DE69011638T2

DE69011638T2 - Verfahren zur Bestimmung der Wirkung einer Substanz auf den Haarwuchs.

Info

Publication number: DE69011638T2
Application number: DE69011638T
Authority: DE
Inventors: Michael Philpott
Original assignee: Unilever NV
Current assignee: Unilever NV
Priority date: 1989-12-19
Filing date: 1990-12-14
Publication date: 1994-11-24
Anticipated expiration: 2010-12-15
Also published as: GB2242978B; ES2058823T3; GB8928634D0; EP0434319B1; US5229271A; GB9027127D0; CA2032177C; DE69011638D1; GB2242978A; CA2032177A1; EP0434319A1; DK0434319T3; ATE110171T1

Description

Die Erfindung betrifft ein Testverfahren für Substanzen oder Gemische, die diese enthalten, auf ihre Fähigkeit, das Haarwachstum zu fördern, zu erhalten, zu steigern oder zu hemmen.

HINTERGRUND

Der Haarfollikel und der Haarwachstumszyklus

Der Haarfollikel ist aus einer Epithilialkomponente, der Keimschicht und äußeren Wurzelscheide, die den Haarschaft umschließt und einer Dermalkomponente, der Hautpapille innerhalb der Haarzwiebel, aufgebaut. Das Haarwachstum ist durch die Teilung der Haarfollikelbasalzellen beeinflußt und beim Säugetier ist diese zyklisch. Drei verschiedene Stadien des Haarwachstums können bestimmt werden, nämlich:
i. ein aktives Stadium, bekannt als Anagen, während welchem der Haarfollikel durch schnelles Teilen und Differenzieren der Zellen der Zwiebel tief in die Dermis eindringt, um das Haar zu bilden,
ii. ein regressives Stadium, bekannt als Katagen, welches durch das Aufhören der Mitose angekündigt wird und während welchem der Follikel sich nach oben durch die Dermis zurückbildet und das Haarwachstum aufhört, und
iii. ein Ruhestadium, bekannt als Telogen, in welchem der zurückgebildete Follikel einen kleinen sekundären Keim mit einer unterliegenden Kugel von dicht gepackten Hautpapillen- Zellen enthält.
Die Einleitung eines neuen anagenen Stadiums wird durch schnelle Proliferation im Keim, Expansion der Dermalpapille und Produktion von basalen Membrankomponenten angezeigt. Der Haarzyklus wird dann viele Male wiederholt, bis, als eine Konsequenz aus dem Einsetzen der männlichen Kahlheit, die meisten Haarfollikeln einen erhöhten Anteil ihrer Zeit im telogenen Zustand verbringen und die produzierten Haare dünner, kürzer und weniger sichtbar werden; dies ist bekannt als Endstadium zur Flaumhaar-Umwandlung.
Der Verlust der Haare auf dem menschlichen Kopf, besonders der, welcher zur männlichen Kahlheit führt, ist ein natürlicher Vorgang, der oft mit fortschreitendem Alter assoziiert wird. Kahlheit, die bei jungen Leuten, insbesondere Männern, auftritt, kann den Eindruck erwecken, daß das Alter schneller voranschreitet als der Wirklichkeit entspricht.
Kahlheit kann auch von einer Hautkrankheit, bekannt als Alopecia areata, herrühren.
Seit undenklichen Zeiten streben Menschen danach, die Erscheinung von Jugend mit Tränken und Lotionen beizubehalten, den Hautzustand zu erhalten und auch den natürlichen Alterungsprozess aufzuhalten. Dies trifft auch für den Haarausfall zu, mit dem Ergebnis, daß viele Haarwuchsmittel, Haarlotionen u.dgl., in einem Versuch, den Haarausfall zu verlangsamen oder zu stoppen oder das Haarwachstum zu fördern, auf die Kopfhaut aufgetragen wurden.
