflaschen geeignet.
  • Die aus dem mit Papillenzellen bedeckten Träger gebildeten Pseudopapillen können dann in die zubereitete Pseudodermis oder in das Pseudodermispräparat eingebettet werden.
  • Wie nachstehend beschrieben wird, können Pseudopapillen (PP) jedoch auch in situ gebildet werden, insbesondere in der Pseudodermis (PD). Das Matrix bildende, insbesondere Gel bildende Medium MFMPP enthält als Matrixbilder MFPP, insbesondere als Gelbilder, mindestens ein Kollagen, insbesondere ein Kollagen vom Typ IV und optional weitere Bestandteile, die insbesondere aus der Gruppe von Matrix- und/oder Skleroproteinen ausgewählt sind, insbesondere aus Laminin, Gelatine, Chitosan, Glukosaminen, Glukosaminoglukanen (GAG), Heparansulfatproteoglukanen, Sulfatglykoproteinen wie dem Nidogen (spezieller Entaktin), Gewebeplasminogenaktivator und Wachstumsfaktoren wie dem Gewebewachstumsfaktor Beta (TGF-β), dem Fibroblastwachstumsfaktor und anderen Wachstumsfaktoren aus dem Engelbreth-Holm-Swarm-Tumor (EHS-Tumor) und/oder humaner Plazenta und Mixturen aus den oben genannten Bestandteilen. Erfindungsgemäß sind die folgenden Substanzen zum Beispiel geeignete Matrixmaterialien für die Bildung von Pseudopapillen (PP): Matrigel® Basement Mebrane Matrix (Matrigel®), Kollagen, Gelatine, Kollagen/Chitosan/GAG (GAG= Glukosaminoglukan), Glukosamin oder irgendein anderer Typ Matrix und Mixturen dieser Substanzen. Kollagen, Matrigel® und Mixturen davon werden besonders bevorzugt. Matrigel® und Mixturen in einem Verhältnis von 0,1 : 1 bis 10 : 1 (Kollagen : Matrigel®) werden am meisten bevorzugt.
  • Wie oben erwähnt können die Pseudopapillen (PP) aus der Matrix, insbesondere dem Gel, gebildet werden, wobei das Bilden/Formen der Pseudopapillen (PP) entweder vor oder nach Einführung oder Einfügung der Pseudopapillen (PP) oder ihrer Vorläufer beim Schritt (c) stattfindet. Die durch auf geeigneten Trägern wachsende Papillenzellen gebildeten Pseudopapillen, wobei jeder Trägerpartikel als eine Pseudopapille angesehen werden kann, können in einer solchen Matrix auch derart verwendet werden, dass makroskopische Pseudopapillen produziert werden.
  • Sowohl der Matrixbilder MFPD für die Bildung der Pseudodermis (PD) als auch der Matrixbilder MFPP für die Bildung der Pseudopapillen (PP) sollte fähig sein, beim Erhitzen, insbesondere bei Temperaturen von 20°C bis 40°C, zu gelieren, zum Beispiel im Prozess zu polymerisieren und Wachstum und Differenzierung von Zellen zu fördern. Die Matrix der Pseudodermis (PD) und die Matrix der Pseudopapillen (PP) bilden im Allgemeinen dreidimensionale Strukturen. Die Bildung der Matrix, insbesondere des Gels, kann reversibel oder irreversibel sein, obwohl sie vorzugsweise irreversibel ist.
  • Die Einführung oder Einfügung der Pseudopapillen (PP) beim Schritt (c) kann auf verschiedene Weise ausgeführt werden:
    In einer Ausführung werden zuerst zur Aufnahme der Pseudopapillen (PP) geeignete Höhlen geformt, vorzugsweise in der bereits geschrumpften Pseudodermis (PD), insbesondere durch Stanzen oder Stechen, und dann werden die Pseudopapillen (PP), die gezüchtete Papillenzellen umfassen und so geformt sind, dass ihre Maße den in der Pseudodermis (PD) gebildeten Höhlen entsprechen, in diese Höhlen eingeführt oder eingefügt (zum Beispiel durch Transplantation). Das Stanzen der Pseudodermis (PD) oder Stechen der Pseudodermis (PD) kann zum Beispiel mit einer Stanze (zum Beispiel mit einem Durchmesser von 0,5 bis 4 mm, vorzugsweise etwa 2 mm) oder mit einer Knopfkanüle oder herkömmlichen Kanüle ausgeführt werden.
  • Vor Einführen der Pseudopapillen (PP) oder deren Vorläufer können die durch Stanzen oder Stechen in der Pseudodermis (PD) ausgeführten Höhlen ausgelegt werden (zum Beispiel durch Sprayen), insbesondere mit mindestens einem Kollagen, vorzugsweise einem Kollagen vom Typ IV, und/oder sonstigen Matrixproteinen, insbesondere Basalmembranproteinen wie das Laminin. Die Höhlen werden vorzugsweise mit Mixturen von zwei oder mehreren der erwähnten Bestandteile, insbesondere mit Matrigel® ausgelegt. Wird dieses Verfahren angewandt, werden die Pseudopapillen (PP) vorzugsweise in die Pseudodermis (PD) oder das Pseudodermispräparat in einer Anzahl oder Dichte von 1 bis 50 pro cm2 Pseudodermis (PD) und insbesondere 3 bis 7 pro cm2 Pseudodermis (PD) eingeführt oder eingefügt.
  • Bei einer anderen Ausführung kann die Einführung oder Einfügung der Pseudopapillen (PP) beim Schritt (c) durch direkte Injektion oder Einfügung der Pseudopapillen (PP), die gezüchtete dermale Papillenzellen auf einem geeigneten Träger und/oder in einer geeigneten Matrix, insbesondere einer Gelmatrix, enthalten, in die Pseudodermis (PD) oder das Pseudodermispräparat erfolgen. Bei einer besonderen Ausführung findet die Einführung der Pseudopapillen in das Pseudodermispräparat statt, bevor die Schrumpfung der Pseudodermis komplett erfolgt ist. Bei einer besonders bevorzugten Ausführung kann die Einführung oder Einfügung der Pseudopapillen, vorzugsweise die Injektion, stattfinden, sobald das Pseudodermispräparat die Matrix (oder das Gel) gebildet hat, vorzugsweise vor oder bei Beginn der Schrumpfungsphase.
  • Wird dieses Verfahren angewandt (außer wenn Pseudopapillen benutzt werden, die durch mit Papillenzellen bedeckten Träger gebildet wurden), werden die Pseudopapillen (PP) wieder vorzugsweise in die Pseudodermis (PD) oder das Pseudopräparat in einer Anzahl oder Dichte von 1 bis 50 pro cm2 Pseudodermis (PD) und insbesondere 3 bis 7 pro cm2 Pseudodermis (PD) eingeführt oder eingefügt.
  • Bei der Injektion von auf geeigneten Trägern wachsenden Papillenzellen, die individuelle Pseudopapillen darstellen, werden vorzugsweise 100 bis 100.000 Pseudopapillen pro cm3 Pseudodermis eingeführt.
  • Alternativ können auch die Vorläufer solcher Pseudopapillen (PP) in die Pseudodermis (PD) oder das Pseudopräparat eingeführt oder eingefügt werden. Diese Vorläufer bestehen in einer Mixtur der gezüchteten dermalen Papillenzellen und mindestens einem Matrixbilder MFPP, wie oben beschrieben, so dass diese Mixtur dann die Matrix und also die Pseudopapillen (PP) in situ in der Pseudodermis (PD) oder im Pseudopräparat, insbesondere durch Gelieren bildet, d. h. bei dieser Ausführung werden die Pseudopapillen (PP) in situ in der Pseudodermis (PD) oder dem Pseudopräparat gebildet.
