EP1432985A2 - Verfahren zum auffinden neuer wirkstoffe mit androgen-ähnlichen eigenschaften - Google Patents

Verfahren zum auffinden neuer wirkstoffe mit androgen-ähnlichen eigenschaften

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EP1432985A2
EP1432985A2 EP02777182A EP02777182A EP1432985A2 EP 1432985 A2 EP1432985 A2 EP 1432985A2 EP 02777182 A EP02777182 A EP 02777182A EP 02777182 A EP02777182 A EP 02777182A EP 1432985 A2 EP1432985 A2 EP 1432985A2
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EP
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fibroblasts
male
cells
synthesis
cell lines
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Withdrawn
Application number
EP02777182A
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Inventor
Gilles Pauly
Véronique Gillon
Jean-Luc Contet-Audonneau
Louis Danoux
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BASF Health and Care Products France SAS
Original Assignee
Cognis France SAS
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G01N33/743—Steroid hormones
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Definitions

  • the invention is in the field of men's cosmetics and relates to a method by means of which the effectiveness of potential active ingredients can be assessed and the use of male fibroblasts within this method.
  • Human skin is the site of a large number of metabolic reactions in which androgens are involved. Typical examples are the 5- ⁇ -reduction of testosterone (T) to the active metabolite dihydrotestosterone (DHT), the 3- ⁇ -reduction of DHT, the conversion of weak androgens such as dehydroepiandosterone and ⁇ 4-andosterone dione to more biologically active steroids, or the intracellular binding of androgens to specific receptor proteins and the nuclear translocation of androgen receptors.
  • Hair follicles, sebum glands and apocrine glands contain particularly high levels of androgen. These can stimulate hair growth in certain areas of the skin, for example in the armpits, but they can also promote baldness in genetically predisposed men.
  • Androgens can also influence the size and secretion of glands and thus cause disorders in the skin, such as acne or seborrhea.
  • the localization of androgen receptors in the genital fibroblasts of human skin is described, for example, by Liang et al. in J.Invest.Dermatol. 100, 663-666 (1993).
  • the effect of androgens on the growth of genital fibroblasts is usually determined by flow cytometry. From studies by Loire et al. [Biol. of the cell 56, 8989-1992 (1986)] and Sultan et al. [Brit.J.Dermatol.
  • the object of the invention was therefore to develop a method for finding new active substances with an androgen-like effect for the production of cosmetic preparations especially for use in the field of men's cosmetics.
  • the invention relates to a method for finding new active substances with androgen-like properties for the production of cosmetic preparations for men, in which the potential active substances are brought into contact with cultures of male fibroblasts and in the course of the interaction the metabolism, in particular the amount of the dermal macromolecules formed in the fibroblasts compared to a standard.
  • cultures of male fibroblasts are ideal systems for examining the effectiveness of potential new active ingredients with androgenic or androgen-like activity for the development of men's cosmetics.
  • the method takes advantage of the knowledge that active substances in interaction with the fibroblasts stimulate the synthesis of dermal macromolecules, such as hyaluronic acid, chondroitin sulfate, dermatan sulfate, keratin sulfate, heparan sulfate, collagen or elastin, while inactive compounds compared to the blank value cause no or no significant change in the synthesis rate.
  • dermal macromolecules such as hyaluronic acid, chondroitin sulfate, dermatan sulfate, keratin sulfate, heparan sulfate, collagen or elastin
  • Grifola frondosa - also called Maitake - is an edible, higher fungus of the Basidomycetes genus. These are so-called stand mushrooms, which are also called basidia mushrooms.
  • the invention further relates to the use of extracts or fractions of extract of the fungus Grifola frondosa for the stimulation of male fibroblasts, in particular for the stimulation and improvement of cell renewal, and the use for the production of skin care products for men.
  • the stimulation of male fibroblasts has also been demonstrated for extracts from Pisum sativum and for a preparation containing mannitol, cyclodextrin, yeast extract and disodium succinate.
  • fibroblasts Both embryogenic and male adult fibroblasts can be used and cultured within the meaning of the method.
