WO2009015628A1 - Immortalisierte keratinozyten-zelllinie und verfahren zur messung von protektiven mitteln - Google Patents

Immortalisierte keratinozyten-zelllinie und verfahren zur messung von protektiven mitteln Download PDF

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WO2009015628A1
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gingival
cell line
immortalized
keratinocyte
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PCT/DE2008/001134
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Jörg MEYLE
Sabine GRÖGER
Jörg MICHEL
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Justus-Liebig-Universität Giessen
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    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/04—Immortalised cells

Definitions

  • the present invention relates to an immortalized keratinocyte cell line and a test method in which the cell line is used to test the effect of protective and / or modifying substances (e.g., anti-infective agents, oral care products) on the epithelial function of the gingiva / peridontium in vitro.
  • protective and / or modifying substances e.g., anti-infective agents, oral care products
  • the invention relates to the general field of periodontology, in particular a cell line from the epithelial component of the periodontium, called gums or gingiva / peridontium.
  • the gingiva consists of a multi-layered squamous epithelium with only a few horny layers. Since there is no subcutis (subcutaneous tissue), the gums are not movable and can not be imitated.
  • the object of the present invention is to provide suitable cell lines from cells of the gingiva and a cell culture system with which bacterial, toxic and / or immunological stimuli can be tested in large sample throughputs and their effect can be tested for protective and / or modifying substances.
  • the invention is based on own scientific investigations on the epithelial function of the gingiva / peridontium in vitro.
  • Primary cell cultures from gingival tissue were used, but these have only a very limited lifespan.
  • For a run of experiments parallel different primary cell cultures must be created, which are subject to the individual differences and cause a high error rate in the analysis.
  • Starting from these primary cell cultures it was possible to produce an immortalized gingival keratinocyte cell line, which surprisingly combines numerous positive properties that are absolutely comparable to those of primary keratinocytes.
  • the immortalized gingival keratinocyte cell line has a stable expression of cytokeratins and the formation of a trans-epithelial resistance, it secrets inflammatory mediators, but, in contrast to primary cells, advantageously additionally has the capacity for unlimited reproduction.
  • the cultivation of cells of immortalized gingival Keratinocyte cell line also occurs on TranswellCol inserts, resulting in the formation of epithelial-like cell stratification. For example, functional characteristics such as transepithelial resistance (TEER) can be systematically recorded.
  • TEER transepithelial resistance
  • the secretory performance of the cells can be measured, which also takes into account the secretion direction due to the arrangement of the cells in so-called inserts.
  • the invention encompasses a method for producing the immortalized gingival keratinocyte cell line from tissue material and culturing in cell culture systems which are available for numerous scientifically and economically interesting investigations and applications.
  • a stable system of cells of immortalized gingival keratinocyte cell line with consistent characteristics is provided for a variety of parallel series of experiments and issues, e.g. for the reaction of gingival epithelial cells to bacterial, toxic and / or immunological stimuli, to protective and / or modifying substances.
  • the protective and / or modifying effect is directed above all to the various human-living germs which are disease-causing, such as gram positive and negative bacteria or viruses, e.g. Actinobacillus actinomycetemcomitans, spirochetes, Porphyromonas gingivalis, Bacteroides forsythus, Prevotella intermedia, Eubacterium nodatum, Treponema denticola, Streptococcus intermedia, Prevotella negrens, Peptostreptococcus micros, Campylobacter rectus, Fusobacterium nucleatum, Eikenella corrodens, Selenomonas spe cies, Gram -negative enterococci, Pseudomonas species, staphylococci, cytomegalovirus, Epstein-Barr virus type 1.
  • gram positive and negative bacteria or viruses e.g. Actinobacillus actinomycetemcomitans, spiro
