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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bewertung des sensibilisierenden
und/oder irritierenden und/oder allergenen Potenzials eines Produkts.
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Die
Haut ist das wichtigste Organ des Organismus und es ist bekannt,
dass sie einen der wesentlichen aktiven Bestandteile des Immunabwehrsystems
darstellt.
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Die
natürliche
menschliche Epidermis besteht hauptsächlich aus drei Arten von Zellen,
wobei es sich zum ganz überwiegenden
Teil um Keratinocyten sowie um Melanocyten und Langerhans-Zellen handelt.
Jeder dieser Zelltypen trägt
durch die ihm eigenen Funktionen zu der äußerst wichtigen Rolle bei, die
die Haut im Organismus übernimmt.
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Die
Langerhans-Zellen sind an den Immunabwehrreaktionen der Haut beteiligt.
Es ist seit langem bekannt, dass sie eine wichtige Funktion bei
der Immunabwehr des Wirtsorganismus haben, insbesondere als erste
Barriere gegenüber äußeren Einwirkungen.
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Die
Langerhans-Zellen sind Zellen, die aus dem Knochenmark stammen und
die durch Expression des CD1a Antigenmarkers charakterisiert werden können (CD1a
positive Zellen). In der Epidermis sind die epidermalen Langerhans-Zellen
außerdem
durch die Anwesenheit von Birbeck-Granula gekennzeichnet (Rowden und Mitarbeiter,
Nature 268: 247–248, 1977).
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Sie
spielen eine entscheidende Rolle bei der Auslösung von Immunantworten, die
gegen Antigene gerichtet sind, die in die Haut eindringen oder von
der Haut generiert werden. Wenn die Langerhans-Zellen mit einem
Allergen in Kontakt gebracht werden, wandern sie in Richtung der
Lymphknoten, wo sie spezifische Reaktionen der T-Zellen auslösen. Sie werden somit
in Antigen-präsentierende
Zellen umgewandelt, die von entscheidender Bedeutung für die Funktionsfähigkeit
der T-Lymphocyten sind.
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Die
Hauptfunktion der Langerhans-Zellen besteht also darin, ein Signal
bereitzustellen, das für die
Immunantwort der Haut sensitiv ist, die von einer Vielzahl von Antigenen
einschließlich
Kontaktallergenen, Tumorantigenen und Mikroorganismen ausgelöst wird.
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Daraus
kann geschlossen werden, dass diese Zellen wahrscheinlich an einer
Vielzahl von Hautkrankheiten beteiligt sind.
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Im übrigen werden
von der Industrie im allgemeinen und von der Kosmetikindustrie im
besonderen immer häufiger
neue Verbindungen in Zusammensetzungen eingearbeitet. Eines der
wesentlichen Probleme, mit denen die Industrie konfrontiert ist,
besteht deshalb darin, die schädlichen
Wirkungen abzuschätzen,
die diese Verbindungen beim Kontakt mit der Haut insbesondere in
Hinblick auf eine Kontaktsensibilisierung hervorrufen können.
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Es
ist daher von entscheidender Bedeutung, das sensibilisierende und/oder
irritierende und/oder allergene Potenzial solcher Produkte einfach
und schnell abschätzen
zu können.
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Es
liegt auf der Hand, dass derartige Abschätzungen aus ethischen Gründen nicht
problemlos am Menschen durchgeführt
werden können
und dass es wünschenswert
ist, dass sie auch nicht an Versuchstieren erfolgen.
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Damit
wird verständlich,
wie wichtig und notwendig es ist, ein in vitro-Modell anzugeben, mit dem Risikoprodukte
gefahrlos, rasch, verlässlich
und ohne großen
Kostenaufwand bewertet werden können.
Ein solches Modell würde
ferner den zusätzlichen
Vorteil mit sich bringen, dass da mit zumindest in Vorstudien eine
Vielzahl von Produkten problemlos bewertet werden kann.