  • the term fibroblasts should also be understood to mean all cells and cell types which have fibroblast-like properties, in particular have receptors on their surface which are comparable or identical to those of the fibroblasts.
  • the fibroblasts can also be used together with other cells or cell lines, but especially skin cells, such as, for example, melanocytes, Langerhans cells, endothelial cells, keratinocytes, neurons and the like.
  • Testosterone, dihydrotestosterone, dehydroepiandrosterone (DHEA) and their precursors and derivatives can be considered as male sex hormones that can be considered as standards and against which the activity of the potential active ingredient can be tested and assessed.
  • the amount of both the active ingredients and the standards can each be 0.0001 to 0.001% by weight, based on the cultures, and is typically 0.0002% by weight.
  • the selection of the potential active ingredients is not critical in that the system works reliably as long as they stimulate the synthesis of dermal macromolecules.
  • the test substances will preferably be selected from the group of sterols, peptides, proteins, lipids, sugars and polysaccharides, since the highest stimulation activity can be expected from them.
  • the formation of dermal macromolecules from the group of glycosaminoglycans, proteoglycans, glycoproteins and proteins is monitored as parameters.
  • the procedure for carrying out the method can be carried out as follows, for example: Cell suspension of human fibroblasts (embryonic cells or male origin) are mixed with 1 to 2 mg / ml of a collagen suspension. The fibroblasts contained in the collagen gel are then mixed with a nutrient medium (2% by weight of fetal calf serum, FCS) in petri dishes (5 ml / dish) with the addition of 0.0002% by weight of the potential active ingredient or testosterone or dihydrotestosterone cultivated as standard. After an incubation period of 7 days at 27 ° C and 5 vol% carbon dioxide in an atmosphere saturated with water vapor, biopsies are taken and histological sections are made. The amount of macromolecules formed can be determined by two different methods:
  • the synthesis of dermal macromolecules generally represents a quantitative indicator of how age and environmental influences affect the processes in the skin of men. Further objects of the invention therefore relate not only to the use of male fibroblasts, alone or together with other skin cells, in the method described at the outset for the discovery of new active ingredients with androgen-like properties for the production of cosmetic preparations for men, but also their use - again alone or together with other cells or cell lines, but especially skin cells -
  • the in vitro growth test on male fibroblast cultures was carried out to demonstrate possible stimulation of the fibroblasts and the regenerative and growth-promoting properties of Grifola frondosa extracts.
  • a toxicity test enables the optimal concentration to be determined for more specific tests on cell cultures.
  • the growth test allows the determination of the capacity of an active ingredient to improve cell renewal.
  • DMEM standard cell culture medium
  • FCS fetal calf serum
  • Table 3a Determination of the amount of cellular proteins and ATP in in vitro cell cultures of fibroblasts after incubation with fractions of the extract from Grifola frondosa (without FCS)
  • Table 3b Determination of the amount of cellular proteins and ATP in in vitro cell cultures of fibroblasts after incubation with fractions of the extract from Grifola frondosa (with 1% FCS without lipids)
  • the extract fractions show an improvement in ATP and protein rate even with 1% defatted FCS compared to the control.

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Abstract

Vorgeschlagen wird ein Verfahren zum Auffinden neuer Wirkstoffe mit androgen-artigen Eigenschaften für die Herstellung von kosmetischen Zubereitungen für Männer, bei dem man die potentiellen Wirkstoffe mit Kulturen männlicher Fibroblasten in Kontakt bringt und im Verlauf der Wechselwirkung den Metabolismus, insbesondere die Menge der von den Fibroblasten gebildeten dermalen Makromoleküle gegenüber einem Standard bestimmt.

Description

Verfahren zum Auffinden neuer Wirkstoffe mit androgen-ähnlichen Eigenschaften
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung befindet sich auf dem Gebiet der Herrenkosmetik und betrifft ein Verfahren, mit dessen Hilfe sich die Wirksamkeit potentieller Wirkstoffe beurteilen lässt sowie die Verwendung von männlichen Fibroblasten innerhalb dieses Verfahrens.
