DE102018129793B4 - Dreidimensionales Zellkulturmodell der humanen Schweißdrüse zur Analyse von Stress-assoziierten Schwitzprozessen - Google Patents

Dreidimensionales Zellkulturmodell der humanen Schweißdrüse zur Analyse von Stress-assoziierten Schwitzprozessen Download PDF

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Abstract

Verfahren zur in-vitro Untersuchung von Schwitzprozessen, bei dem• ein dreidimensionales Schweißdrüsenäquivalent bereitgestellt wird,• das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent adrenergen stimuliert wird, und• die Reaktion des dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents durch Messung des Gehalts an cyclischem Adenosinmonophosphat (cAMP) bestimmt wird.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur in-vitro Untersuchung von Schwitzprozessen, bei dem ein dreidimensionales Schweißdrüsenäquivalent bereitgestellt wird, das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent adrenergen stimuliert wird, und die Reaktion des dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents bestimmt wird.
  • Das Waschen, Reinigen und Pflegen des eigenen Körpers stellt ein menschliches Grundbedürfnis dar und die moderne Industrie versucht fortlaufend, diesen Bedürfnissen des Menschen in vielfältiger Weise gerecht zu werden. Besonders wichtig für die tägliche Hygiene ist die anhaltende Beseitigung oder zumindest Reduzierung des Körpergeruchs und der Achselnässe.
  • Kunden wünschen sich Antitranspirantien, die effektiv die negative Beeinflussung ihrer Lebensqualität durch emotionales Schwitzen unterbinden. Der Schutz vor Körpergeruch und Achselnässe durch kosmetische Produkte ist ein wichtiger Teil der täglichen Hygiene. Er gibt dem Anwender Sicherheit und Selbstvertrauen - speziell bei Personen, die aufgrund starker Schweißentwicklung unter psychischen Druck stehen.
  • Achselnässe und Körpergeruch entstehen durch die Sekretion aus ekkrinen und apokrinen Schweißdrüsen in der humanen Achselhöhle. Während die ekkrinen Drüsen hauptsächlich der Thermoregulation des Körpers dienen und für die Entstehung der Achselnässe verantwortlich sind, scheiden die apokrinen Drüsen ein viskoses Sekret in Reaktion auf Stress ab, aus welchem durch bakterielle Zersetzung unangenehmer Körpergeruch entsteht.
  • Erste Forschungsarbeiten an nativen ekkrinen und apokrinen Schweißdrüsen wurden bereits Anfang des 20. Jahrhunderts durchgeführt, um diese zur Gruppe der exokrinen Drüsen gehörenden Hautanhangsgebilde zu klassifizieren. Schweißdrüsen lassen sich hiernach in apokrine und ekkrine Schweißdrüsen sowie eine Mischform aus apokrinen und ekkrinen Schweißdrüsen (auch als apoekkrine Schweißdrüsen bezeichnet) einteilen. Die zuvor genannten Formen können anhand morphologischer und charakteristischer Merkmale unterschieden werden.
  • Die ekkrine Schweißdrüsen, insbesondere die humane ekkrine Schweißdrüsen, gehört zu den unverzweigten gewunden tubularen Drüsen und lässt sich in das sekretorische Endstück (auch als Coil bezeichnet), den dermalen Ausführgang (auch als Dukt bezeichnet) sowie den epidermalen Ausführgang (auch als Acrosyringium bezeichnet) unterteilen. Die in diesen Drüsenabschnitten vorhanden Zellen weisen unterschiedliche Aufgaben und Funktionen auf, wie beispielsweise die Sekretion im Coil, Rückresorption von Ionen im Dukt sowie Abgabe des Sekrets, insbesondere des Schweißes, an die umliegende Haut durch das Acrosyringium. Die ekkrinen Schweißdrüsen werden durch den Neurotransmitter Acetylcholin (ACh) stimuliert.
  • Im Hinblick auf die Vermeidung von Achselnässe und/oder Körpergeruch ist es wünschenswert, die Sekretion aus ekkrinen und/oder apokrinen Schweißdrüsen zu vermindern oder zu vermeiden. Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass die Ausführungsgänge der ekkrinen Schweißdrüsen mittels sogenannter Plugs verstopft werden. Hierzu werden im Stand der Technik schweißhemmende Aluminium- und/oder Aluminium-Zirkoniumsalze eingesetzt, welche jedoch vom Verbraucher als kritisch empfunden werden.
  • Weiterhin werden im Stand der Technik antibakterielle Mittel eingesetzt, welche den bakteriellen Abbau des Schweißes verhindern. Derartige Mittel können jedoch die natürliche Mikroflora der Haut unter der Achselhöhle negativ beeinflussen. Es ist daher wünschenswert, kosmetische Mittel bereitzustellen, welche in der Lage sind, die Achselnässe und/oder den Körpergeruch zuverlässig zu verhindern und welche weder die im Stand der Technik eingesetzten Aluminium- und/oder Aluminium-Zirkoniumsalze noch antibakteriellen Mittel enthalten. Einzelne, unbestätigte Studien bringen diese Aluminiumverbindungen in einen Zusammenhang mit Erkrankungen. Der verunsicherte Verbraucher wünscht „aluminiumfreie“ Produkte. Obwohl es dafür bisher keine Beweise gibt und das Bundesamt für Risikobewertung (BfR) bei ordnungsgemäßem Gebrauch kein Risiko für den Anwender sieht, ist die Aufmerksamkeit der Medien und der Verbraucher groß.