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Eines
der wesentlichen Hindernisse bei der Entwicklung eines solchen Modells
besteht darin, dass es sich bei den Langerhans-Zellen in der Haut um
Zellen handelt, die einen speziellen Differenzierungsprozess durchlaufen
haben. Rambukkana und Mitarbeiter (Laboratory Investigation, Band
74, 1996, Seiten 422–436)
schlagen ein System zur Kultivierung von Haut unter Verwendung von
Langerhans-Zellen vor, die zusammen mit weiteren Hautzellen, wie
Keratinocyten, kultiviert werden. Die Verwendung von Vorläufern von
Langerhans-Zellen wird nicht erwähnt.
In der Druckschrift
WO-A-90
02796 wird vorgeschlagen, in einem System zur Kultivierung
von Haut, das dreidimensional ist, Langerhans-Zellen, die aus Proben von frischer
Haut isoliert wurden, zu Kulturen von Keratinocyten und Melanocyten
zu geben. In eben dieser Druckschrift wird klar zum Ausdruck gebracht,
dass es schwierig ist, diese Zellen in Kultur wachsen zu lassen.
Es zeigt sich nämlich,
dass die aus Epidermis-Proben entnommenen gereinigten Langerhans-Zellen
CD1a positive Zellen sind, die von Vorläufern stammen, die in ihrem Differenzierungszyklus
bis zu dem Punkt fortgeschritten sind, an dem sie zu Zellen werden,
die Birbeck-Granula aufweisen. Wenn diese Zellen einmal isoliert
sind, erfolgt keine weitere Differenzierung und auch keine Proliferation
mehr.
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Da
sich die Zellen nicht vermehren können, besteht die in vitro-Kultivierung
dieser Zellen darin, sie am Leben zu halten. In Wirklichkeit kommen
die Zellen zum Stillstand und sterben ab, ohne dass sie ihre Funktion
erfüllt
haben. Gleiches gilt für
den Fall, dass die Zellen in ein rekonstruiertes Hautmodell eingebracht
werden. Es ist daher nicht möglich,
mit dem erhaltenen Hautäquivalent,
selbst wenn es Langerhans-Zellen enthält, das sensibilisierende und/oder irritierende
und/oder allergene Potenzial eines Produkts abzuschätzen, weil
es keine aktiven Langerhans-Zellen enthält.
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Die
Anmelderin hat nun festgestellt, dass es möglich ist, die Differenzierung
von Vorläufern
von Langerhans-Zellen spontan auszulösen, indem sie in Gegenwart
von Keratinocyten kultiviert werden. Auf dieser Basis hat die Anmelderin
ein Verfahren zur Bewertung des sensibilisierenden und/oder irritierenden und/oder
allergenen Potenzials eines Produkts entwickelt.
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Die
Erfindung hat daher ein Verfahren zur Bewertung des sensibilisierenden
und/oder irritierenden und/oder allergenen Potenzials eines Produkts zum
Gegenstand, das dadurch gekennzeichnet ist, dass zumindest Keratinocyten
und Vorläufer
von Langerhans-Zellen gemeinsam während einer Zeitspanne kultiviert
werden, die ausreicht, um die Differenzierung der Vorläufer der
Langerhans-Zellen auszulösen,
die Kultur und das zu testende Produkt während einer hinreichend langen
Zeit miteinander in Kontakt gebracht werden, die Veränderung
eines Markers für
das sensibilisierende und/oder irritierende und/oder allergene Potenzial
des Produkts bestimmt wird und die Ergebnisse dieser Bestimmung im
Verhältnis
zu einer Kontrollprobe bewertet werden.
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Die
erfindungsgemäß verwendeten
Keratinocyten können
nach beliebigen Verfahren gewonnen werden, die im Stand der Technik
bekannt sind. Es können
beispielsweise die Kultivierung aus dissoziierter Epidermis, die
von einer Probe von normaler oder krankhafter Haut stammt, oder
die Kultivierung von Keratinocyten, die aus der Wurzelscheide von normalen
oder krankhaften Haarfollikeln stammen, angegeben werden.
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Gemäß der Erfindung
werden die verwendeten Keratinocyten vorzugsweise nach dem in Régnier und
Mitarbeiter, Frontier of Matrix Biology, Band 9, 4–35 (Karger,
Basel 1981) beschriebenen Verfahren aus dissoziierter Epidermis
gewonnen, die aus Proben von normaler oder krankhafter Haut stammt.