Um zu bestimmen, ob eine Substanz wenigstens die Fähigkeit hat, das Haarwachstum auf der Kopfhaut zu erhalten oder sonst zu verstärken oder sogar das Wachstum zu verzögern, ist es zunächst notwendig, klinische Tests, unter Einbeziehung des Auftragens der Substanz auf die Haut von einem Versuchstier, z.B. der Ratte oder auch menschlicher Freiwilliger, auszuführen. Obwohl letztendlich die Ergebnisse von in vivo klinischen Tests benötigt werden, um Patentierung und/oder kommerzielle Verwertung zu unterstützen, sind solche Tests zeitintensiv und teuer auszuführen. Folglich besteht ein Bedürfnis nach in vitro Screening Tests, um schnell zu bestimmen, ob oder nicht eine Substanz wenigstens das Potential zum Steigern oder Verzögern des Haarwachstums hat.
In der Vergangenheit wurden Versuche gemacht, Haarfollikeln zu isolieren und dann zu kultivieren, um die Lebensfähigkeit zu erhalten, um sie zu benutzen, um die Aktivität einer potentiellen Haarwachstumssubstanz durch Untersuchung ihres biochemischen Verhaltens nach Kontakt mit diesen Substanzen zu bestimmen. Auf ein Beispiel hierfür wird von Rogers et al. in einer Veröffentlichung mit dem Titel "Cultivation of Murine Hair Follicles as Organoids in a Collagen Matrix", veröffentlicht in Journal of Investigative Dermatology, 89, Nr. 4, (1987), 369 - 379, verwiesen, der die Isolierung und Kultivierung von funktionell intakten Mäusehaarfollikeln beschrieb. In dieser Technik wurden Follikeln durch Kollagenase-Verdau der Dermis von fünf Tage alten Mäusen isoliert und durch Differentialzentrifugation und Filtration aufgereinigt. Aufgereinigte Follikeln wurden dann in einer Kollagenmatrix kultiviert.
In einer weiteren Technik, beschrieben von Buhl et al. in einer Veröffentlichung mit dem Titel "Minoxidil stimulates mouse vibrissae follicles in organ culture", veröffentlicht in Journal of Investigative Dermatology", 92, Nr. 3, (1989), 315 - 320, wird ein Verfahren zum Test des haarwachstumsstimulierenden Arzneimittels, Minoxidil, beschrieben. Hier wurden Bartfollikeln von drei Tage alten Mäusen herausgeschnitten und in Dulbecco's Modified Eagles Medium, mit zugefügtem fötalen Kälberserum und Gentamicin, mit oder ohne Minoxidil, in der Gegenwart von 10 % CO&sub2; bei 37ºC kultiviert, und die Follikelfunktion wurde durch Meßung der Aufnahme von radiomarkierten Cystein, Glycin und/oder Thymidin, durch Quantifizierung der Änderungen in der Follikelhaarschaftlänge und mit Histologie bewertet. Die Autoren berichteten, daß die Kultur der Kontrollfollikeln (ohne Minoxidil) makroskopische Änderungen, unter Beinhaltung von Knicken der Haarschäfte und Biegen der Follikeln, zeigte. Weiterhin war Nekrose in den unterschiedlichen Epithelialelementen, die die Kutikula, Cortex und innere Wurzelscheide bilden, augenscheinlich. Obwohl die Kultur von ähnlichen Follikeln in der Gegenwart von Minoxidil diese Abnormalitäten reduzierte oder eliminierte und sie veranlaßte, länger zu wachsen als Kontrollen während einer Drei-Tage-Periode, ist es klar, daß die