  • Eine Möglichkeit zur Bereitstellung derartiger Mittel besteht in dem Einsatz von Substanzen, welche die Stimulierung der Schweißdrüsen effektiv hemmen und somit die Schweißsekretion vermindern bzw. vermeiden. Um derartige Substanzen identifizieren zu können, können in-vivo Tests mit Versuchsteilnehmern durchgeführt werden. Solche Tests sind jedoch aufwändig und erlauben keine Screeningverfahren mit hohen Durchsatzraten. Zum anderen können in-vitro Tests unter Einsatz von Zellmodellen von Schweißdrüsen eingesetzt werden, an welchen der Einfluss von Testsubstanzen auf die Stimulation der Schweißdrüsen untersucht werden kann.
  • Damit die in-vitro erhaltenen Testergebnisse gut auf die in-vivo Situation übertragbar sind, muss das eingesetzte Zellmodell der Schweißdrüsen die in-vivo-Situation möglichst genau nachbilden. Hierzu sind dreidimensionale Zellmodelle erforderlich, da die im Stand der Technik bekannten zweidimensionalen Modelle keine ausreichende physiologische Nähe zur nativen Schweißdrüsen aufweisen und damit die in-vivo-Situation nur unzureichend wiedergeben. Darüber hinaus ist eine Aufklärung des Schweißsekretionsmechanismus erforderlich. Denn nur auf diese Weise können sogenannte biologische Targets, insbesondere durch die Schweißdrüsenzellen produzierte Proteine, identifiziert werden, deren Beeinflussung durch Testsubstanzen zu einer verminderten Schweißprodukten führt. Mögliche biologische Targets, welche im Zusammenhang mit der Schweißproduktion stehen könnten, sind lonenkanäle und/oder Wasserkanäle und/oder Rezeptoren der Signaltransduktion, welche die Schweißsekretion steuern.
  • Weiterhin können Zellmodelle von Schweißdrüsen eingesetzt werden, an welchen der Einfluss von Testsubstanzen auf die Stimulation der Schweißdrüsen untersucht werden kann. Derartige Modelle müssen die in-vivo Situation möglichst genau nachbilden, standardisierbar und kostengünstig sein sowie Screeningverfahren mit hohen Durchsatzraten ermöglichen. Ein im Stand der Technik bekanntes dreidimensionales Schweißdrüsenmodell ist beispielsweise durch Li (Li et. al., „Matrigel basement membrane matrix induces eccrine sweat gland cells to reconstitute sweat gland-like structures in nude mice"; Experimental Cell Research, 2015, 332, Seiten 67 bis 77) beschrieben. Zur Herstellung dieses Schweißdrüsenmodells werden zunächst primären Schweißdrüsenzellen mit Wachstumsfaktoren in einer gelartigen Substanz (Matrigel®) kultiviert und anschließend in den Rücken von lebenden Mäusen implantiert. Nach Implantierung bilden sich Sphäroid-Strukturen aus, welche Schweißdrüsen spezifische Markerproteine exprimieren. Da zur Ausbildung der differenzierten Strukturen der Einsatz von Mäusen erforderlich ist, kann dieses Modell nicht in der kosmetischen und pharmazeutischen Forschung, wo der Einsatz von Versuchstieren verboten ist, verwendet werden.
  • Schließlich ist auch der Einsatz von Vollhautmodellen, welche neben einer Dermis und einer Epidermis auch Schweißdrüsen enthalten, bekannt. Durch Ausstanzen von Proben aus nativer adulter Humanhaut werden Modelle erhalten, welche alle in diesem Hautbereich befindlichen Hautanhangsgebilde, worunter auch Schweißdrüsen fallen, enthalten. Derartige Modelle werden auch als ex-vivo Vollhautmodelle bezeichnet.
  • Es besteht daher weiterhin ein Bedarf an in-vitro Verfahren, mit deren Hilfe biologische Targets, welche für eine erhöhte Schweißreduktion verantwortlich sind, identifiziert und analysiert werden können. Nach der Identifikation und Analyse derartiger Targets erfolgt bevorzugt die Untersuchung des Einflusses verschiedener Testsubstanzen auf diese Targets. Derartige in-vitro Verfahren sollen standardisierbar, kostengünstig und schnell durchführbar sein, so dass die Ermittlung des Einflusses von Testsubstanzen auf die biologischen Targets in Screeningverfahren mit hohen Durchsatzraten ermöglicht wird.