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Bei
den erfindungsgemäß verwendeten
Keratinocyten handelt es sich vorteilhaft um menschliche Keratinocyten.
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Die
Vorläufer
von Langerhans-Zellen können beliebige
Zellstämme
sein, die befähigt
sind, sich unter der Einwirkung einer Induktion in Langerhans-Zellen
zu differenzieren, d. h. die befähigt
sind, sich in CD1a positive Zellen zu differenzieren. Bei den Vorläufern kann
es sich vorteilhaft um hämatopoetische CD34+
Zellen handeln (Caux und Mitarbeiter, Nature, Band 360, November
1992, 258).
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Die
Vorläufer
von Langerhans-Zellen können ausgehend
von Geweben, in denen sie natürlicherweise
vorliegen und von denen Knochenmark, peripheres Blut und Nabelschnurblut
angegeben werden können,
gereinigt werden.
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Nach
dem erfindungsgemäßen Verfahren werden
vorzugsweise Vorläufer
von Langerhans-Zellen verwendet, die aus peripherem Blut oder Nabelschnurblut
gewonnen wurden und noch bevorzugter Vorläufer, die aus Nabelschnurblut
gewonnen wurden.
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Die
erfindungsgemäß verwendeten
Vorläufer von
Langerhans-Zellen sind vorteilhaft menschlichen Ursprungs.
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Es
können
zu diesem Zweck beliebige Reinigungsverfahren angewandt werden.
Es kann beispielsweise das Verfahren angegeben werden, das in Caux
und Mitarbeiter, Nature, Band 360, November 1992, 258, beschrieben
ist.
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Gemäß der Erfindung
liegt das Verhältnis
der Anzahl von Keratinocyten zu den Vorläufern von Langerhans-Zellen
im Bereich von 95/5 bis 25/75 in Prozent der Gesamtzahl der in der
Kultur befindlichen Zellen und vorzugsweise im Bereich von 75/25
bis 35/65; noch bevorzugter liegt dieses Verhältnis bei 50/50.
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Bei
dem für
das erfindungsgemäße Verfahren
verwendeten Nährmedium
kann es sich um ein beliebiges Nährmedium
handeln, von dem bekannt ist, dass es die Proliferation und Differenzierung
von Keratinocyten gewährleisten
kann. Es können
beispielsweise das von Dulbecco modifizierte Eagle-Medium oder ein
definiertes Medium mit variablem Calciumgehalt, wie das von S. T.
Boyce und R. G. Ham (J. Tissue Cult. Meth., 1985, 9, 83–93) beschriebene
Medium, angegeben werden.
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Gemäß der Erfindung
ist es vorteilhaft möglich,
ein Gemisch mehrerer Nährmedien
zur verwenden, wie beispielsweise das Gemisch aus von Dulbecco modifiziertem
Eagle-Medium und HAM F12-Medium oder dem Medium von Rheinwald und Green
(Cell, 1975, 6, 331–334).
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Gemäß der Erfindung
werden zumindest Keratinocyten und Vorläufer von Langerhans-Zellen
gemeinsam während
einer Zeitspanne kultiviert, die ausreicht, um die Differenzierung
der Vorläufer
der Langerhans-Zellen auszulösen.
Wie zuvor beschrieben handelt es sich bei den reifen Langerhans-Zellen um
Zellen, die durch die Anwesenheit von Birbeck-Granula und die Expression des CD1a
Antigenmarkers gekennzeichnet sind. Die hinreichende Kultivierungszeit
entspricht daher im allgemeinen im Minimum der Zeit, die zur Ausbildung
dieser Merkmale erforderlich ist. Die Keratinocyten und die Vorläufer von
Langerhans-Zellen werden, um eine Größenordnung anzugeben, während einer
Zeitspanne im Bereich von 1 bis 30 Tagen und vorzugsweise während einer
Zeitspanne im Bereich von 2 bis 13 Tagen zusammen kultiviert.
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Gemäß der Erfindung
können
die Zellen und das zu testende Produkt auf beliebige Art und Weise in
Kontakt gebracht werden. Vorzugsweise wird jedoch erfindungsgemäß das zu
testende Produkt in dem Kulturmedium in Lösung gebracht.