ursprünglich angewandte Ausschneidetechnik (unter Verwendung eine Juwelierspinzette, an abgetrennten Bartpolstern arbeitend) einen ausreichenden Schaden verursachte, um die einzelnen Bartfollikeln in ihrer Nützlichkeit im Test potentieller Haarwuchsförderer zu beeinträchtigen. Folglich bleibt ein Bedürfnis nach einer feineren jedoch produktiven Technik, um Haarfollikeln aus der Haut in einem unbeschädigten Zustand zu entfernen, so daß sie dann zuverlässig genutzt werden können, um, durch Kultivierung in einem völlig lebensfähigen Zustand, die potentielle Aktivität von Substanzen als fördernde oder verzögernde Haarwuchsmittel zu bewerten.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Wir haben nun eine sorgfältige und detaillierte Studie über die Histologie der Haarfollikel und des umgebenden Gewebes, in welchem sie gelegen ist, gemacht und wir haben beobachtet, daß dort, wo der Haarschaft durch die Dermis dringt, der Adhäsionsgrad zwischen dem Haarschaft und dem umgebenden Hautgewebe so ist, daß die Haarzwiebel stets beschädigt wird, wenn sie von ihrem Platz in den subkutanen Fettschichten unter der Hautoberfläche weggezogen wird. Wir haben folglich geschlossen, daß es dieser Schaden ist, welcher die nachfolgende Reaktion der abgetrennten Haarfollikel auf Kultivierung in einem geeigneten Nährmedium bewirkt, ein Faktor, der Experimente, die auf die Kultivierung von durch herkömmliches Ausschneiden abgetrennte Haarfollikeln aufbauen, zum Testen des Einflusses von Substanzen auf das Haarwachstum ungültig macht.
Während wir andere Methoden zum Abtrennen intakter und unbeschädigter Haarfollikeln von der Haut ausprobierten, erdachten wir eine erfolgreiche Technik, welche erstens das Abtrennen des Haarschafts, bevorzugt an der dermal-subkutanen Fettzwischenschicht, beinhaltete, so daß die intakte Haarzwiebel im folgenden ohne Schaden entfernt werden konnte. Die Tatsache, daß der Haarschaft abgetrennt wurde, stellte einen nützlichen Referenzpunkt zum genauen Messen der Haarverlängerung (falls vorhanden) während der Kultivierung zur Verfügung, als offenbar war, daß dies nicht die absolute Rate des Haarwachstums beeinflußte. Die weitere Beobachtung, daß, unter Verwendung unserer speziellen Technik aus Haut entfernte Haarfollikeln, gerade, ohne Abnormalitäten und ohne Nekrose oder Entwicklung biochemischer Abnormalitäten wuchsen, fügte weiteres Vertrauen in unseren Glauben, daß das Abtrennen der Haarfollikel ohne Beschädigung der Haarzwiebel von höchster Bedeutung für den Erfolg eines Verfahrens zum Testen der Reaktion auf Substanzen auf Förderung oder Verzögerung des Haarwachstums war, für welches wir ein Monopol anstreben.
Außerdem konnte die Abtrennung der Haarfollikel aus der Haut ohne Beschädigung der Haarzwiebel durch diese neue Technik auch die Untersuchung von Substanzen unter anderen Aspekten des sich entwickelnden Haares, wie Pigmentbildung, erleichtern. Somit hat es diese Technik z.B. möglich gemacht, ohne auf Versuche mit lebenden Tieren zurückzugreifen, Agentien, von denen man glaubt, daß sie die Melanozytenaktivität fördern oder inhibieren, zu untersuchen.