  • Der vorliegenden Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, ein in-vitro Verfahren zur Analyse von Schwitzprozessen bereitzustellen, welches standardisierbar, kostengünstig sowie schnell durchführbar ist und dessen Ergebnisse sich auf die in-vivo Situation übertragen lassen. Mit dem Verfahren sollen insbesondere Stoffe identifizierbar sein, die potentiell wirksame Antitranspirantien darstellen.
  • Gelöst wird die Aufgabe durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur in-vitro Untersuchung von Schwitzprozessen, bei dem ein dreidimensionales Schweißdrüsenäquivalent bereitgestellt wird, das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent adrenergen stimuliert wird, und die Reaktion des dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents durch Messung des Gehalts an cyclischem Adenosinmonophosphat (cAMP) bestimmt wird.
  • Es ist gefunden worden, dass eine invitro-Untersuchung von Schwitzprozessen erfolgen kann, indem die Reaktion eines dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents durch Messung des Gehaltes an cyclischem Adenosinmonophosphat erfasst wird.
  • Der erste Schritt des Verfahrens betrifft die Bereitstellung eines dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents. Unter einem dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalent wird erfindungsgemäß ein Zellmodell aus Schweißdrüsenzellen verstanden, welches eine Ausdehnung in alle drei Raumrichtungen aufweist und in welchem die Zellen eine ähnliche Funktion, insbesondere eine identische Funktion, wie Zellen einer nativen Schweißdrüse zeigen.
  • Die Herstellung von dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten ist im Stand der Technik bekannt. Durch Einbringung von dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten in ein Dermis- und/oder Epidermisäquivalent eines Hautäquivalents können Modelle erhalten werden, in welchen die Zell-Zell-Interaktionen zwischen den verschiedenen Zelltypen denen in der nativen Haut nahezu entsprechen. Die Herstellung erfolgt ausschließlich durch in-vitro Methoden und erlaubt eine hohe Standardisierbarkeit sowie eine kostengünstige Herstellung der Hautäquivalente. Daher eignen sich diese Hautäquivalente insbesondere zum Einsatz in Screeningverfahren mit hohen Durchsätzen zur Testung von schweißhemmenden Substanzen zum Einsatz in der Kosmetik und der Pharmazie.
  • Das bereitgestellte dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent wird in einem anschließenden Verfahrensschritt adrenergen stimuliert. Die Stimulierung soll den menschlichen Stressfaktor simulieren. Im Prinzip kommen alle Stimulantien in Betracht, die adrenerge Rezeptoren stimulieren. Nun kann das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent einem Wirkstoff ausgesetzt werden.
  • Wird das stimulierte dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent einem Wirkstoff ausgesetzt, so kann es zu einer Reaktion des dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents kommen. Ein Verfahrensschritt in dem erfindungsgemäßen Verfahren kann das Inkontaktbringen des dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents mit einem zu untersuchenden Wirkstoff umfassen. In Abhängigkeit von der Art des zu untersuchenden Wirkstoffs kommt es zu einer erwünschten Hemmung innerhalb es adrenergen Signalweges. Das Ausmaß der Hemmung des adrenergen Signalweges ermöglicht Rückschlüsse auf das Potential, in wie weit der zu untersuchende Wirkstoff als Antitranspirants wirkt. Das Ausmaß der Hemmung des adrenergen Signalweges wird erfindungsgemäß bestimmt durch Messung des Gehaltes an cyclischem Adenosinmonophosphat (cAMP). Cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP) ist ein biochemisch vom Adenosintriphosphat (ATP) abgeleitetes Molekül, welches als ein sogenannter „Second Messenger“ bei der zellulären Übertragung von Nervenimpulsen dient. Der Gehalt an cAMP dient letzten Endes als quantitatives Maß für die Antitranspirantswirkung eines potentiellen Wirkstoffs. Im letzten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird also die Reaktion des dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents, die ein Wirkstoff darauf ausübt, bestimmt, und zwar durch Messung des Gehaltes an cAMP. Je aktiver die Zellen im Zellverband sind, desto höher der cAMP Wert. Durch den zu untersuchenden Wirkstoff soll der cAMP Gehalt trotz adrenerger Stimulation niedriger sein.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent 500 bis 500000 Schweißdrüsenzellen. Bevorzugt weist das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent einen Durchmesser von 100 µm bis 6000 µm, bevorzugt von 150 µm bis 4000 µm, bevorzugter von 200 µm bis 3000 µm, auf. Der Durchmesser der kugelförmigen erfindungsgemäßen Schweißdrüsenäquivalente kann beispielsweise mittels mikroskopischer Vermessung unter Verwendung der Software „CellSens“ durchgeführt werden.
  • Dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalente mit den obigen Eigenschaften können durch ein im Folgenden beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent hergestellt durch ein Verfahren, das die folgenden Schritte umfasst:
    1. a) Bereitstellung von isolierten Schweißdrüsen,
    2. b) Bereitstellung einer Zellpräparation von primären Schweißdrüsenzellen aus den in Verfahrensschritt a) isolierten Schweißdrüsen,
    3. c) Auftragen der in Verfahrensschritt b) bereitgestellten Zellpräparation auf ein Substrat,
    4. d) Kultivierung der in Verfahrensschritt c) aufgetragenen Zellpräparation,
    5. e) Isolierung des in Verfahrensschritt d) erhaltenen dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents.
  • Unter den in Verfahrensschritt a) eingesetzten isolierten Schweißdrüsen werden nicht kultivierte Schweißdrüsen verstanden, welche aus Hautbiopsien oder dergleichen erhalten werden können und welche aus ihrer natürlichen Umgebung entfernt wurden. Diese isolierten Schweißdrüsen werden anschließend präpariert, kultiviert und isoliert, um eine Zellkultur zu erhalten.
  • Unter der in Verfahrensschritt b) eingesetzten Zellpräparation von primären Schweißdrüsenzellen ist eine Suspension von Schweißdrüsenzellen der kultivierten isolierten Schweißdrüse in einer Lösung, insbesondere in einem Nährmedium, zu verstehen. In diesem Zusammenhang ist es bevorzugt, wenn die Isolierung der nativen Schweißdrüsen durch enzymatischen Verdau der menschlichen Haut unter Verwendung einer Mischung aus 2 bis 3 mg/ml Collagenase II und 0,1 bis 0,2 mg/ml Thermolysin für 3 bis 6 Stunden bei 35 bis 40 °C, insbesondere bei 37°C, erfolgt. Die hierfür verwendete menschliche Haut ist bevorzugt eine Hautbiopsie, welche beispielsweise in der Schönheitschirurgie als Abfallprodukt anfällt. Weiterhin kann bevorzugt eine Präparierung in hängendem Zustand vorgesehen sein, wobei darunter eine Präparierung zu verstehen ist, bei welcher sich die Zellpräparation aus Verfahrensschritt b) nicht auf der Oberfläche einer Kulturplatte oder Flasche befindet, sondern in Form eines Tropfens von einer Oberfläche frei schwebend herabhängt bzw. zwischen zwei Flächen frei schwebend herabhängt.
  • In Verfahrensschritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Zellpräparation von primären Schweißdrüsenzellen aus den isolierten, bevorzugt nativen, Schweißdrüsen bereitgestellt. Diese Zellpräparation kann beispielsweise nach Präparierung der isolierten, bevorzugt nativen, Schweißdrüsen, Ablösung der aus den Schweißdrüsen auswachsenden Monolayer-Kulturen und Präparierung dieser abgelösten primären Schweißdrüsenzellen durch Suspendierung in einem geeigneten Medium unter Einstellung der erforderlichen Zellzahl erfolgen. Erfindungsgemäß bevorzugte Ausführungsformen sind daher dadurch gekennzeichnet, dass die Zellpräparation von primären Schweißdrüsenzellen in Verfahrensschritt b) durch Präparierung der in Verfahrensschritt a) isolierten Schweißdrüsen, Ablösung von Schweißdrüsenzellen, insbesondere durch schonende Trypsinierung, Kultivierung dieser abgelösten Schweißdrüsenzellen in Monolayer-Kulturen, Suspendierung der kultivierten primären Schweißdrüsenzellen in einem Nährmedium sowie Einstellung der Zellzahl hergestellt wird.
  • Nach einer Bereitstellung der Zellpräparation von primären Schweißdrüsenzellen wird gemäß der bevorzugten Ausführungsform die Zellpräparation auf ein Substrat aufgetragen. Mit anderen Worten, in Verfahrensschritt c) wird die in Verfahrensschritt b) bereitgestellte Zellpräparation von primären Schweißdrüsenzellen auf eine Oberfläche aufgetragen, bevorzugt auf eine Polymeroberfläche aufgetragen. Um eine ausreichende Standardisierbarkeit zu erreichen, muss vor Kultivierung der Zellpräparation von primären Schweißdrüsenzellen auf der Polymeroberfläche eine bestimmte Zellzahl eingestellt werden. Um die Ausbildung von unterschiedlichen Charakteristika sowie die Differenzierung der primären Schweißdrüsenzellen in unterschiedliche Funktionalitäten in dem dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalent zu ermöglichen, enthält die in Verfahrensschritt c) auf die Oberfläche, bevorzugt die Polymeroberfläche aufgetragene Zellpräparation bestimmte Zellzahlen an primären Schweißdrüsenzellen. Die Verwendung von genau definierten Zellzahlen erlaubt weiterhin eine Standardisierung der Schweißdrüsenäquivalente, da alle Äquivalente ähnliche, insbesondere identische, Zellzahlen aufweisen und somit voneinander abweichende Ergebnisse bzw. eine aufwändige Standardisierung vermeidbar sind. Bevorzugte Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstands sind daher dadurch gekennzeichnet, dass in Verfahrensschritt c) die Zellzahl der primären Schweißdrüsenzellen in der Zellpräparation 5.000 bis 230.000 Zellen pro Quadratzentimeter Polymeroberfläche, vorzugsweise 5.000 bis 200.000 Zellen pro Quadratzentimeter Polymeroberfläche, bevorzugt 5.000 bis 170.000 pro Quadratzentimeter Polymeroberfläche, weiter bevorzugt 5.000 bis 140.000 Zellen pro Quadratzentimeter Polymeroberfläche, insbesondere 5.000 bis 132.000 Zellen pro Quadratzentimeter Polymeroberfläche, beträgt.