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Das
zu testende Produkt kann in beliebigen Formen vorliegen, die damit
kompatibel sind, es mit den Zellen in Kontakt zu bringen. Es kann
insbesondere in Form von reinen Molekülen oder auch in Form einer
Zusammensetzung vorliegen.
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Die
Inkubationszeit des zu testenden Produkts mit der Zellkultur bestimmt
sich im allgemeinen über
die Zeit, die erforderlich ist, damit die Kultur auf das Produkt,
mit dem sie in Kontakt gebracht wurde, reagiert, d. h. über die
Zeit, die erforderlich ist, damit eine Veränderung des Expressionsniveaus
des Markers für
das sensibilisierende und/oder irritierende und/oder allergene Potenzial
des Produkts erkennbar wird.
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Die
Inkubationszeit kann einige Sekunden bis zu mehreren Tagen betragen.
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Die
Inkubationszeit liegt beispielsweise gewöhnlich im Bereich von 5 Sekunden
bis 72 Stunden und vorzugsweise von 1 bis 24 Stunden.
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Unter
einem Marker für
das sensibilisierende und/oder irritierende und/oder allergene Potenzial des
Produkts werden gemäß der Erfindung
beliebige Markerelemente verstanden, deren Anwesenheit, Abwesenheit,
Veränderung
der Expression oder Veränderung
der Verteilung als Reaktion auf den Kontakt der Zellkultur mit dem
zu testenden Produkt bestimmt werden kann. Beispiele für Marker
sind etwa Nucleinsäuren,
Proteine oder Gruppen von Proteinen, die gegebenenfalls gebunden
sind, Ionen, Zellorganellen, Lipide oder Polysaccharide, wobei diese
Aufzählung
nicht einschränkend
ist.
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Der
Marker ist vorzugsweise ein Markerelement, das die Reaktion der
Langerhans-Zellen auf das zu testende Produkt zeigt. Sämtliche
Angaben, die diesbezüglich
für ein
gutes Verständnis
der immunologischen Phänomene
erforderlich sind, an denen die Langerhans-Zellen beteiligt sind,
sind in „The
Immune Functions of Epidermal Langerhans Cells” (Heidrun Moll, 1995, Springer
Verlag und R. G. Landes Company Editors) zu finden.
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So
ist bekannt, dass als Reaktion auf den Kontakt mit einem Produkt,
das ein sensibilisierendes und/oder irritierendes und/oder allergenes
Potenzial aufweist, die Dichte der Moleküle des Haupt-Histokompatibilitäts-Komplexes
(MHC) der Klasse II oder die Expression von Cytokinen, wie von Interleukin-1α, Interleukin-1β, dem Kolonie-stimulierenden
Faktor (Granulocyte/Macrophage – Colony Stimulating
Factor oder GM-CSF), dem Tumor-Nekrose-Faktor (Tumor Necrosis Factor
oder TNF-α), dem
Interferon-induzierten Protein 10 (interferon-induced Protein 10
oder IP10), dem inflammatorischen Makrophagen-Protein vom Typ 2
(macrophage inflammatory Protein 2 oder MIP2) oder von Interferon-γ (IFN-γ), verändert werden.
Eine kurze Einwirkung eines Allergens führt beispielsweise zu einer
Erhöhung
des Gehalts an Boten-Ribonucleinsäuren (mRNA) von IL-1β, TNF-α, IFN-γ, IP-10,
MIP-2 oder IL-α.
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Gemäß der Erfindung
ist der Marker für
das sensibilisierende und/oder irritierende und/oder allergene Potenzial
des zu testenden Produkts vorzugsweise Interleukin-1β und noch
bevorzugter der Grad der Expression der mRNAs von Interleukin-1β.
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Die
Aktivität
der zu testenden Substanz wird durch die Veränderung des Markers angezeigt,
der für
die Analyse ausgewählt
wird.
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Unter
Veränderung
wird jegliche Veränderung
der Menge, der Konzentration oder der Verteilung des Markers, der
analysiert wird, verstanden.