  • Bei einer weiteren besonders bevorzugten Ausführung kann die Einführung oder Einbettung der Pseudopapillen (PD) beim Schritt (c) durch direktes Mischen der Pseudopapillen (PP), die die gezüchteten dermalen Papillenzellen auf einem Träger enthalten, mit den kontraktilen Zellen und dem Matrix bildenden, insbesondere Gel bildenden Medium MFMPD, das mindestens einen Matrixbilder MFPD insbesondere Gelbilder und optional weitere Bestandteile enthält, während der Herstellung der Pseudodermis erfolgen. Dieses frühe Mischen der Pseudopapillen mit dem Pseudopräparat führt zu einem einheitlichen Haut/Haar-Äquivalent. Die durch die auf den Trägern wachsenden Papillenzellen gebildeten Pseudopapillen können in die Pseudodermis (PD) in einer Dichte von 5.000 bis 1.000.000 PP pro cm3 Pseudodermis (PD) und insbesondere in einer Dichte von 10.000 bis 80.000 Pseudopapillen (Trägerpartikeln) pro cm3 Pseudodermis (PD) eingeführt oder eingefügt werden. Die durch die auf den Trägern wachsenden Papillenzellen gebildeten Pseudopapillen können in die Pseudodermis (PD) in einer Dichte von 1.000 bis 100.000 PP pro cm3 Pseudodermispräparat (PD) und insbesondere in einer Dichte von 1.500 bis 60.000 Pseudopapillen (Trägerpartikeln) pro cm3 Pseudodermispräparat (PD) eingeführt oder eingefügt werden.
  • Um das in vivo-System auf realistische Weise anzupassen, findet die Einführung oder Einfügung beim Schritt (c), insbesondere wenn Stanzen eingeführt und die Pseudopapillen (PP) oder ihre Vorläufer in die Pseudodermis (PD) injiziert werden, in einem Winkel von 30° bis 90° und insbesondere 40° bis 60° zur Ebene der Pseudodermis (PD) statt.
  • Die Einführung oder Einfügung der Pseudopapillen (PP) in die Pseudodermis (PD) kann in regelmäßigen Abständen ausgeführt werden.
  • Vor oder nach dem Einführen oder Einfügen der Pseudopapillen (PP) oder ihrer Vorläufer beim Schritt (c) kann optional eine rekonstruierte Epidermis (Pseudoepidermis, PE) oder ein rekonstruiertes Periderm (Pseudoperiderm, PI) auf die Pseudodermis (PD) beim Schritt (d) aufgetragen werden. Die Pseudoepidermis wird vorzugsweise nach dem Einführen oder Einfügen der Pseudopapillen (PP) oder ihrer Vorläufer beim Schritt (c) aufgetragen. Die Pseudoepidermis (PE) oder das Pseudoperiderm (PI) kann gezüchtete Keratinozyten, Haarfollikelkeratinozyten (ORS und/oder Matrixkeratinozyten), insbesondere Keratinozyten der äußeren Haarwurzelhülle (ORS Keratinozyten) und/oder epidermale Keratinozyten und optional Melanozyten, insbesondere Melanozyten der äußeren Haarwurzelhülle (ORS Melanozyten) und/oder epidermale Melanozyten und optional weitere Bestandteile umfassen. Die Keratinozyten und eventuell vorhandenen Melanozyten können einzeln in getrennten Monolagen oder Multilagen oder zusammen in Beimengung als Monolage oder Multilage auf die Pseudodermis (PD) aufgetragen werden. Je nach verwandtem Medium können insbesondere die Keratinozyten der äußeren Haarwurzelhülle (ORS Keratinozyten) ein Pseudoperiderm (PI) bilden. Das Pseudoperiderm mit seiner peridermähnlichen Struktur entspricht den Bedingungen in der embryonalen Follikelmorphogenese. Dies hat den Vorteil, dass die natürlichen Bedingungen, insbesondere die direkte und indirekte Zell/Zell- und/oder Zell/Matrix-Wechselwirkungen, die in dreidimensionaler Geometrie beobachtet werden, auf diese Weise untersucht oder beeinflusst werden können.
  • Eine Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann wie folgt durchgeführt werden:
    Um das Modell herzustellen, wird zunächst eine Pseudodermis (PD) aus epidermalen Fibroblasten in einer Kollagenmatrix zubereitet. „Höhlen" können dann in die Pseudodermis (PD) in einem gewissen Winkel (zum Beispiel 30° bis 90°) gestanzt und sodann optional mit Basalmembranproteinen (zum Beispiel Laminin, Kollagen IV, usw.) oder zum Beispiel mit Matrigel®, einer Mixtur aus Basalmembranproteinen, oder Mixturen aus Matrigel mit Kollagen (insbesondere Kollagen vom Typ I) ausgelegt werden. Rekonstruierte Papillen (Pseudopapillen, PP) werden dann in die „Höhlen" eingefügt. Diese rekonstruierten Papillen können durch Mischen von aus Haarfollikelpapillen gezüchteten dermalen Papillenzellen mit einem Gel, zum Beispiel Matrigel® oder Kollagen (insbesondere Kollagen vom Typ I) oder einer Mixtur davon, und Gelieren des Gemischs in einer kleineren Anzahl von Durchgängen gewonnen werden. Nach dem Gelieren können die Pseudopapillen (PP) aus dem Gel gestanzt und in, die Pseudodermis (PD) eingefügt werden. Jedoch kann das Gelieren auch in situ nach Einführung in die Pseudodermis erfolgen. Alternativ können die in Matrigel® eingebetteten dermalen Papillenzellen jedoch auch direkt in die Pseudodermis (PD) injiziert werden, ohne dass zuvor „Höhlen" gestanzt worden sind, oder die in Matrigel® eingebetteten dermalen Papillenzellen werden in die Pseudodermis (PD) durch einen Stechkanal eingeführt.
  • Schließlich kann eine Zellschicht von Haarfollikelmelanozyten und/oder Haarfollikelkeratinozyten (ORS und oder Matrixkeratinozyten) auf die Pseudodermis (PD) aufgetragen werden.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird daher die Papille aus gezüchteten dermalen Papillenzellen auf einem geeigneten Träger und/oder geeigneten Gelbilder (zum Beispiel Matrigel®) durch Einführung oder Einfügung (zum Beispiel Injektion, Transplantation, usw.) in das Pseudodermispräparat oder in die Pseudodermis (PD) rekonstruiert. Optional kann dies auch durch eine Form der Abgrenzung von der Umgebung erfolgen. Die rekonstruierten Papillen (Pseudopapillen, PP) umfassen eine Kombination aus einem geeigneten Gelbilder (zum Beispiel Matrigel®) und gezüchteten dermalen Papillenzellen. Gemäß der Erfindung werden die Papillen zum Beispiel durch Einfügen der so genannten Pseudopapillenbolzen, die wie der Haarfollikel eine dreidimensionale Struktur aufweisen, in die Pseudodermis (PD) zum Beispiel durch direkte Injektion dermaler, zum Beispiel in Matrigel® eingebetteter Papillenzellen in das rekonstruierte dermale Fach rekonstruiert.
  • Bei einer bevorzugten Ausführung können die Pseudopapillen auch durch wachsende Papillenzellen auf einem geeigneten Träger rekonstruiert werden. Die Papillenzellen können dann entweder in die vorgeformten „Höhlen" in der Pseudodermis eingefügt oder einfach durch Druck in sie integriert oder direkt mit den kontraktilen Zellen und dem Gelbilder (oder dem Pseudodermispräparat) während der Herstellung der Pseudodermis gemischt werden.