Stand der Technik
Die menschliche Haut ist Schauplatz einer Vielzahl von Stoffwechselreaktionen, an denen Androgene beteiligt sind. Typische Beispiele hierfür sind die 5-α-Reduktion von Testosteron (T) zum aktiven Metaboliten Dihydrotestosteron (DHT), die 3-α-Reduktion von DHT, die Umwandlung von schwachen Androgenen wie z.B. Dehydroepiandosteron und Δ4- Andosterondion zu biologisch aktiveren Steroiden, oder die intrazelluläre Bindung von Androgenen an spezifische Rezeptorproteine und die nukleare Translokation von Androgenre- zeptoren. In Haarfollikel, Talgdrüsen und apokrinen Drüsen finden sich besonders hohe An- drogenkonzentrationen. Diese können den Haarwuchs an bestimmten Stellen der Haut stimulieren, beispielsweise in den Achselhöhlen, sie können jedoch bei genetisch vordisponierten Männern auch die Glatzenbildung fördern. Androgene können auch die Größe und die Sekretion von Drüsen beeinflussen und auf diese Weise Störungen im Hautbild, wie bei- spielsweise Akne oder Seborrhea hervorrufen. Die Lokalisierung von Androgenrezeptoren in den genitalen Fibroblasten der menschlichen Haut wird beispielsweise von Liang et al. in J.Invest.Dermatol. 100, 663-666 (1993) beschrieben. Die Wirkung von Androgenen auf das Wachstum der genitalen Fibroblasten wird üblicherweise durch Flusscytometrie bestimmt. Aus Untersuchungen von Loire et al. [Biol. of the cell 56, 8989-1992 (1986)] und Sultan et al. [Brit.J.Dermatol. 107, 40-46 (1982)] ist bekannt, dass Dihydrotestosteron die DNA und Proteinverteilung in der Targetzelle nicht verändert. Daraus kann man ableiten, dass Androgene weder die Gesamtproteinsynthese noch die DNA-Produktion induzieren. Die Untersuchung des Einflusses von Testosteron auf die Differenzierung von menschlichen Hautzellen hat gezeigt, dass Testosteron weder das Volumen des Epidermis- gewebes, noch die Zellgrösse oder die Zahl der Keratinfilamente beeinflusst, sondern der Abnahme granulärer Zellen, Keratohyalingranulen und Keratinosomen entgegenwirkt. Dieses gibt einen Hinweis auf seine Rolle in der Zelldifferenzierung. Kligman et al. berichten, dass die topische Anwendung von Testosteronpropionat im Achselbereich älterer Männer die Stärke der Epidermis vergrößert [Adv.Biol.Skin, 6, 177-198 (1965)].
Grundsätzlich gilt, dass die Androgenproduktion des Mannes im Alter nachlässt. Ebenfalls ist bekannt, dass die Zellantwort auf Hormone sich im Laufe der Zeit verändert. So konnte gezeigt werden, dass mit dem Alter die Zahl der Bindungsstellen an Androgenzeptoren in den Fibroblasten abnimmt. Detailliertere Studien gehen davon aus, dass diese Änderungen nicht in direktem Zusammenhang mit dem Testosteronlevel stehen, sondern es sich um einen genetisch bedingten Prozess handelt. Damit stellt sich die Frage, ob sich das aus dem Stand der Technik bekannte Wissen über männliche Hormone nicht einsetzen lässt, um ein Modell zu entwickeln, mit dessen Hilfe man neue potentielle Wirkstoffe gerade für die Entwicklung von Herrenkosmetik auf ihre Wirksamkeit testen kann.
Die Aufgabe der Erfindung hat folglich darin bestanden, ein Verfahren zum Auffinden von neuen Wirkstoffen mit androgen-artiger Wirkung für die Herstellung kosmetischen Zubereitungen speziell für die Anwendung im Bereich der Herrenkosmetik zu entwickeln.