  • Die Zellzahl der primären Schweißdrüsenzellen kann beispielsweise unter Verwendung einer klassischen Zählkammer sowie Trypanblau bestimmt werden. Hierzu wird die Suspension von kultivierten primären Schweißdrüsenzellen unverdünnt mit einer Trypanblau-Lösung versetzt und die Anzahl der Zellen in den entsprechenden Eckquadraten bestimmt. Aus diesen Werten wird das arithmetische Mittel gebildet. Unter Berücksichtigung des Volumens der Zählkammer, dem Verdünnungsfaktor und dem Kammerfaktor wird aus diesem Mittelwert die Zellzahl pro ml bzw. µl I bestimmt. Die in Verfahrensschritt c) verwendete Zellzahl bezieht sich hierbei auf die Zahl der lebenden Zellen (Lebendzahl). Durch Verwendung eines entsprechenden Volumens kann dann die beanspruchte Zellzahl auf die Polymeroberfläche aufgetragen werden.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, wenn die in Verfahrensschritt c) eingesetzte Zellpräparation von primären Schweißdrüsenzellen ein bestimmtes Volumen aufweist. Dies erleichtert ein Kultivieren dieser Zellpräparation auf dem Substrat. Es ist daher erfindungsgemäß bevorzugt, wenn in Verfahrensschritt c) die auf die Zelloberfläche aufzutragende Zellpräparation von primären Schweißdrüsenzellen ein Volumen von 400 bis 4.000 µL, vorzugsweise von 450 bis 3.000 µL, bevorzugt von 480 bis 2.500 µL, insbesondere von 490 bis 2.100 µL, aufweist. Die Auftragung der zuvor genannten Volumina auf das Substrat, insbesondere die Polymeroberfläche, stellt ein ausreichendes Wachstum der in dieser Zellpräparation befindlichen primären Schweißdrüsenzellen sicher.
  • In Verfahrensschritt d) des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Kultivierung der Zellpräparation der primären Schweißdrüsenzellen auf dem Substrat, insbesondere der speziellen Polymeroberfläche.
  • Die Polymeroberfläche verhindert die Adhäsion der Zellen auf dieser Oberfläche und unterstützt daher die Bildung des dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist daher dadurch gekennzeichnet, dass die Polymeroberfläche aus mindestens einem Polymer ausgewählt aus der Gruppe von Polyvinylalkoholen, Polyethylenglycolen, Poly(2-hydroxyethyl)methacrylaten, Dextranen, Carboxymethylcellullosen, Agarosen, Stärken, Cellulosen, Polyacrylamiden, Estern von Alginsäuren und/oder Hyaluronsäuren und/oder Polyacrylaten und/oder Pektinen sowie deren Mischungen, gebildet ist. Derartige Polymeroberflächen sind beispielsweise kommerziell von der Firma Corning Incorporated als Ultra Low Attachment Zellkulturprodukte mit kovalent gebundenen Hydrogel-Oberflächen erhältlich.
  • Es hat sich als vorteilhaft herausgestellt, wenn die Zellpräparation mit den primären Schweißdrüsenzellen in Verfahrensschritt d) für einen bestimmten Zeitraum unter bestimmten Bedingungen auf dem Substrat, insbesondere der Polymeroberfläche kultiviert wird. Es ist daher bevorzugt, wenn die Kultivierung der Zellpräparation in Verfahrensschritt d) für einen Zeitraum von 1 bis 25 Tagen, insbesondere von 2 bis 7 Tagen, bei einer Temperatur von 36 bis 38 °C und einem CO2-Gehalt von 5 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der zur Kultivierung eingesetzten Atmosphäre, erfolgt.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann es weiterhin vorgesehen sein, dass während der Kultivierung der primären Schweißdrüsenzellen in Verfahrensschritt d) das zur Auftragung der Zellpräparation verwendete Nährmedium durch frisches Nährmedium ersetzt wird. Unter frischem Nährmedium ist hierbei ein Nährmedium zu verstehen, welches keinerlei Zellen enthält. Der Volumenanteil bezieht sich hierbei auf das Gesamtvolumen der in Verfahrensschritt b) hergestellten Zellpräparation. Es ist daher erfindungsgemäß vorteilhaft, wenn während der Kultivierungsdauer in Verfahrensschritt d), insbesondere nach 1 bis 3 Tagen, das Nährmedium der Zellpräparation durch frisches Nährmedium ersetzt wird.