  • Die Pseudopapille (PP) beeinflusst die Struktur der optional darüber liegenden Pseudoepidermis (PE) oder des Pseudoperiderms (PI) von Keratinozyten und optional Melanozyten. Eine haarfollikelähnliche Struktur wird unter diesen Bedingungen gebildet. Das auf diese Weise hergestellte Modell kann zum Beispiel dazu verwendet werden, Substanzen (pharmakologische, kosmetische, usw.) für Haarwachstum und Haarstruktur und die Wirkung von Substanzen auf die Haarpigmentierung zu untersuchen.
  • 1 ist eine schematische Darstellung einer besonderen Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Eine auf Fibroblasten in einer Matrix aus Kollagen vom Typ I basierende Pseudodermis (PD) ist unter (1) dargestellt. Unter (2) ist ein Vorläufer einer Pseudopapille dargestellt, bestehend aus einer Mixtur gezüchteter dermaler Papillenzellen und mindestens einem Matrixbilder MFPP, aus dem die tatsächlichen Pseudopapillen (PP) dann, zum Beispiel durch direkte Injektion, gebildet werden können, so dass diese Mixtur dann die Matrix und also die Pseudopapillen (PP) in situ in der Pseudodermis (PD), insbesondere durch Gelieren bildet. Das unter (3) gezeigte rekonstruierte Papillenmodell ist damit hergestellt.
  • 2 ist eine schematische Darstellung einer weiteren besonderen Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Unter (1) ist eine auf Fibroblasten in einer Matrix aus Kollagen vom Typ I basierende Pseudodermis (PD) dargestellt, in die Höhlen oder Öffnungen für die Einpassung der Pseudopapillen (PP) gestanzt wurden, wobei die Höhlen optional ausgelegt sind durch Sprayen mit Kollagen vom Typ IV oder mit Matrigel®. Unter (2) ist eine Pseudopapille dargestellt, die aus einem auf Gelatine basierenden Mikroträger und darauf gewachsenen dermalen Papillenzellen besteht. Unter (3) werden die aus den Mikroträgern gebildeten Pseudopapillen (PP) in die Pseudodermis (PD) eingeführt oder eingefügt (zum Beispiel durch Injektion). Das unter (4) gezeigte rekonstruierte Papillenmodell ist damit hergestellt.
  • Follikelähnliche oder follikelartige Strukturen einschließlich solcher, die an die frühesten Stadien der Haarmorphogenese (Morphogenesestadien I bis III) erinnern, wie das Periderm zum Beispiel, werden dann zu diesem unter (5) dargestellten dreidimensionalen Haar-/Hautmodell geformt.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf das durch das erfindungsgemäße Verfahren herstellbare Haar/Haut-Äquivalent.
  • Das erfindungsgemäße Haar/Haut-Äquivalent ist insbesondere ein Haut/Haarmodell mit insbesondere dreidimensional geformten, optional räumlich abgegrenzten rekonstruieren Papillen (Pseudopapillen, PP) mit follikelähnlichen oder follikelartigen Strukturen, einschließlich solcher, die an die frühesten Stadien der Haarmorphogenese, d. h. Morphogenesestadien I bis III, erinnern, wobei das Haut/Haar-Äquivalent eine rekonstruierte Dermis (Pseudodermis, PD), in die die Pseudopapillen (PP) eingeführt oder eingefügt werden, wobei die Pseudopapillen (PP) aus gezüchteten dermalen Papillenzellen (Haarpapillenzellen) auf einem geeigneten Träger und/oder einer geeigneten Matrix, insbesondere Gelmatrix bestehen, und eine rekonstruierte Epidermis (Pseudoepidermis, PE) oder ein Pseudoperiderm (PI), die optional auf die Pseudodermis (PD) aufgetragen sind, umfasst.
  • Dementsprechend umfasst das Haut/Haar-Äquivalent, insbesondere das Haarfollikelmodell erfindungsgemäß im Allgemeinen eine Pseudodermis (PD) mit darin rekonstruierten dermalen Papillen (Pseudopapillen, PD). Eine oder mehrere Schichten von Keratinozyten, die sich selbst in eine Pseudoepidermis (PE) oder ein Pseudoperiderm (PI) umbilden oder umgebildet haben, und optional eine oder mehrere Schichten von Melanozyten können über der Pseudodermis (PD) aufgetragen werden. Dieses in vitro-Modell ist zum Beispiel für Wirksamkeits- oder Verträglichkeitstests auf dem Gebiet der Pharmazie, Medizin und Kosmetik geeignet. Follikelähnliche oder follikelartige Strukturen, einschließlich solcher, die an die frühesten Stadien der Haarmorphogenese (Morphogenesestadien I bis III) erinnern, werden zu einem erfindungsgemäßen dreidimensionalen Haar-/Hautmodell geformt.
  • Vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung des erfindungsgemäßen Haut/Haar-Äquivalents, wie sie in den Ansprüchen 32 bis 37 beschrieben ist. Zusätzlich kann bezüglich weiterer Details auf die vorstehenden Beobachtungen über das erfindungsgemäße Verfahren und das erfindungsgemäße Haut/Haar-Äquivalent, die entsprechend auch für die erfindungsgemäße Benutzung gelten, Bezug genommen werden.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein System, insbesondere ein Testsystem (zum Beispiel ein Siebsystem), das das erfindungsgemäße Haut/Haar-Äquivalent umfasst. Zusätzlich kann bezüglich weiterer Details auf die vorstehenden Beobachtungen über das erfindungsgemäße Verfahren, das erfindungsgemäße Haut/Haar-Äquivalent und die erfindungsgemäße Benutzung, die entsprechend auch für das erfindungsgemäße System gelten, Bezug genommen werden.
  • Die vorliegende Erfindung bietet eine Anzahl von Vorteilen:
    Das erfindungsgemäße Haut/Haar-Äquivalent ist ein rekonstruiertes Modell, das in größerem Maße standardisierbar ist als der isolierte Haarfollikel. Es reduziert den Bedarf an Haarfollikeln und kommt der in vivo-Situation näher als Monolagesysteme. Außerdem stellt es eine Alternative zu Tierversuchen dar.
  • Das erfindungsgemäße rekonstruierte Modell ist ein komplexes dreidimensionales Modell, das den Haarfollikel in vivo in seiner Struktur und histologischen Zusammensetzung simuliert, wodurch sich ein hoher Grad an Relevanz der über Wirksamkeit und Verträglichkeit der wirksamen Substanzen (Kosmetika, Pharmazeutika, usw.) gelieferten Informationen ergibt.
  • Die folgenden Endpunkte können inter alia ausgewertet und gemessen werden, um Informationen über die Wirksamkeit von Substanzen in Bezug auf eine Verbesserung der Haarstruktur und Beeinflussung des Haarwachstums zu erhalten: Proliferation/Apoptosis der Keratinozyten über die Pseudopapille; Struktur und Anordnung der Keratinozyten über die Pseudopapille; Struktur der Epidermis; Struktur des Stratum corneum; Volumen und Struktur der dermalen Papille; Analyse von gewissen haarspezifischen Proteinen (insbesondere haarspezifischen Keratinen); Analyse von Zytokinen, Chemokinen und alle Arten von Botensubstanzen, die inter alia durch die dermale Papille gebildet werden; Haaranordnungsanalysen; Proteom- und Expressionsanalysen, usw.
  • Das erfindungsgemäße rekonstruierte Haarfollikelmodell ist das einzige rekonstruierte Haarfollikelmodell, mit dem Einflüsse auf die Haarpigmentierung gemessen werden können (zum Beispiel Pigmentierung der amelanotischen ORS Melanozyten, Melaninsynthese, Melaningranula, Anordnung der Melanozyten, Wanderung der Melanozyten; Veränderung der Melanozytenmarker wie das TRP-1, TRP-2, NKI/beteb, usw. Freisetzung von Melanin an die Keratinozyten). Es kann auch zum Beispiel für die Haaranordnungsanalyse benutzt werden.