Beschreibung der Erfindung
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Auffinden neuer Wirkstoffe mit androgen- artigen Eigenschaften für die Herstellung von kosmetischen Zubereitungen für Männer, bei dem man die potentiellen Wirkstoffe mit Kulturen männlicher Fibroblasten in Kontakt bringt und im Verlauf der Wechselwirkung den Metabolismus, insbesondere die Menge der von den Fibroblasten gebildeten dermalen Makromoleküle gegenüber einem Standard bestimmt.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass Kulturen männlicher Fibroblasten ideale Systeme darstellen, um die Wirksamkeit von potentiellen neuen Wirkstoffen mit androgener oder androgen-ähnlicher Aktivität für die Entwicklung von Herrenkosmetik zu untersuchen. Das Verfahren macht sich dabei die Erkenntnis zu Nutzen, dass aktive Wirkstoffe in Interaktion mit den Fibroblasten die Synthese von dermalen Makromolekülen, wie beispielsweise Hyalu- ronsäure, Chondroitinsulfat, Dermatansulfat, Keratansulfat, Heparansulfat, Kollagen oder Elastin stimulieren, während nicht aktive Verbindungen gegenüber dem Blindwert keine oder keine nennenswerte Veränderung der Syntheserate bewirken. Als Standards haben sich da- bei männliche Geschlechtshormone bewährt. Durch Messung und Verfolgung des Entstehens der dermalen Makromoleküle und Vergleich gegen den Standard kann also auf die Wirksamkeit der untersuchten Testprodukte zurückgeschlossen werden. So wurde bereits mit Hilfe dieses Verfahrens für einzelne Fraktionen von Grifola frondosa - Extrakten ein Einfluß auf Wachstum und Metabolismus von männlichen Fibroblasten gezeigt (siehe Beispiele). Bei Grifola frondosa -auch Maitake genannt - handelt es sich um essbare höhere Pilze der Gattung Basidomycetes. Dieses sind sogenannte Ständerpilze, die auch als Basidienpilze bezeichnet werden.
Dementsprechend ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung die Verwendung von Extrakten oder Fraktionen von Extraktes des Pilzes Grifola frondosa zur Stimulation männlicher Fibroblasten, insbesondere zur Stimulation und Verbesserung der Zellerneuerung, sowie die Verwendung zur Herstellung von Hautpflegemitteln für Herren.
Ebenso konnte die Stimulation männlicher Fibroblasten bereits nachgewiesen werden für Extrakte aus Pisum sativum und für eine Zubereitung, enthaltend Mannitol, Cyclodextrin, Hefeextrakt und Di-Natrium Succinat.
Durchführung des Verfahrens
Im Sinne des Verfahrens können sowohl embryogene als auch männliche adulte Fibroblasten eingesetzt und kultiviert werden. Unter dem Begriff Fibroblasten sollen auch alle Zellen und Zelltypen verstanden werden, die fibroblastenähnliche Eigenschaften aufweisen, speziell Rezeptoren an ihrer Oberfläche aufweisen, die mit denen der Fibroblasten vergleichbar oder identisch sind. Die Fibroblasten können auch gemeinsam mit anderen Zellen oder Zellinien, speziell aber Hautzellen eingesetzt werden, wie beispielsweise Melanocyten, Langerhans Zellen, Endothelialzellen, Keratinocyten, Neuronen und dergleichen. Als männliche Ge- schlechtshormone, die als Standards in Frage kommen und gegen die die Aktivität der potentiellen Wirkstoff getestet und beiurteilt werden kann, kommen beispielsweise Testosteron, Dihydrotestosteron, Dehydroepiandrosteron (DHEA) sowie deren Vorstufen und Derivate in Frage. Die Einsatzmenge sowohl der Wirkstoffe als auch der Standards kann jeweils 0,0001 bis 0,001 Gew.-% - bezogen auf die Kulturen - betragen und liegt typisch bei 0,0002 Gew.- %. Die Auswahl der potentiellen Wirkstoffe ist insofern unkritisch, als das System zuverlässig arbeitet, solange diese eine Stimulation der Synthese von dermalen Makromolekülen stimulieren. In der Praxis wird man die Testsubstanzen vorzugsweise aus der Gruppe der Sterole, Peptide, Proteine, Lipide, Zucker und Polysaccharide auswählen, da von diesen die höchste Aktivität in der Stimulation erwartet werden kann. Als Parameter wird die Bildung von der- malen Makromolekülen aus der Gruppe der Glycosaminglycane, Proteoglycane, Glycoprotei- ne und Proteine verfolgt.