  • In diesem Zusammenhang ist es bevorzugt, wenn als frisches Nährmedium für den Volumenaustausch ein bestimmtes Nährmedium verwendet wird. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es daher vorteilhaft, wenn eine Mischung aus DMEM und Ham's F12 im Gewichtsverhältnis 3:1, welche zusätzlich 10 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Mischung, fetales Kälber Serum (FCS), enthält, als frisches Nährmedium verwendet wird.
  • In Verfahrensschritt e) des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Isolierung des gebildeten, dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents durch Entnahme des Nährmediums. Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind daher dadurch gekennzeichnet, dass die Isolierung des dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents in Verfahrensschritt e) durch Entnahme des Nährmediums erfolgt.
  • Besonders bevorzugt handelt es sich bei dem dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalent um ein Äquivalent der ekkrinen und/oder apokrinen humanen Schweißdrüse. Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind daher dadurch gekennzeichnet, dass das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent ein dreidimensionales Schweißdrüsenäquivalent der ekkrinen und/oder apokrinen humanen Schweißdrüse ist. Insbesondere sind die in Schritt a) des Herstellungsverfahrens ekkrine Schweißdrüsen.
  • Die gemäß dem bevorzugten Herstellungsverfahren erhaltene Schweißdrüsenäquivalente sind besonders gut zur Identifizierung von schweißhemmenden Wirkstoffen für die in vivo Anwendung beim Menschen geeignet.
  • Die erfindungsgemäßen dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente weisen eine höhere Standardisierbarkeit und Verfügbarkeit auf wie isolierte Schweißdrüsen und besitzen eine größere Nähe zur in-vivo Situation als eindimensionale und zweidimensionale Schweißdrüsenmodelle. Weiterhin stellen diese Äquivalente eine kostengünstige Alternative zu in-vivo Studien am Menschen dar, da mittels dieser Äquivalente die schweißhemmende Wirkung von Testsubstanzen untersucht werden kann, beispielsweise durch Vergleich der Genexpression bzw. Proteinexpression bei einer Stimulierung mit Acetylcholin (ACh) in An- und Abwesenheit einer bestimmten Testsubstanz. Die erfindungsgemäßen dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente simulieren die Schweißdrüse in-vivo sowohl in ihrer Struktur als auch in ihrer histologischen Zusammensetzung, so dass die mit diesen Äquivalenten erhaltenen Informationen gut auf den Menschen übertragbar sind und sich auch mit Daten für bereits in-vivo getestete Verbindungen vergleichen lassen.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegt das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent in einem wässrigen Medium vor oder liegt in Wasser dispergiert vor. Mit diesem Merkmal ist der Vorteil verbunden, dass wasserlösliche zu untersuchende Wirkstoffe, die als Antitranspirantien dienen können, auf ihr Potential antitranspirant zu wirken, untersucht werden können.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, wenn die erfindungsgemäßen fertig hergestellten Schweißdrüsenäquivalente frei sind von Matrixverbindungen und/oder Trägern. Unter Matrixverbindungen sind hierbei Verbindungen zu verstehen, welche zur Ausbildung räumlicher Netzwerke in der Lage sind. Hierunter fallen jedoch nicht die von den Zellen selbst produzierten und ausgeschiedenen Substanzen, welche zur Ausbildung räumlicher Netzwerke in der Lage sind.
  • Weiterhin werden unter Trägern im Sinne der vorliegenden Erfindung selbsttragende Stoffe verstanden, welche als Unterlage bzw. Gerüst für die Schweißdrüsenzellen dienen können. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent frei von Matrixverbindungen und/oder Trägern, insbesondere frei von Matrixverbindungen und Trägern.
  • Unter dem Begriff „frei von“ wird erfindungsgemäß verstanden, dass die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente weniger als 1 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents, an Matrixverbindungen und/oder Trägern enthalten. Es ist daher im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorteilhaft, wenn das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent 0 bis 1 Gew.-%, vorzugsweise 0 bis 0,5 Gew.-%, bevorzugt 0 bis 0,2 Gew.%, insbesondere 0 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents, an Matrixverbindungen und Trägern enthalt.