  • Das erfindungsgemäße Haar-/Hautmodell ist für verschiedene Anwendungen auf dem Gebiet der Medizin, Pharmazie und Kosmetik geeignet (zum Beispiel bei der Entdeckung wirksamer Substanzen mit einem biologischen Effekt auf den Haarfollikel durch Beeinflussung von Haarpigmentierung, Haarwachstum und Haarstruktur, bei in vitro-Testsystemen, bei Siebprozessen, für die Entwicklung kosmetischer Produkte, usw.). Das erfindungsgemäße Modell oder Äquivalent liefert Informationen über die Wirkung von Substanzen auf die Haarfollikelzellen mit in vivo-Relevanz. Das erfindungsgemäße Modell oder Äquivalent liefert Haarfollikel oder Teile von Haarfollikeln in einem dreidimensionalen Modell. Im Gegensatz zu isolierten Haarfollikeln sind die rekonstruierten Papillen (Pseudopapillen, PP) zu jeder Zeit verfügbar und standardisierbar. Dermale Papillen, die wie der Haarfollikel eine dreidimensionale Struktur aufweisen, werden rekonstruiert. Es ist auf diese Weise möglich, zu bewerten, wie angewandte wirksame Substanzen auf die Struktur des rekonstruierten dreidimensionalen Modells wirken und was hineingelesen werden kann im Hinblick auf die Wirkung dieser Substanzen auf den Haarfollikel (zum Beispiel auf Haarwachstum, Haarstruktur, Haarpigmentierung, usw.).
  • Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung, ohne sie in irgendeiner Weise einzuschränken, veranschaulichen.
  • Beispiele
  • Im Folgenden soll die Herstellung eines Haut-/Haarmodells mit rekonstruierten dermalen Papillen (Pseudopapillen, PP), die in eine Pseudodermis (PD) eingebettet oder eingefügt sind, beschrieben werden. Zu diesem Zweck werden dermale Papillenzellen entweder in die Pseudodermis (PD) injiziert oder mittels Stanzen in die Pseudodermis (PD) eingebracht. Alternativ können auf geeigneten Trägern gewachsene dermale Papillenzellen eingebettet werden durch Mischen mit dem Pseudodermispräparat. Die Pseudodermis (PD) kann nacheinander mit einer Schicht epidermaler oder Haarfollikelkeratinozyten, die eine Pseudoepidermis (PE) oder ein Pseudoperiderm (PI) darstellen, und optional mit Melanozyten bedeckt werden.
  • Die in folgender Tabelle erläuterten Definitionen werden im Folgenden verwendet:
  • Abkürzungen
    Figure 00220001
  • Figure 00230001
  • Verfahren und Methoden:
  • Zubereitung der einzelnen Zellkulturen
  • Dermale Fibroblasten
  • Dermale Fibroblasten werden aus menschlicher Vorhaut isoliert. Epidermis und Dermis der Vorhaut werden enzymatisch mit Thermolysin (0,5 mg/nl HEPES Puffer) voneinander getrennt. Um die Fibroblasten zu extrahieren wird die Dermis mit Kollagenase H (0,2 E/ml, Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland) verdaut (3 bis 4 Stunden lang bei 37°C). Nach der Inkubationsphase wird die Lösung sorgfältig gemischt, um die Zellen auszudünnen, durch ein Zellsieb gefiltert und die Zellen werden heraus zentrifugiert. Die Züchtung erfolgt im Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit Giutamax I (L-Alanyl-L-Glutamin) und Natriumpyruvat, 4.500 mg L–1 Glukose und Pyridoxin (Gibco BRL, Karlsruhe, Deutschland), angereichert mit 10 % fetalem Kalbserum (FCS) (Gibco BRL, Karlsruhe, Deutschland), 25 μg mL–1 Gentamyzin (Sigma, Taufkirchen, Deutschland) und 100 IE mL–1 Penizillin G (Sigma) [1].
  • Epidermale Keratinozyten
  • Dermale Fibroblasten werden aus menschlicher Vorhaut isoliert. Epidermis und Dermis der Vorhaut werden enzymatisch mit Thermolysin (0,5 mg/nl HEPES Puffer) voneinander getrennt. Um die Keratinozyten zu extrahieren wird die Epidermis mit Trypsin (Gibco BRL, Karlsruhe, Deutschland) verdaut (20 Minuten bei 37°C). Nach der Inkubationsphase wird die Lösung sorgfältig gemischt, um die Zellen auszudünnen, durch ein Zellsieb gefiltert und die Zellen werden heraus zentrifugiert. Die Züchtung erfolgt in einer Mixtur von DMEM Glutamax I und Ham's F 12 (Sigma) (3 : 1), angereichert mit Serum eines neugeborenen Kalbes (NCF, fetaler Klon II, Hyclone), epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) (Sigma), Insulin (Sigma), Hydrokortison (Sigma), Triiod-L-Thyronin (Sigma), Adenin (Sigma), Choleratoxin (Sigma) und Antibiotika [1] auf Futterschichten (dermalen Fibroblasten, die mit 60 Gray bestrahlt wurden, um die Proliferation zu hemmen).
  • Keratinozyten der äußeren Haarwurzelhülle (ORS Keratinozyten)
  • ORS Keratinozyten werden aus menschlichen, vom Hinterkopf ausgerupften Haaren isoliert. Um die Keratinozyten zu extrahieren, wird zunächst die verbliebene Haarzwiebel mit einem Skalpell entfernt und die Follikel mit Trypsin (Protease von Gibco BRL, Karlsruhe, Deutschland) verdaut (40 Minuten bei 37°C). Nach der Inkubationsphase wird die Lösung sorgfältig gemischt, um die Zellen auszudünnen, durch ein Zellsieb gefiltert und die Zellen werden heraus zentrifugiert. Die Züchtung erfolgt in einer Mixtur von DMEM Glutamax I und Ham's F 12 (Sigma) (3 : 1), angereichert mit Serum eines neugeborenen Kalbes (NCF, fetaler Klon II, Hyclone), epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) (Sigma), Insulin (Sigma), Hydrokortison (Sigma), Triiod-L-Thyronin (Sigma), Adenin (Sigma), Choleratoxin (Sigma) und Antibiotika [1] auf Futterschichten (dermalen Fibroblasten, die mit 60 Gray bestrahlt wurden, um die Proliferation zu hemmen).
  • ORS Melanozyten werden durch die Methode von Tobin et al. isoliert [3].
  • Dermale Papillenzellen
  • Dermale Papillenzellen werden aus dem Skalp (der temporalen oder okzipitalen Region) mit intakten Haarfollikeln isoliert. Zu diesem Zweck wird die obere Dermis entfernt und die Follikel zusammen mit der dermalen Papille mit Hilfe einer Uhrmacherpinzette aus der Dermis ausgerupft. Die weitere Isolierung der dermalen Papille erfolgt sodann unter einem Stereo-Vergrößerungsglas. Die dermale Papille wird dann mittels einer Mikrokapillare zu einer mit Kollagen I überzogenen Kulturflasche übertragen. Die Züchtung erfolgt entweder in einem RPMI 1640 Medium, das Glutamin (Sigma), angereichert mit 20 % fetalen Kalbserums (FCS) (Gibco BRL, Karlsruhe, Deutschland), und Antibiotika enthält oder in Chang's Medium, das 10 % fetalen Kalbserums enthält [2].