Zur konkreten Durchführung des Verfahrens kann beispielsweise wie folgt vorgegangen werden: Zellsuspension menschlicher Fibroblasten (embryonale Zellen oder männlicher adulter Herkunft) werden mit 1 bis 2 mg/ml einer Kollagensuspension vermischt. Anschließend werden die im Kollagengel enthaltenen Fibroblasten zusammen mit einem Nährmedium (2 Gew.- % fötales Kalbsserum, FCS) in Petrischalen (5 ml/Schale) unter Zugabe von 0,0002 Gew.-% des potentiellen Wirkstoffs bzw. von Testosteron bzw. Dihydrotestosteron als Standard kultiviert. Nach einer Inkubationszeit von 7 Tagen bei 27 °C und 5 Vol.-% Kohlendioxid in einer mit Wasserdampf gesättigten Atmosphäre werden Biopsien vorgenommen und histologische Schnitte angefertigt. Die Menge an gebildeten Makromolekülen kann nach zwei verschiedenen Verfahren bestimmt werden :
1. Eine allgemeine Bestimmung durch Anfärbung der Glucosaminoglukane (GAG) mit Hilfe von PAS-Alcian Blau (Standardanfärbung) sowie
2. eine spezifische imunohistochemische Charakterisierung einiger Elemente der Matrix durch Behandlung mit Antikörpern, speziell Anti-Chondroitinsulfat, Anti-Keratansulfat, Anti-Heparansulfat, Anti-Dermatansulfat, Anti-Elastin und Anti-Kollagen (Typ III). Die Fibroblasten werden bezüglich der Anfärbung (PAS-alcian) mit Hilfe eines Photonen- mikroskopes und bezüglich der Immunohistologie mittels eines konfokalen Lasermikroskops untersucht. Zur Bestimmung der Menge an gebildeten dermalen Makromolekülen werden Aufnahmen angefertigt und die Zonen rund um die Fibroblasten („Perifibroblastische Zonen") analysiert. Die Auszählung erfolgt über durch Bildanalyse, nämlich durch Bestimmung der perifibroblastischen Zonen und des Graulevels. Beide Parameter sind der Synthese an dermalen Makromolekülen direkt proportional. Die Ergebnisse sind in Relation zu den entsprechenden Ergebnissen ohne Zugabe der Wirkstoffe zu bewerten.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Die Synthese der dermalen Makromolekülen stellt ganz allgemein einen quantitativen Indikator dafür dar, wie Alter und Umwelteinflüsse die Prozesse in der Haut des Mannes beein- trächtigen. Weitere Gegenstände der Erfindung betreffen daher nicht nur die Verwendung von männlichen Fibroblasten, alleine oder gemeinsam mit anderen Hautzellen, in dem eingangs geschilderten Verfahren zur Auffindung von neuen Wirkstoffen mit androgen-artigen Eigenschaften für die Herstellung von kosmetischen Zubereitungen für Männer, sondern auch ihre Verwendung - wiederum alleine oder zusammen mit anderen Zellen oder Zellli- nien, speziell aber Hautzellen -
> zur Untersuchung von pathologischen Einflüssen auf die Stimulation der Zellsynthese;
> zur Untersuchung von Alterungseinflüssen auf die Stimulation der Zellsynthese;
> zur Untersuchung von Stresseinflüssen auf die Stimulation der Zellsynthese sowie > zur Untersuchung des Wirkmechanismus der Stimulation der Synthese von dermalen Makromolekülen durch männliche Geschlechtshormone.