  • In diesem Zusammenhang ist es besonders vorteilhaft, wenn die dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalente frei sind von bestimmten Matrixverbindungen und Trägern. Es ist daher bevorzugt, wenn das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent keine Matrixverbindungen und/oder Träger enthält, welche ausgewählt sind aus der Gruppe von Collagenen, insbesondere Collagen Typ I und/oder Typ III und/oder Typ IV, Scleroproteinen, Gelatinen, Chitosanen, Glucosaminen, Glucosaminoglucanen (GAG), Heparinsulfatproteoglucanen, sulfatierten Glycoproteinen, Wachstumsfaktoren, vernetzten Polysacchariden, vernetzten Polypeptiden sowie deren Mischungen.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die in Verfahrensschritt b) bereitgestellten primären Schweißdrüsenzellen mindestens eine Zellart, ausgewählt aus der Gruppe von (i) Coilzellen, insbesondere clear cells, dark cells sowie Myoepitheliumzellen, (ii) Duktzellen sowie (iii) deren Mischungen. Spezielle Zellen des Coils werden für die Bildung des Primärschweißes verantwortlich gemacht. Die ausgewählten Zellen des Coils sind daher vorteilhaft als Basis für die Herstellung von dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalenten, die in einem Verfahren zur Untersuchung von Schwitzprozessen eingesetzt werden sollen. Der Dukt stellt den Ausführgang bei der Schweißzelle dar. Duktzellen haben die Funktion der lonenresorption und haben daher einen Einfluss auf Schwitzprozesse und insbesondere auf die Entstehung von Gerüchen, da die Zellen Einfluss auf den Salzgehalt haben. Ferner wurde an den bevorzugt eingesetzten Zellarten adrenerge Rezeptoren gefunden.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent stimuliert, indem Adrenalin, bevorzugt eine wässrige Lösung umfassend Adrenalin zu dem dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalent zugegeben wird. Die Stimulierung stellt die Simulation des Stresses dar. Durch Kontaktieren von Adrenalin als einem bevorzugten Stimulator soll das Schweißdrüsenäquivalent derart angeregt werden, wie im menschlichen Körper Stress die natürlichen Schweißdrüsen anregt. Dazu wird Adrenalin in einer wässrigen Lösung mit der wässrigen Suspension umfassend das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent in Kontakt gebracht.
  • Die Erfassung der Reaktion des Schweißdrüsenäquivalents wird über den Nachweis von cAMP gemessen, indem dessen Konzentration gemessen wird. Konkret wird gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Konzentration des cAMP über eine Farbstoffreaktion colorimetsich gemessen. Je aktiver die Zellen im Zellverband desto höher der cAPM Wert. Durch Kontaktieren von Wirkstoffen mit dem dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalent soll der cAMP Gehalt trotz adrenerger Stimulation niedriger sein. Je niedriger der Gehalt an cAMP nach dem Kontaktieren, umso besser der zu untersuchende Wirkstoff. Gemäß einem bevorzugten Verfahren wird die Reaktion des dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents bestimmt, die ein Wirkstoff, der für die Reduktion des Schwitzprozesses vorgesehen ist, auf das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent ausübt.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Reaktion des dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents, die der Wirkstoff ausübt, bestimmt, indem der Wirkstoff zu dem dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalent zugegeben wird, und zwar bevorzugt bevor das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent stimuliert wird oder gleichzeitig mit dem Verfahrensschritt, bei dem das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent stimuliert wird, oder nachdem das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent stimuliert wurde. Bei diesen drei Alternativen kann der Mechanismus der Reaktion des dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents besonders gut untersucht werden.
  • Erfindungsgemäß ganz besonders bevorzugte kosmetische Zusammensetzungen umfassen mindestens eine der folgenden Ausführungsformen A) bis E)
    1. A) Verfahren zur in-vitro Untersuchung von Schwitzprozessen, bei dem
      • • ein dreidimensionales Schweißdrüsenäquivalent bereitgestellt wird,
      • • das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent adrenergen stimuliert wird,
      • • das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent mit einem zu untersuchenden Wirkstoff, kontaktiert wird, und
      • • die Reaktion des dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents durch Messung des Gehalts an cyclischem Adenosinmonophosphat (cAMP) bestimmt wird.
    2. B) Verfahren zur in-vitro Untersuchung von Schwitzprozessen, bei dem
      • • ein dreidimensionales Schweißdrüsenäquivalent bereitgestellt wird,
      • • das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent adrenergen stimuliert wird,
      • • das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent mit einem zu untersuchenden Wirkstoff, kontaktiert wird, und
      • • die Reaktion des dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents durch Messung des Gehalts an cyclischem Adenosinmonophosphat (cAMP) bestimmt wird,
      wobei das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent hergestellt wird durch ein Verfahren, das die folgenden Schritte umfasst a) Bereitstellung von isolierten Schweißdrüsen, b) Bereitstellung einer Zellpräparation von primären Schweißdrüsenzellen aus den in Verfahrensschritt a) isolierten Schweißdrüsen,c) Auftragen der in Verfahrensschritt b) bereitgestellten Zellpräparation auf ein Substrat, d) Kultivierung der in Verfahrensschritt c) aufgetragenen Zellpräparation, e) Isolierung des in Verfahrensschritt d) erhaltenen dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents.
    3. C) Verfahren zur in-vitro Untersuchung von Schwitzprozessen, bei dem
      • • ein dreidimensionales Schweißdrüsenäquivalent bereitgestellt wird,
      • • das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent adrenergen stimuliert wird,
      • • das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent mit einem zu untersuchenden Wirkstoff, kontaktiert wird, und
      • • die Reaktion des dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents durch Messung des Gehalts an cyclischem Adenosinmonophosphat (cAMP) bestimmt wird,
      wobei das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent 500 bis 500000 Schweißdrüsenzellen umfasst und/oder einen Durchmesser von 100 µm bis 6000 µm, bevorzugt von 150 µm bis 4000 µm, bevorzugter von 200 µm bis 3000 µm, aufweist.