  • Produktion der Pseudodermis (PD)
  • Um das Haarmodell herzustellen wird zunächst die Pseudodermis (PD) entwickelt. Zu diesem Zweck werden dermale Fibroblasten des vierten Durchgangs mit Kollagen I aus der Rattenschwanzsehne gemischt und in Multiquellböden gesät. Ziel dieses Vorgehens ist es, die Anzahl der Zellen, die Züchtungszeit, die Schichtdicke und Größe des Dermis-Äquivalents (Pseudodermis, PD) zu optimieren. Die Herstellung erfolgt sodann nach folgendem Schema: 1 Teil HBSS Puffer (Gibco BRL) wird mit 8 Teilen einer Kollagenlösung (Becton Dickinson) gemischt und mit 1 M Natriumhydroxid neutralisiert. Die erforderliche Menge von Zellen wird zu 1 Teil fetalen Kalbserums (FCS, Gibco BRL) hinzu gefügt. Die erhaltene Mixtur (Pseudopräparat) wird in Zellkulturschalen gegossen und 1 Stunde lang bei 37°C in einer Inkubationsbox inkubiert. Nach Polymerisation des Kollagens werden die Modelle mit DMEM bedeckt, das mit 10 % FCS und Penizillin/Streptomyzin ergänzt wurde. Das Medium wird dreimal pro Woche über einen Zeitraum von sieben Tagen ausgewechselt.
  • Folgende Zubereitungen wurden getestet:
  • Figure 00250001
  • Optimierung der Monolagekultur der dermalen Papillenzellen (DPC)
  • Um die Monolagekultur der dermalen Papillenzellen zu optimieren, werden zwei verschiedene Medien verwendet, um die primären Kulturen herzustellen.
    • 1. RPMI 1640 (Sigma), das 20 % FCS mit Penizillin/Streptomyzin enthält.
    • 2. Chang Medium (Irvine Scientific), das 10 % FCS enthält.
  • Einerseits werden die primären Kulturen (PO) in dem dargestellten Medium hergestellt, andererseits wird ein Test durchgeführt, um zu bestimmen, ob das für die Fortsetzung der Kulturen verwendete Medium eine Wirkung auf die Proliferation und die Morphologie und Anordnung der Zellen hat.
  • Einfluss von Matrigel® auf die Proliferation der dermalen Papillenzellen
  • Matrigel® (Becton Dickinson) kann als umgebendes Medium für die dermalen Papillenzellen, die in die Pseudodermis (PD) eingesetzt sind, verwendet werden [4,5]. Matrigel® wird aus dem Engelbreth-Holm-Swarm Tumor von Mäusen gewonnen und enthält hauptsächlich Laminin, Kollagen IV, Heparansulfatproteoglukane, Gewebeplasminogenaktivator, Nidogen (spezieller Entaktin) und auch TGF-β, FGF und andere Wachstumsfaktoren des EHS-Tumors. Um den Einfluss von Matrigel® auf die Proliferation der DPC zu untersuchen, werden primäre Kulturen der DP in mit Matrigel® überzogenen Zellkulturflaschen durchgeführt und das Wachstum wird beobachtet. Zum Vergleich werden DP gleichzeitig in Zellkulturflaschen gezüchtet, die mit Kollagen I überzogen sind.
  • Herstellung der Injektionskanäle zum Einfügen der DPC in die Pseudodermis (PD)
  • Zur Herstellung der Injektionskanäle werden eine Knopfkanüle, eine herkömmliche Kanüle und eine 2 mm Stanze verwendet. Um die Kanäle sichtbar zu machen, wird eine Lösung von 10 % Berlinblau in 1 Agaroselösung zubereitet und in das Dermis-Äquivalent injiziert unter Verwendung der Knopfkanüle und der herkömmlichen Kanüle. Werden die Stanzen benutzt, werden die mit den Biopsiestanzen hergestellten Kanäle entweder sofort oder nach 24 Stunden gefüllt unter Benutzung der Knopfkanüle. Die Kanäle werden mit Hilfe eines Stereo-Vergrößerungsglases hergestellt. Nach 24 Stunden werden die Modelle tief gefroren zum Präparieren von Kryosektionen und für die histologische Untersuchung.
  • Produktion der rekonstruierten Papillen durch Einfügen von Stanzen in die Pseudodermis (PD)
  • Zunächst werden dermale Papillenzellen des zweiten Durchgangs in einer Konzentration von 250.000 Zellen/ml mit Kollagen I aus der Rattenschwanzsehne gemischt und in Multiquellböden gesät. Die Anzahl der Zellen wurde im Einklang mit der Herstellung der Pseudodermis (PD) gewählt.
  • Die Produktion erfolgte nach folgendem Schema: 1 Teil HBSS Puffer (Gibco BRL) wurde mit 8 Teilen Kollagenlösung (Becton Dickinson) gemischt und mit 1 M Natriumhydroxid neutralisiert. Die erforderliche Menge von Zellen wurde zu 1 Teil fetalen Kalbserums (FCS, Gibco BRL) hinzu gefügt. Die erhaltene Mixtur wurde in Zellkulturschalen gegossen und 1 Stunde lang bei 37°C in einer Inkubationsbox inkubiert. Nach Polymerisation des Kollagens wurden die Modelle mit Chang Medium bedeckt, das mit 10 % FCS ergänzt wurde. Das Medium wurde dreimal pro Woche über einen Zeitraum von acht Tagen ausgewechselt.
  • Nach dieser Züchtungszeit wurden Höhlen in eine 7 Tage alte Pseudodermis mit Hilfe einer 2 mm Stanze ausgeführt. Mengen von 5 μl Matrigel wurden injiziert und 3 mm Biopsien aus der polymerisierten Kollagen/DPC Mixtur in die so gebildeten Höhlen eingefügt. Die Modelle wurden mit Chang Medium, das mit 10 % FCS ergänzt war, bedeckt und das Medium wurde dreimal pro Woche über einen Zeitraum von sechs Tagen ausgewechselt. Die Modelle wurden dann der histologischen und immunhistochemischen Auswertung unterzogen.
  • Da das Kollagen I in der dermalen Papille nicht im Haarfollikel exprimiert wird und da reines Matrigel® nicht gestanzt werden kann, wurde in einem anderen Experiment der Versuch unternommen, eine physiologischere Umgebung für dermale Papillenzellen zu kreieren. Zu diesem Zweck wurden dermale Papillenzellen des zweiten Durchgangs in einer Konzentration von 250.000 Zellen/ml mit einer Kombination aus Kollagen I aus der Rattenschwanzsehne und Matrigel® gemischt und in Multiquellböden gesät. Bei dem Produktionsverfahren wurde das normaler weise bei der Zubereitung von Gels verwandte Kollagen durch Mixturen von Kollagen/Matrigel® in unterschiedlichen Verhältnissen ersetzt.
  • Bei weiteren Experimenten wurden weitere Stanzmodelle mit einer erhöhten Zellkonzentration (zwischen 500.000 Zellen/ml und 2 × 106 Zellen/ml) und der Kombination von 1 Teil Matrigel® und 2 Teilen Kollagen I, die sich als optimal herausgestellt hat, hergestellt. Nach Vollendung wurden die Modelle der histologischen und immunhistochemischen Auswertung unterzogen.
  • Produktion der rekonstruierten Papillen durch Injektion dermaler Papillenzellen in die Pseudodermis (PD) oder das Pseudodermispräparat
  • Um sehr hohe Zelldichten herzustellen, wurden die Zellen zunächst mit Matrigel® in der erforderlichen Zellkonzentration gemischt und dann in einer gekühlten Zentrifuge heraus zentrifugiert (5 Minuten, 1 Umdrehung pro Minute, T=1°C). Das überschüssige Matrigel® wurde dann entfernt, das zurückgelassene Zellpellet mit einer Pipette aufgenommen und direkt in die Pseudodermis (PD) oder in das Pseudodermispräparat injiziert. Die auf diese Weise hergestellten Modelle wurden der histologischen und immunhistochemischen Auswertung unterzogen.