DEFINITION DER ERFINDUNG

Die Erfindung offenbart folglich ein Verfahren zum Testen einer Substanz auf ihr Vermögen, das Haarwachstum zu fördern, zu erhalten, zu steigern oder zu hemmen oder die Haarpigmentation zu beeinflussen. Dieses Verfahren umfaßt die Schritte:
i. Isolieren eines lebenden Haarfollikels von der Haut, umfassend den Schritt der Abtrennung des Haarschafts des Follikels unterhalb der Epidermis/Haut-Oberfläche, vor deren Isolation von der Haut ohne Beschädigung der Haarzwiebel;
ii. Erhalten des isolierten, lebenden Haarfollikels in einem Nährmedium
iii. Inkontaktbringen des isolierten Haarfollikels in besagtem Medium mit einer Testsubstanz und
iv. Bewertung der Reaktion von besagtem Haarfollikel auf besagte Testsubstanz.

OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Isolierung des Haarfollikels aus Haut

Das der Erfindung entsprechende Testverfahren umfaßt den wichtigen Schritt der Isolation von Haarfollikeln, die eine unbeschädigte Haarzwiebel haben, aus Haut, bevorzugt aus menschlicher Haut, durch Mikrodissektion, aber bevorzugt ohne enzymatische Vorbehandlung, die andere Fachleute auf diesem Gebiet befürworten. Es ist wichtig zu bemerken, daß enzymatische Vorbehandlung, unter Verwendung von Kollagenase in Entsprechung mit der zuvor zitierten Lehre von Rogers et al. vermieden werden sollte, wenn die Lebensfähigkeit und biochemische Funktion des Haarfollikels in einem unverminderten Stadium, nach der Entfernung aus der Haut, erhalten werden soll.
Wie bereits gesagt wurde, ist eine Abtrennung der Haarfollikeln mit einer intakten, unbeschädigten und voll funktionierenden Haarzwiebel, selbst ohne enzymatische Vorbehandlung, durch normale Mikrodissektionsmethoden, im Hinblick auf den Grad der Adhäsion, der zwischen dem Haarfollikel und dem Hautgewebe, wo er durch die Dermis dringt, existiert, praktisch unmöglich. Somit verursacht die Abtrennung der Dermis von der Haarfollikel fast ausnahmslos eine Beschädigungen der Haarzwiebel.
Der kritische Schritt der Abtrennung des Haarfollikels mit intakter unbeschädigter Haarzwiebel von dem subkutanen Fettgewebe, in welchem er sich befindet, umfaßt entsprechend das Abtrennen des Haarschafts des Follikels an einem Punkt unterhalb der Epidermis oder Hautoberfläche, so daß die Haarzwiebel intakt und unbeschädigt bleibt, während sie noch einen Teil des Haarschafts trägt.
Bevorzugt wird der Haarschaft des Follikels an der dermalsubkutanen Fettzwischenschicht getrennt.
Jedes geeignete Schneideinstrument kann verwendet werden, um den Haarschaft auf diese Weise zu trennen, aber ein Keratom oder ein Skalpell sind bevorzugt.
Die Haarzwiebel mit einem anhängenden Haarschaftstumpf wird dann von der Haut durch mechanische Abtrennung des Haares von lose anhaftendem subkutanen Fett, welches normalerweise die Haarzwiebel umgibt, isoliert. Dieses wird ausgeführt, nachdem die Dermis oder obere Schicht der Haut abgetrennt und entfernt wurde, um eine Beschädigung der Haarzwiebel, wenn sie herausgezogen wird, zu vermeiden. Die Haarzwiebel zusammen mit dem anhängenden Haarschaftstumpf wird dann in einem sonst unbeschädigten und voll funktionierenden, lebenden Zustand in ein Nährmedium überführt.