    4. D) Verfahren zur in-vitro Untersuchung von Schwitzprozessen, bei dem
      • • ein dreidimensionales Schweißdrüsenäquivalent bereitgestellt wird,
      • • das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent adrenergen stimuliert wird,
      • • das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent mit einem zu untersuchenden Wirkstoff, kontaktiert wird, und
      • • die Reaktion des dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents durch colorimetrische Messung des Gehalts an cyclischem Adenosinmonophosphat (cAMP) bestimmt wird,
      wobei das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent 500 bis 500000 Schweißdrüsenzellen umfasst und/oder einen Durchmesser von 100 µm bis 6000 µm, bevorzugt von 150 µm bis 4000 µm, bevorzugter von 200 µm bis 3000 µm, aufweist.
    5. E) Verfahren zur in-vitro Untersuchung von Schwitzprozessen, bei dem
      • • ein dreidimensionales Schweißdrüsenäquivalent bereitgestellt wird,
      • • das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent adrenergen stimuliert wird,
      • • das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent mit einem zu untersuchenden Wirkstoff, kontaktiert wird, und
      • • die Reaktion des dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents durch colorimetrische Messung des Gehalts an cyclischem Adenosinmonophosphat (cAMP) bestimmt wird,
      wobei das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent 500 bis 500000 Schweißdrüsenzellen umfasst und/oder einen Durchmesser von 100 µm bis 6000 µm, bevorzugt von 150 µm bis 4000 µm, bevorzugter von 200 µm bis 3000 µm, aufweist, und wobei die dreidimensionalen Schweißzellenäquivalente aus ekkrinen Schweißdrüsen hergestellt werden.
  • Die Ausführungsformen A bis E lassen sich mit Merkmalen der weiteren bevorzugten Ausführungsformen kombinieren. Mithilfe der 3D-Schweißdrüsenmodelle können in einem Wirkstoff-Screening unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens Wirkstoffe identifiziert werden, die als Antitranspirantien Einsatz finden könnten, um dann die herkömmlichen Aluminium enthaltenden Produkte ersetzen zu können.

Claims (10)

  1. Verfahren zur in-vitro Untersuchung von Schwitzprozessen, bei dem • ein dreidimensionales Schweißdrüsenäquivalent bereitgestellt wird, • das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent adrenergen stimuliert wird, und • die Reaktion des dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents durch Messung des Gehalts an cyclischem Adenosinmonophosphat (cAMP) bestimmt wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent 500 bis 500000 Schweißdrüsenzellen umfasst und/oder einen Durchmesser von 100 µm bis 6000 µm, bevorzugt von 150 µm bis 4000 µm, bevorzugter von 200 µm bis 3000 µm, aufweist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent in einem wässrigen Medium oder in Wasser dispergiert vorliegt.
  4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent hergestellt wird durch ein Verfahren, das die folgenden Schritte umfasst a) Bereitstellung von isolierten Schweißdrüsen, b) Bereitstellung einer Zellpräparation von primären Schweißdrüsenzellen aus den in Verfahrensschritt a) isolierten Schweißdrüsen, c) Auftragen der in Verfahrensschritt b) bereitgestellten Zellpräparation auf ein Substrat, d) Kultivierung der in Verfahrensschritt c) aufgetragenen Zellpräparation, e) Isolierung des in Verfahrensschritt d) erhaltenen dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die in Verfahrensschritt a) bereitgestellten Schweißdrüsen ekkrine und/oder apokrine humane Schweißdrüsen, insbesondere ekkrine Schweißdrüsen sind.
  6. Verfahren nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die in Verfahrensschritt b) bereitgestellten primären Schweißdrüsenzellen mindestens eine Zellart, ausgewählt aus der Gruppe von (i) Coilzellen, insbesondere clear cells, dark cells sowie Myoepitheliumzellen, (ii) Duktzellen sowie (iii) deren Mischungen umfasst.
  7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent stimuliert wird, indem Adrenalin, bevorzugt eine wässrige Lösung umfassend Adrenalin zu dem dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalent zugegeben wird.
  8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion des dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents durch kolorimetrische Messung des Gehalts an cyclischem Adenosinmonophosphat (cAMP) bestimmt wird.
  9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion des dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents bestimmt wird, die ein Wirkstoff, der für die Reduktion des Schwitzprozesses vorgesehen ist, auf das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent ausübt.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion des dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalents, die der Wirkstoff ausübt, bestimmt wird, indem der Wirkstoff zu dem dreidimensionalen Schweißdrüsenäquivalent zugegeben wird, und zwar bevorzugt bevor das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent stimuliert wird oder gleichzeitig mit dem Verfahrensschritt, bei dem das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent stimuliert wird, oder nachdem das dreidimensionale Schweißdrüsenäquivalent stimuliert wurde.
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