  • Produktion der rekonstruierten Papillen durch Einbettung von mit dermalen Papillenzellen überwachsenen Mikroträgern in die Pseudodermis (PD) oder das Pseudodermispräparat
  • Die Verwendung von Mikroträgern erlaubt es, dass dermale Papillenzellen in einer vorbestimmten, reproduzierbaren dreidimensionalen Struktur gezüchtet werden können, die effektiv die physiologische Konstellation im Haarfollikel simuliert. Prinzipiell sind geeignete Mikroträger jede Art von dreidimensionalen Trägern, auf denen dermale Papillenzellen gezüchtet werden können. Folgende Trägermaterialien wurden getestet:
  • Figure 00290001
  • Vor dem Einfügen in die Pseudodermis oder in das Pseudodermispräparat werden die Mikroträger präinkubiert mit dermalen Papillenzellen, so dass sie in ausreichender Dichte wachsen. Je nach dem ausgewählten Träger kann die Züchtung in einer geschüttelten oder gerührten Kultur in einem Rühr- oder Wirbelbettreaktor (Eddy pro 10, Papaspyrou Biotechnologie) oder in Schleuderflaschen erfolgen. Die dermalen Papillenzellen wurden immer mehrere Tage lang im Chang Medium gezüchtet. Während dieser Zeit wurde das Zellwachstum durch eine neutrale Rotfärbung, den MTT Test, die Bestimmung der Zellzählung und durch immunhistochemische Detektion (zum Beispiel Versican-Expression) überwacht, und so wurde die Eignung verschiedener Träger festgelegt.
  • Es ist auch möglich, nicht poröse, dermale Papillenzellen enthaltende Kalziumalginatperlen herzustellen. Zu diesem Zweck wird eine flüssige Natriumalginatlösung mit dermalen Papillenzellen gemischt und die resultierende Mixtur wird tröpfchenweise durch eine Kanüle in eine Kalziumchloridlösung eingeführt. Die Natriumionen werden durch die Kalziumionen ersetzt, woraus sich eine Polymerisation des Alginats ergibt, in welcher die Papillenzellen in das Alginat eingebaut sind.
  • Vor Einführung in die Injektionskanäle der Pseudodermis (PD) oder das Pseudodermispräparat (insbesondere mit der bereits geformten Matrix) wurden die Träger teilweise mit Matrigel® überzogen. Stattdessen oder zusätzlich können die Kanäle, in die die Mikroträger eingefügt wurden, auch mit Matrigel® ausgelegt werden.
  • Außer der Injektion der Mikroträger in die Pseudodermis oder das Pseudodermispräparat mit der geformten Matrix wurde auch das Einbetten der mit dermalen Papillenzellen überwachsenen Träger in die Pseudodermis während ihrer Produktion (d.h. in das Pseudodermispräparat) untersucht. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Volumina von mit dermalen Papillenzellen überwachsenen Trägern mit den dermalen Fibroblasten und Kollagen I gemischt und die Modelle sieben Tage lang gezüchtet.
  • Produktion eines Hautmodells einer Pseudodermis und einer Epidermis von epidermalen Keratinozyten (NHEK) oder eines Pseudoperiderms von Haarkeratinozyten (ORS Keratinozyten) (mit und ohne Pseudopapille)
  • Um das rekonstruierte Haarfollikelmodell weiter zu entwickeln, wurde die Pseudodermis auf Snapwell Einsätze (Corning Costar) nach einer Kultur von fünf Tagen übertragen und zunächst mit epidermalen Keratinozyten (500.000 Zellen pro Modell) bedeckt. Nach einer Woche der untergetauchten Züchtung im Keratinozytenmedium (DMEM Glutamax I und Ham's F 12 (Sigma) (3 : 1), angereichert mit Serum eines neugeborenen Kalbes (NCF, fetaler Klon II, Hyclone), epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) (Sigma), Insulin (Sigma), Hydrokortison (Sigma), Triiod-L-Thyronin (Sigma), Adenin (Sigma), Choleratoxin (Sigma), Ascorbyl-2-Phosphat (Sigma) und Antibiotika, wurden die Modelle zu einer Luft/Flüssigkeit-Schnittstelle übertragen und weitere zwei Wochen in DMEM Glutamax I und Ham's F 12 (Sigma) (3 : 1), angereichert mit Insulin (Sigma), Hydrokortison (Sigma), Ascorbyl-2-Phosphat (Sigma), Rinderserumalbumin (BSA) (Sigma) und Antibiotika gezüchtet.
  • Bei einer weiteren Ausführung wurden die epidermalen Keratinozyten durch ORS Keratinozyten aus dem Haarfollikel ersetzt, die mit 800.000 Zellen pro Modell gesät wurden. Die Züchtung erfolgte (untergetaucht) im Keratinozytenmedium während sieben Tagen.
  • Resultate
  • Folgende Parameter erwiesen sich als optimale Bedingungen für die Produktion der Pseudodermis (PD): 2,5 × 105 Zellen/ml Gelzubereitung (Pseudodermispräparat) werden 7 Tage lang in einem 12-Kolbenquellboden gezüchtet. Die Schichtdicke beträgt zum Zeitpunkt des Säens 10 mm. Nach 7 Tagen ist das Modell komplett geschrumpft, die verbleibende Schichtdicke beträgt 3,3 mm, was einer Schrumpfung von etwa 67 % entspricht.
  • Bei der Zubereitung der primären DPC Kulturen erwies sich die Proliferation der Zellen als besser im Chang Medium als im RPMI Medium. Wurden die Kulturen fortgesetzt, gab es keine Unterschiede beim Zellwachstum zwischen den beiden Medien. Werden beide Medien benutzt, ordnen sich die Zellen typischerweise zu Haufen an, sowohl in der primären Kultur als auch im ersten Durchgang.
  • Wurden mit Matrigel® überzogene Kulturflaschen benutzt, war das Zellwachstum langsamer im Vergleich mit den mit Kollagen I überzogenen Wachstumsoberflächen. Dies ist wahrscheinlich dem hohen Anteil an ECM Molekülen in Matrigel® zuzuschreiben, der die Zelldifferenzierung im Falle langsamen Zellwachstums fördert.
  • Eine Knopfkanüle kann benutzt werden, um die Injektionskanäle herzustellen, weil ein ausreichend breiter Kanal mit einer solchen Kanüle hergestellt werden kann, ohne die Pseudodermis (PD) zu durchstechen. Es ist auch möglich, Stanzen zu verwenden, in welchem Fall die Kanäle mit der Zell/Matrigel®-Mixtur gefüllt werden können oder Matrigel® Stanzen mit DPC können in die existierenden Kanäle eingesetzt werden.
  • Die Produktion von Pseudopapillen durch Einbetten von Mikroträgern, die mit dermalen Papillenzellen überwachsen sind, durch Injektion oder Mischen mit dem Gelpräparat (oder Pseudodermispräparat) ist besonders geeignet. Die Züchtung auf Siran Trägern in einem Wirbelbettreaktor und insbesondere die Schüttelzüchtung auf Percell Cultispheres® können mit besonderem Vorteil ausgeführt werden. Dichtes Zellwachstum auf den Oberflächen wurde in wenigen Tagen erreicht.
  • Ein Überzug der Pseudodermis mit PRS Keratinozyten im Keratinozytenmedium (siehe Anhang) führt zur Bildung eines Pseudoperiderms, während der Überzug mit epidermalen Keratinozyten (NHEK) und Keratinozyten im Luft/Flüssigkeit-Schnittstellenmedium zur Bildung einer Epidermis führt.