Beispiele
Wie im Kapitel „Durchführung des Verfahrens" beschrieben, wurden verschiedene Fibroblastenkulturen mit und ohne Zugabe von männlichen Geschlechtshormonen kultiviert und die Synthese der dermalen Makromoleküle untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Die Angaben verstehen sich als Zunahme in %-rel bezogen auf den Blindwert, d.h. die Abwesenheit der männlichen Geschlechtshormone. Dargestellt ist der Mittelwert der beiden Messbedingungen.
Tabelle 1
Synthese von dermalen Makromolekülen
T = Testosteron; DHT = Dihydrotestosteron
E = embryonale Fibroblasten: MA = männliche adulte Fibroblasten
Beispiel 2:
Herstellung des Extraktes aus Grifola frondosa (Maitake) mit wässriαem Ethanol
120 g getrocknete Grifola frondosa Pilze wurden in einen Glasreaktor mit 1,2 I 96 Gew.-%- igem wässrigen Ethanol überführt. Der Aufguß wurde unter Rühren über einen Zeitraum von 1 h bei Siedetemperatur extrahiert. Anschließend wurde die Mischung auf 20 °C abgekühlt und die überstehende kolloide Flüssigkeit wurde durch Filtration an Tiefenfilter mit einer mittleren Porosität von 450 nm (von der Firma Seitz, Bordeaux Frankreich) vom Rückstand getrennt. Anschließend wurde zunächst der Alkohol bei 45 °C unter vermindertem Druck entfernt und dann der Rückstand bei 50 °C über 12 Stunden getrocknet. Die Ausbeute an Trockenprodukt betrug 10,86 Gew.-% bezogen auf das Trockengewicht an eingesetzten Pilzen.
Fraktionierunα des Extraktes
6,26 g des Extraktes wurden in einer Chromatographiesäule mit unterschiedlichen Methanolkonzentrationen eluiert. Bevorzugte Säulen zur Adsorption sind Amberlite oder reversed pha- se C 18 Silika Säulen. Moleküle mit der geringsten Affinität zur Säule wurden im ersten Waschwasserschritt gesammelt. Als stufenweise Gradienten wurden: Wasser, Methanol 20 Vol.%, Methanol 40 Vol.%, Methanol 60 Vol.%, Methanol 80 Vol. % und reines Methanol eingesetzt. Das Eluti- onsmittel wurde mit einer Flussrate von 10 ml/min eingesetzt. Der Alkohol der einzelnen gewonnenen Fraktionen wurde abgedampft und die Fraktionen getrennt gefriergetrocknet.
Für den nachfolgenden Test wurden die Fraktionen der Tabelle 2 eingesetzt.
Tabelle 2:
Durch Fraktionierung gewonnene Inhaltsstoffe des Pilzes Grifola frondosa
Einsatz der Fraktionen des Extraktes aus Grifola frondosa im Test an in vitro- Kulturen männlicher Fibroblasten
Der In vitro Wachstumstest an männlichen Fibroblasten-Kulturen wurde ausgeführt , um eine mögliche Stimulation der Fibroblasten und die regenerierenden und Wachtumsfördernden Eigenschaften von Grifola frondosa Extrakten nachzuweisen.
Ein Toxizitätstest ermöglicht die Bestimmung der optimalen Konzentration für spezifischere Tests an Zellkulturen. Der Wachstumstest erlaubt die Bestimmung der Kapazität eines Wirkstoffes, die Zellerneuerung zu verbessern.
Durchführung der Tests:
Männliche humane Fibroblasten wurden im Standardzellkulturmedium (DMEM) mit 10 Gew.% foetalem Kälberserum (FCS) kultiviert. Nach einer Inkubation von einem Tag bei 37°C und einem Kohlendioxidgehalt von 5 % wurde das Wachstumsmedium durch ein Standardmedium ohne FCS oder durch ein Standardmedium mit 1% entfettetem FCS ausgetauscht, dem eine definierte Menge der zu untersuchenden Fraktionen gelöst in 1 Vol.% E- thanol beigefügt war. Nach einer Inkubation von 3 Tagen wurde die Menge zellulärer Proteine und ATP in der Zell- kultur bestimmt.