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Zu
diesem Zweck beinhaltet das erfindungsgemäße Verfahren einen Schritt
zur Analyse des Markers für
das sensibilisierende und/oder irritierende und/oder allergene Potenzial
des zu testenden Produkts.
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Nach
der Inkubation kann die Analyse bei den von der Kultur abgesonderten
Markerelementen direkt an dem Kulturmedium erfolgen oder bei den nicht
abgesonderten Markerelementen in den Zellen.
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Daher
und insbesondere dann, wenn das für die Analyse gewünschte Markerelement
nicht abgesondert wird, kann vor der Analyse ein zusätzlicher Schritt
in Betracht gezogen werden, bei dem die Zellen zerkleinert werden,
um den zu analysierenden Marker für die Aktivität der getesteten
Substanz besser zugänglich
zu machen.
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Es
ist selbstverständlich,
dass unabhängig von
der Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
beliebige dem Fachmann bekannte Analysemethoden angewandt werden
können.
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Es
können
beispielsweise die Verfahren zur Analyse von Proteinen oder Nucleinsäuren durch
Kolorimetrie, Elektrophorese, reverse Transkription und Amplifikation
durch die Technik der Kettenpolymerisation, Massenspektrometrie,
Chromatographie (Gaschromatographie oder Plattenchromatographie),
immunologische Verfahren oder auch optische Mikroskopie oder Elektronenmikroskopie
zur quantitativen Bestimmung von Organellen angegeben werden, wobei
diese Aufzählung
nicht einschränkend
ist.
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Das
Ergebnis der Analyse, das die Veränderung des für die Analyse
ausgewählten
Markers für das
sensibilisierende und/oder irritierende und/oder allergene Potenzial
des zu testenden Produkts zeigt, ist als solches nicht direkt verwertbar.
Es wird nur insoweit aussagekräftig,
als es mit dem Ergebnis der gleichen Analyse verglichen wird, die
unter den glei chen Bedingungen durchgeführt wurde, jedoch ohne, dass
die Kultur in irgendeiner Form mit dem zu testenden Produkt in Kontakt
gebracht wurde.
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Aus
diesem Grund schließt
das erfindungsgemäße Verfahren
einen Schritt mit ein, bei dem die Ergebnisse der Analyse im Verhältnis zu
einer Kontrollprobe bewertet werden.
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Dem
Fachmann wird es aus seiner Erfahrung heraus leicht fallen, die
Art der Vergleichsprobe, die für
die Durchführung
des Verfahrens erforderlich ist, zu ermitteln. Bei der Vergleichsprobe
handelt es sich vorzugsweise um eine identische Kultur, die nicht
mit dem zu testenden Produkt in Kontakt gebracht wurde.
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Ein
Vorteil der Erfindung besteht darin, dass sie auf dem Gebiet der
Immunologie und/oder der Allergologie ein Testverfahren für ein gegebenenfalls sensibilisierendes
und/oder irritierendes und/oder allergenes Produkt zur Verfügung stellt,
das sowohl einfach als auch schnell und wirksam ist.
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Es
ist leicht zu verstehen, dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
auch Produkte bewertet werden können,
die dazu befähigt
sind, die sensibilisierende und/oder irritierende und/oder allergene Wirkung
eines anderen Produkts zu modulieren oder sogar zu inhibieren.
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Bei
dieser speziellen Anwendung umfasst das vorstehend angegebene erfindungsgemäße Verfahren
einen zusätzlichen
Schritt, bei dem ein Produkt appliziert wird, das zur Modulation
oder sogar zur Inhibierung der sensibilisierenden und/oder irritierenden
und/oder allergenen Wirkung befähigt
ist, bevor, während
oder nachdem der Kontakt mit dem sensibilisierenden und/oder irritierenden
und/oder allergenen Produkt erfolgt. Die Kontrollprobe ist dann eine
Kultur, in der das sensibilisierende und/oder irritierende und/oder
allergene Referenzprodukt vorliegt, jedoch nicht das zu bewertende
Produkt, das dazu befähigt
ist, die sensibi lisierende und/oder irritierende und/oder allergene
Wirkung zu modulieren oder sogar zu inhibieren.