  • Anhang I: Zusammensetzung der Zellkulturmedien Fibroblastmedium
    Figure 00320001
  • Keratinozytenmedium
    Figure 00320002
  • Figure 00330001
  • Papillenzellmedium RPMI-1640-Medium (Gibco, BRL, Karlsruhe)
    Figure 00330002
  • Chang Medium (Irvine Scientific, Santa Ana, USA)
    Figure 00330003
  • Zusammensetzung des Chang Mediums D
    Figure 00330004
  • Medium für die Luft/Flüssigkeit-Schnittstelle
    Figure 00330005
  • Figure 00340001
  • Anhang II: Im Beispiel zitierte Bibliographie
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Claims (38)

  1. Verfahren zur Herstellung eines Haut/Haar-Äquivalents, im Besonderen eines Haut-/Haarmodells mit rekonstruierten Papillen (Pseudopapillen, PP) in einer rekonstruierten Dermis (Pseudodermis, PD), das folgende Schritte umfasst: (a) Herstellung einer rekonstruierten Dermis (Pseudodermis, PD) oder eines Pseudodermispräparats, (b) Herstellung rekonstruierter Papillen (Pseudopapillen, PP), die gezüchtete dermale Papillenzellen (Haarpapillenzellen) umfassen, auf einem geeigneten Träger und/oder in einer geeigneten Matrix, insbesondere einer Gelmatrix, oder Herstellung entsprechender Vorläufer solcher rekonstruierter Papillen (Pseudopapillen, PP), die gezüchtete dermale Papillenzellen umfassen, in einem geeigneten, Matrix bildenden, insbesondere Gel bildenden Medium MFMPP, das fähig ist, eine Matrix, insbesondere eine Gelmatrix in situ, insbesondere in der rekonstruierten Dermis (Pseudodermis, PD) zu bilden, (c) Einführung oder Einfügung der rekonstruierten Papillen (PP) oder deren beim Schritt (b) hergestellter Vorläufer in die Pseudodermis (PD) oder in das beim Schritt (a) hergestellte Pseudodermispräparat, (d) als Option Auftrag einer rekonstruierten Epidermis (Pseudoepidermis, PE) oder eines rekonstruierten Periderms (Pseudoperiderms, PI) auf die Pseudodermis (PD).
  2. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass die Pseudodermis (PD) oder das Pseudodermispräparat gezüchtete kontraktile Zellen in einer geeigneten Matrix, wobei die Matrix eine auf Kollagen, insbesondere Kollagen vom Typ I und/oder Typ III basierende Matrix ist, und optional weitere Komponente umfasst.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, dass Fibroblasten, insbesondere dermale Fibroblasten, als kontraktile Zellen für die Pseudodermis (PD) oder das Pseudodermispräparat verwendet werden.
  4. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 dadurch gekennzeichnet, dass die gezüchteten kontraktilen Zellen für die Pseudodermis (PD) oder das Pseudodermispräparat durch Isolierung dermaler Fibroblasten aus menschlicher oder tierischer Haut und, nach Züchtung, durch Gewinnung der kontraktilen Zellen aus den resultierenden Monolagekulturen, im Besonderen durch moderate Trypsinisation, hergestellt werden.
  5. Verfahren nach Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet, dass die kontraktilen Zellen, insbesondere die Fibroblasten, vorzugsweise dermale Fibroblasten, in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet werden, insbesondere unter Verwendung eines essentiellen minimalen Mediums MEM als Nährmedium.
  6. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5 dadurch gekennzeichnet, dass das Pseudodermispräparat hergestellt wird durch Mischen kontraktiler Zellen, die aus Monolagekulturen gewonnen werden und optional in einem geeigneten Nährmedium vorliegen, mit einem Matrix bildenden, insbesondere Gel bildenden Medium MFMPD für die Pseudodermis (PD), das mindestens einen Matrixbilder MFPD, im Besonderen einen Gelbilder, und optional weitere Bestandteile umfasst.
  7. Verfahren nach Anspruch 6 dadurch gekennzeichnet, dass das Pseudodermispräparat eine Matrix, vorzugsweise ein Gel bildet und zu einer Pseudodermis (PD) zusammenschrumpft, insbesondere unter Ausstoß des eventuell vorhandenen Nährmediums.
  8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7 dadurch gekennzeichnet, dass das Matrix bildende, insbesondere Gel bildende Medium MFMPD mindestens ein Kollagen, insbesondere ein Kollagen vom Typ I und/oder Typ III und optional weitere Komponente, insbesondere Bestandteile der extrazellulären, Matrix der Dermis, vorzugsweise Matrix- und/oder Skleroproteine wie das Laminin als Matrixbilder MFPD, insbesondere Gelbilder, umfasst.
  9. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 dadurch gekennzeichnet, dass ein geeignetes Nährmedium, insbesondere ein essentielles minimales Nährmedium MEM, und optional weitere Komponente auf die Pseudodermis (PD) aufgetragen werden.
  10. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9 dadurch gekennzeichnet, dass die Pseudopapillen (PP) gezüchtete Papillenzellen, insbesondere dermale Papillenzellen, in einer geeigneten Matrix, wobei die Matrix vor allem eine auf Kollagen, insbesondere Kollagen vom Typ IV, basierende Matrix ist, und optional weitere Komponenten umfassen.
  11. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10 dadurch gekennzeichnet, dass die gezüchteten dermalen Papillenzellen durch Isolierung dermaler Papillenzellen aus Haarfollikeln menschlicher oder tierischer Haut und, nach Züchtung, durch Gewinnung der dermalen Papillenzellen aus den resultierenden Monolagekulturen, insbesondere durch moderate Trypsinisation, hergestellt werden.
  12. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11 dadurch gekennzeichnet, dass die dermalen Papillenzellen in einem geeigneten Nährmedium, insbesondere unter Verwendung eines essentiellen minimalen Mediums (MEM), spezieller eines DMEM- und/oder RPMI-Mediums und/oder Chang-Mediums als Nährmedium, optional zusammen mit anderen Komponenten, insbesondere mit fetalem Kalbserum (FCS), Kollagen, insbesondere vom Typ I, und Ähnlichem, gezüchtet werden.
  13. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12 dadurch gekennzeichnet, dass die Pseudopapillen (PP) durch Wachstum von Papillenzellen, insbesondere dermalen Papillenzellen, auf einem geeigneten Träger gewonnen werden.
  14. Verfahren nach Anspruch 13 dadurch gekennzeichnet, dass der Träger eine Größe im Bereich von etwa 50 bis 2.000 μm, vorzugsweise im Bereich von 100 bis 1.000 μm und am meisten bevorzugt im Bereich von etwa 100 bis 500 μm aufweist.
  15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14 dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial aus den Polysacchariden oder Polypeptiden, insbesondere aus Gelatine oder Dextran, die vorzugsweise vernetzt sind, ausgewählt wird.
  16. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12 dadurch gekennzeichnet, dass die Pseudopapillen (PP) durch Mischen von Papillenzellen, die aus Monolagekulturen gewonnen werden und optional in einem geeigneten Nährmedium vorliegen, mit einem Matrix bildenden, insbesondere Gel bildenden Medium MFMPP für die Pseudopapillen (PP), das mindestens einen Matrixbilder MFPP, insbesondere Gelbilder und optional weitere Bestandteile umfasst, wobei die resultierende Mixtur eine Matrix, vorzugsweise ein Gel bildet und zusammenschrumpft, insbesondere unter Ausstoß des eventuell vorhandenen Nährmediums.