Ergebnisse:
Tabelle 3a: Bestimmung der Menge an zellulären Proteinen und ATP in in vitro Zellkulturen von Fibroblasten nach Inkubation mit Fraktionen des Extraktes aus Grifola frondosa (ohne FCS)
*: Ergebnisse in % versus Kontrolle (Medium ohne Extraktfraktionen) Tabelle 3b: Bestimmung der Menge an zellulären Proteinen und ATP in in vitro Zellkulturen von Fibroblasten nach Inkubation mit Fraktionen des Extraktes aus Grifola frondosa (mit 1 % FCS ohne Lipide)
ixtraktfraktionen)
Die Ergebnisse zeigen, dass die zwei ausgewählten Fraktionen des Extraktes von Grifola frondosa eine deutliche Aktivität zur Stimulation des Zellwachstums humaner männlicher Fibroblasten aufweisen.
Trotz Zugabe des eingesetzten bereits nährstoffreicheren Zellkulturmedium zeigen die Extraktfraktionen eine Verbesserung an ATP und Proteinrate auch mit 1% entfettentem FCS gegenüber der Kontrolle.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Auffinden neuer Wirkstoffe mit androgen-artigen Eigenschaften für die
-5 Herstellung von kosmetischen Zubereitungen für Männer, bei man die potentiellen
Wirkstoffe mit Kulturen männlicher Fibroblasten in Kontakt bringt und im Verlauf der
Wechselwirkung den Metabolismus, insbesondere die Menge der von den Fibroblasten gebildeten dermalen Makromoleküle gegenüber einem Standard bestimmt.
0 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man menschliche dermale Fibroblasten einsetzt.
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die Fibroblasten zusammen mit anderen Zellen oder Zelllinien einsetzt. 5
4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die Menge der gebildeten Makromoleküle gegenüber der Aktivität von männlichen Geschlechtshormonen als Standards bestimmt.
0 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man männliche Geschlechtshormone als Standards einsetzt, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die gebildet wird von Testosteron, Dihydrotestosteron, Dehydroepiandrosteron (DHEA) sowie deren Vorstufen und Derivaten.
5 6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man die Synthese von dermalen Makromolekülen verfolgt, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die gebildet wird von Glycosaminglycanen, Proteoglycanen, Glycopro- teinen und Proteinen.
0 7. Verwendung von männlichen Fibroblasten, alleine oder gemeinsam mit anderen Zellen oder Zelllinien, in einem Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6 zur Auffindung von neuen Wirkstoffen mit androgen-artigen Eigenschaften für die Herstellung von kosmetischen Zubereitungen für Männer.
5 8. Verwendung von männlichen Fibroblasten, alleine oder gemeinsam mit anderen Zellen oder Zelllinien, in einem Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6 zur Untersuchung von pathologischen Einflüssen auf die Stimulation der Zellsynthese.
9. Verwendung von männlichen Fibroblasten, alleine oder gemeinsam mit anderen Zellen oder Zelllinien, in einem Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6 zur Untersuchung von Alterungseinflüssen auf die Stimulation der Zellsynthese.
10. Verwendung von männlichen Fibroblasten, alleine oder gemeinsam mit anderen Zellen oder Zelllinien, in einem Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6 zur Untersuchung von Stresseinflüssen auf die Stimulation der Zellsynthese.
11. Verwendung von männlichen Fibroblasten, alleine oder gemeinsam mit anderen Zellen oder Zelllinien, in einem Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6 zur Untersuchung des
Wirkmechanismus der Stimulation der Synthese von dermalen Makromolekülen durch männliche Geschlechtshormone.
12. Verwendung von Extrakten oder Fraktionen der Extrakte aus dem Pilz Grifola frondosa zur Stimulation männlicher Fibroblasten.
13. Verwendung von Extrakten oder Fraktionen der Extrakte aus dem Pilz Grifola frondosa zur Herstellung von Hautpflegemitteln für Herren.
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