Kultivierung des isolierten Haarfollikels

Die durch die hierin beschriebene Technik isolierten Haarfollikeln werden zum nachfolgenden Testen von Substanzen, die dann deren weitere Entwicklung beeinflussen können, in ein geeignetes Kultivierungsmedium überführt.
Das nun beschriebene Verfahren stellt ein bevorzugtes Verfahren zum Kultivieren und Testen des Haarwachstums dar und ist ausschließlich für die hierin dargelegten Prinzipien erläuternd. Es ist folglich so zu verstehen, daß andere als das beschriebene Kultivierungsmedium und die Meßtechnik geeignet sind und daß das angestrebte Monopol nicht allein auf dieses bevorzugte Verfahren von Kultivierung und Meßtechniken begrenzt ist.
In Übereinstimmung mit dem bevorzugten Verfahren der Kultivierung wurden isolierte Haarfollikeln in 500 ul von Williams E Medium bei 37ºC in einer Atmosphäre von 5 % CO&sub2; + 95 % Luft in einzelnen Vertiefungen einer 24 Multivertiefungsplatte (Corning), welche es erlaubte, detaillierte Messungen der Länge von individuellen Haarfollikeln zu machen, gehalten.
Williams E Medium ist von FLOW Laboratory unter Katalog Nr. 12-502 erhältlich. Die Zusammensetzung von Williams E Medium wird von Williams GM, et al., in Experimental Cell Research 69 (1971) auf Seite 106 beschrieben.
Haarschaftlängenmessungen, ausgeführt an diesen Follikeln, unter Verwendung eines Nikon Diaphot invertierten Binokularmikroskops mit Meßskalenaufsatz, zeigten, daß während 4 Tage Kultivierung, die Follikeln signifikant an Länge zunahmen. Darüber hinaus zeigte ein photographischer Beweis, daß dieser Längenzuwachs nicht mit einer Zerstörung des Haarfollikelaufbaus verbunden ist. Im einzelnen kann der Längenzuwachs der Produktion von keratinisiertem Haarschaft zugeschrieben werden.
Es ist auch möglich, mehrere verschiedene biochemische und morphometrische Analysen zur Untersuchung des Einflusses einer Substanz auf den lebenden Haarfollikel anzuwenden. Zum Beispiel zeigt Autoradiographie, unter Verwendung von tritiummarkiertem Thymidin, daß in frisch isolierten Haarfollikeln das typische Muster der Zellteilung stattfindet, wobei die Mehrheit der Thymidinaufnahme in den Keimschichtzellen der der Hautpapille benachbarten Haarfollikelzwiebel auftritt. Während viertägiger Erhaltung bleibt dieses Muster konstant.
Diese Beobachtungen, sowohl histologisch und biochemisch an, mit unserer speziellen Technik abgetrennten, Haarfollikeln und kultiviert in Williams E Medium ohne den Zusatz von einem Haarwachstumsförderer als eine Testsubstanz, bestätigte die Gültigkeit unserer Technik, da eine Abnormalität im Wachstum und biochemischer Reaktion völlig abwesend war. Hieraus schlossen wir, daß das hierin beschriebene Testverfahren eine gültige Technik zum Test einer Reaktion auf Substanzen auf das Wachstum und andere Änderungen in Haarfollikeln darstellt.

Experimentelles Testen von Haarwachstumsanregern oder -hemmern

Die hierin beschriebenen Techniken können zum Test von Substanzen oder Gemischen, die diese enthalten, auf ihre Fähigkeit entweder als Haarwachstumsförderer zum Auslösen, Unterhalten oder Steigeren des Haarwachstum oder als Haarwachstumshemmer zum Schwächen oder Stoppen des Haarwachstum, als eine Alternative zum Benutzen von Haarentfernern, zu wirken, angewandt werden.
Die Reaktion eines isolierten Haarfollikel auf eine Testsubstanz kann folglich unter Verwendung einer oder mehrerer der hierin beschriebenen Verfahren zur Überprüfung der Isolierungstechnik und Kultivierung von Haarfollikeln in einem geeigneten Wachstumsmedium, wie Williams E Medium, bewertet werden. Eine Kultivierung in dem geeigneten Wachstumsmedium wird daher ein Kontrollsystem zum Vergleich mit der Kultivierung in demselben, die Testsubstanz enthaltenden, Medium, zur Verfügung stellen.
Geeignete Verfahren zum Bewerten der Reaktion auf eine Testsubstanz gegenüber der Kontrolle während einer Vier-Tage- Kultivierungsperiode umfassen folglich:
1. Messen der Zunahme (falls vorhanden) der Länge der Haarfollikel; und
2. Messen der Zunahme (falls vorhanden) der [Methyl³H]- Thymidinaufnahme;
Das hierin offenbarte Testverfahren ist nicht auf diese zwei Parameter beschränkt, da die Änderung in jeder physikalischen, chemischen oder biochemischen Eigenschaft der isolierten Haarfollikel zum Bewerten der Reaktion auf eine Testsubstanz benutzt werden kann.