  17. Verfahren nach Anspruch 16 dadurch gekennzeichnet, dass das Matrix bildende, insbesondere Gel bildende Medium MFMPP als Matrixbilder MFPP, insbesondere als Gelbilder, mindestens ein Kollagen, insbesondere ein Kollagen vom Typ IV und optional weitere Bestandteile umfasst, die insbesondere aus der Gruppe der Matrix- und/oder Skleroproteine ausgewählt sind, insbesondere aus Laminin, Gelatine, Chitosan, Glukosaminen, Glukosaminoglukanen (GAG), Heparansulfatproteoglykanen, Sulfatglykoproteinen wie dem Nidogen (spezieller Entaktin) und Wachstumsfaktoren wie dem Gewebewachstumsfaktor Beta (TGF-β), dem Fibroblastwachstumsfaktor, Gewebeplasminogenaktivator und anderen Wachstumsfaktoren aus dem Engelbreth-Holm-Swarm-Tumor (EHS-Tumor) und/oder humaner Plazenta und Mixturen aus den oben genannten Bestandteilen.
  18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17 dadurch gekennzeichnet, dass die geschrumpfte Matrix, insbesondere das Gel, und/oder die Pseudopapillen (PP) in situ in der Pseudodermis (PD) oder im Pseudodermispräparat gebildet werden.
  19. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 18 dadurch gekennzeichnet, dass die Pseudopapillen (PP) aus der Matrix, insbesondere dem Gel, gebildet werden, wobei das Bilden/Formen der Pseudopapillen (PP) entweder vor oder nach Einführung oder Einfügung der Pseudopapillen (PP) oder ihrer Vorläufer beim Schritt (c) stattfindet.
  20. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 19 dadurch gekennzeichnet, dass der Matrixbilder MFPD für die Pseudodermis (PD) und/oder der Matrixbilder MFPP für die Pseudopapillen (PP) fähig sind/ist, beim Erhitzen, insbesondere bei Temperaturen von 20°C bis 40°C, zu gelieren, insbesondere bei dem Prozess zu polymerisieren und das Wachstum und die Differenzierung von Zellen zu fördern.
  21. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 20 dadurch gekennzeichnet, dass die Matrix der Pseudodermis (PD) und/oder die Matrix der Pseudopapillen (PP) eine dreidimensionale Struktur bilden/bildet.
  22. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 21 dadurch gekennzeichnet, dass die Bildung der Matrix, insbesondere des Gels, reversibel oder irreversibel ist.
  23. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 21 dadurch gekennzeichnet, dass die Einführung oder Einfügung der Pseudopapillen (PP) beim Schritt (c) dadurch ausgeführt wird, dass passende Höhlen in der Pseudodermis (PD) zur Aufnahme der Pseudopapillen (PP), insbesondere durch Stanzen oder Stechen geformt werden und dann die Pseudopapillen (PP), die gezüchtete Papillenzellen umfassen und deren Maße den auf diese Weise in der Pseudodermis (PD) gebildeten Höhlen entsprechen, in diese Höhlen eingeführt, eingefügt oder transplantiert werden oder dass die Pseudopapillen (PP) oder entsprechende Vorläufer solcher Pseudopapillen (PP) in Form einer Mixtur gezüchteter dermaler Papillenzellen und mindestens eines Matrixbilders MFPP eingeführt oder eingefügt werden, wobei die Vorläufer der Pseudopapillen (PP) dann die Matrix in situ in der Pseudodermis (PD), insbesondere durch Gelieren, bilden.
  24. Verfahren nach Anspruch 23 dadurch gekennzeichnet, dass das Stanzen oder Stechen mit einer Stanze, insbesondere mit einem Durchmesser von 0,5 bis 4 mm, vorzugsweise etwa 2 mm, oder mit einer Knopfkanüle oder herkömmlichen Kanüle ausgeführt wird.
  25. Verfahren nach Anspruch 23 oder 24 dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Einführen der Pseudopapillen (PP) oder ihrer Vorläufer die Höhlen mit mindestens einem Kollagen, insbesondere einem Kollagen vom Typ IV und/oder anderen Matrixproteinen, insbesondere basalen Membranproteinen wie dem Laminin ausgelegt werden.
  26. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 23 dadurch gekennzeichnet, dass die vorgefertigten Pseudopapillen (PP) oder die Vorläufer der Pseudopapillen (PP) direkt in die Pseudodermis (PD) oder im Besonderen in das Pseudodermispräparat injiziert oder eingefügt werden.
  27. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 26 dadurch gekennzeichnet, dass der Winkel des Einführens oder Einfügens der Pseudopapillen (PP) oder ihrer Vorläufer in die Pseudodermis (PD) beim Schritt (c) 30° bis 90° und insbesondere 40° bis 60°, zur Ebene der Pseudodermis (PD), beträgt.
  28. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 27 dadurch gekennzeichnet, dass der Auftrag der rekonstruierten Epidermis (Pseudoepidermis, PE) oder eines beim Schritt (d) optional rekonstruierten Periderms (Pseudoperiderms, PI) vor oder nach Einführung oder Einfügung der Pseudopapillen (PP) oder ihrer Vorläufer beim Schritt (c) stattfindet.
  29. Verfahren nach Anspruch 28 dadurch gekennzeichnet, dass die Pseudoepidermis (PE) oder das Pseudoperiderm (PI) gezüchtete Keratinozyten, insbesondere Haarfollikelkeratinozyten (ORS und/oder Matrixkeratinozyten) und/oder epidermale Keratinozyten und optional sogar Melanozyten, insbesondere Melanozyten der äußeren Haarwurzelhülle (ORS Melanozyten) und/oder epidermale Melanozyten und optional weitere Bestandteile umfasst.
  30. Verfahren nach Anspruch 28 oder 29 dadurch gekennzeichnet, dass die Keratinozyten und Melanozyten einzeln in getrennten Monolagen oder Multilagen oder zusammen in Beimengung als Monolage oder Multilage auf die Pseudodermis (PD) aufgetragen werden.
  31. Ein Haar/Haut-Äquivalent, insbesondere ein Haarmodell mit rekonstruierten Papillen (PP) in einer Pseudodermis (PD), das durch das Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 30 herstellbar ist.
  32. Verwendung des Haut/Haar-Äquivalents nach Anspruch 31 im pharmazeutischen, medizinischen oder kosmetischen und Körperpflegebereich.
  33. Verwendung des Haut/Haar-Äquivalents nach Anspruch 32 bei der Entdeckung, Untersuchung und/oder beim Testen pharmazeutischer oder kosmetischer Wirkstoffe, und speziell deren Verträglichkeit und/oder Wirksamkeit.
  34. Verwendung nach Anspruch 33 bei der Entdeckung, Untersuchung und/oder beim Testen pharmazeutischer oder kosmetischer Wirkstoffe auf ihre Wirksamkeit und/oder Verträglichkeit hin im Hinblick auf den Haarfollikel, insbesondere auf die Haarpigmentierung, das Haarwachstum, die, Haarstruktur oder Haarfarbe.
  35. Verwendung des Haut/Haar-Äquivalents nach Anspruch 31 zur Entwicklung pharmazeutischer oder kosmetischer Wirkstoffe.
  36. Verwendung des Haut/Haar-Äquivalents nach Anspruch 31 bei bevorzugten automatisierten Siebprozessen, insbesondere zur Entdeckung, Untersuchung und/oder beim Testen pharmazeutischer oder kosmetischer Wirkstoffe.
  37. Verwendung des Haut/Haar-Äquivalents nach Anspruch 31 für die in vitro-Bewertung der Beeinflussung des Haarfollikels, der Haarpigmentierung, des Haarwachstums, der Haarstruktur, Haarfarbe und von Ähnlichem, insbesondere durch pharmazeutische oder kosmetische Wirkstoffe.
  38. Ein System, insbesondere ein Testsystem, das das Haar/Haut-Äquivalent nach Anspruch 31 umfasst.
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