Beispiele

Die Ergebnisse, die unter Verwendung des in der Erfindung offenbarten Verfahrens erhalten wurden, sind wie folgt veranschaulicht.
Haarfollikeln, isoliert aus lebender, menschlicher, weiblicher Haut, wurden in Williams E Medium, enthaltend einen Zusatz von 1 % fötalem Kälberserum [Foetal Calf Serum (FCS)], in Übereinstimmung mit dem hierin beschriebenen und definierten Verfahren, gehalten.
Haarwachstum wurde während einer 72-Stunden-Periode gemessen und Raten der [Methyl - ³H]-Thymidinaufnahme wurden während einer Periode von 3 Stunden Inkubation aufgezeichnet. In jedem Fall wurden Messungen an wenigstens 6 Haarfollikeln von jeder Hautprobe gemacht.
Statistische Analyse wurde unter Verwendung von Student's t-Test ausgeführt, um Unterschiede zwischen mit 1 % FCS gehalten Follikeln (Kontrolle) und behandelten Follikeln, gehalten in der Gegenwart von TGF-β oder IGF-1 (Testbehandlungen), zu vergleichen.
Die erhaltenen Ergebnisse sind wie folgt tabelliert Behandlung Haarwachstum mm über 72 h [³H]-Thymidin pmol/ug DNA/3 h 1 % FCS (Kontrolle)
Aus den Ergebnissen kann abgeleitet werden, daß TGF-β das Haarwachstum signifikant reduziert und auch die Aufnahme von [Methyl-³H]-Thymidin signifikant reduziert, wohingegen IGF-1 die Aufnahme von [Methyl-³H]-Thymidin signifikant anregt, obwohl dies nicht als eine Änderung in der linearen Wachstumsrate reflektiert wird.
Dieses legt nahe, daß TGF-β als Haarentfernungsmittel aufgrund seiner Fähigkeit, das Haarwachstum, verglichen mit der Kontrolle, zu reduzieren, verwendet werden kann, wohingegen IGF-1 nichtsdestoweniger ein Potential als ein Haarwachstumsanreger hat.

Claims

1. Verfahren zum Testen einer Substanz auf ihre Fähigkeit, Haarwachstum zu fördern, zu erhalten, zu steigern oder zu hemmen oder Haarpigmentation zu beeinflussen, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:

i. Isolieren eines lebensfähigen Haarfollikels aus Haut, umfassend den Schritt der Abtrennung des Haarschafts des Follikels unterhalb der Epidermis/Haut-Oberfläche, vor deren Isolation aus der Haut, ohne Beschädigung der Haarzwiebel;

ii. Erhalten des isolierten, lebenden Haarfollikels in einem Nährmedium;

iii. Inkontaktbringen des isolierten Haarfollikels in besagtem Medium mit einer Testsubstanz, und

iv. Bewerten der Reaktion des Haarfollikels auf besagte Testsubstanz.

2. Verfahren zum Testen nach Anspruch 1, worin die Isolation des Haarfollikels aus Haut den Schritt des Abtrennens des Haarschafts der Follikel an der dermal-subkutanen Fettzwischenschicht umfaßt.

3. Verfahren zum Testen nach Anspruch 2, worin der Haarschaft, unter Verwendung eines Keratoms oder Skalpells, abgetrennt wird.

4. Verfahren zum Testen nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin die Isolierung des Haarfollikels aus der Haut den weiteren Schritt des mechanischen Abtrennens der Haarzwiebel vom umgebenden subkutanen Fett, nach der Abtrennung der Dermis, umfaßt.

5. Verfahren zum Testen nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Nährmedium Williams E Medium umfaßt.

6. Verfahren zum Testen nach Anspruch 5, worin das Nährmedium fötales Kälberserum umfaßt.

7. Verfahren zum Testen nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin die Reaktion des isolierten Haarfollikels auf die Testsubstanz durch Messung der Zunahme (falls vorhanden) der Länge des Haarfollikels bewertet wird.

8. Verfahren zum Testen nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin die Reaktion des isolierten Haarfollikels auf die Testsubstanz durch Messung des Ansteigens (falls vorhanden) der [Methyl-³H)-Thymidinaufnahme durch den Haarfollikel bewertet wird.