  • Oral streptococci such as Streptococcus mutans and Streptococcus salivarius cause caries, but can also penetrate into the systemic circulation through injuries and lead to sepsis, abscesses in the throat, lungs and liver, or even heart valve inflammation.
  • the dental disease parodontitis is possibly an independent cardiac infarct and aploplexy risk factor.
  • atheromas of coronary arteries pathogenic periodontal disease germs have been found.
  • the lipopolysaccharides released by the germs stimulate macrophages to form cytokines and other messengers such as IL1, prostaglandin E, and TNF-alpha.
  • the cell culture system according to the invention contributes to the fact that routine tests for the analysis of potentially protective and / or modifying agents are feasible and actually protective and / or modifying agents are identified, and side effects of these agents are determined, for example, by measuring the anti-ignition mediators.
  • the cell culture system of the present invention is used as a substitute for animal experiments because it has properties that correspond to the in situ situation of a gingival epithelial dressing. At the same time, due to the immortalization, the stability of the test system can be ensured even with a number of 100-500 test runs. Thus, the possibilities of comparability and reproducibility in a comprehensive series of experiments for the analysis of potentially protective and / or modifying agents are significantly expanded.
  • transfection is understood as meaning a method which is suitable for introducing nucleic acid molecules into the cells, known methods include electroporation, calcium phosphate method, lipofection.
  • primary cells refers to cells taken directly from the tissue of an organism and maintained in culture, the lifetime of the primary cells being limited.
  • immortalized cells is understood to mean cells that have been genetically modified in such a way that they permanently spread into cell culture under suitable culture conditions. embodiments
  • a primary human gingival keratinocyte cell line is first created.
  • Starting material for this are biopsies (about 5 mm in diameter) of the buccal gingiva of the distal region of the lower yoke of a human.
  • the tissue is collected and stored in sterile medium (eg, DMEM, Life Technologies) containing preferably 10% FCS and preferably 100 penicillin / streptomycin per ml of medium.
  • sterile medium eg, DMEM, Life Technologies
  • FCS preferably 100 penicillin / streptomycin per ml of medium.
  • the tissue is thoroughly washed with, for example, PBS containing preferably 100 U of penicillin; 0.1 mg streptomycin and preferably 0.25 ⁇ g amphotericin B per ml of medium.
  • tissue is cut into small pieces, eg 2 - 4 mm 2 ) and transferred to suitable tissue culture vessels (eg 10 cm 2 cell culture dishes from Greiner) and mixed with serum-free medium (eg DMEM: Ham's F12; Life-Technologies).
  • suitable tissue culture vessels eg 10 cm 2 cell culture dishes from Greiner
  • serum-free medium eg DMEM: Ham's F12; Life-Technologies
  • the cells are transferred according to the standard trypsinization protocol (eg with 0.05% trypsin-EDTA from Gibco-BRL) as a single-cell suspension for passage 2 in cell culture bottles ( eg in 75cm 2 bottles Greiner).
  • trypsinization protocol eg with 0.05% trypsin-EDTA from Gibco-BRL
  • the starting material may also be from biopsies from other gingivae-bearing organisms, such as mammals, dogs, cats, and horses, and the immortalized keratinocyte gingival cell line also includes those species.
  • the primary human gingival keratinocytes in passage 2 from step 1 are counted and e.g. 0.8 cells per well seeded in a 96 well microtiter plate. This can alternatively be controlled microscopically.
  • Genetic material is generally introduced into the cell by means of transfection lipids, vesicles which fuse very easily with the cell membrane.
  • the transfection is preferably carried out with human papillomaviruses (HPV, English, human papilloma virus), non-enveloped, double-stranded DNA viruses (dsDNA) of the family Papillomaviridae, which attack as epithelial cells epithelial cells of the skin and mucous membranes and trigger uncontrolled tumor-like growth in the infected cells can.
  • human papillomaviruses HPV, English, human papilloma virus
  • dsDNA double-stranded DNA viruses
  • Transfection of human gingival keratinocytes with the oncoproteins HPV E6 and E7 is particularly preferred.
  • the HPV-associated oncoproteins E6 and E7 of the HPV 16 virus cause viral replication in differentiated cells, in particular E7 is able to decouple processes of differentiation and proliferation.
  • the plasmid pLXSN-16E6E7 which expresses nucleic acid to HPV E6 / E7 and the corresponding proteins, is used e.g. 2 ⁇ g of purified plasmid pLXSN-16E6E7.
  • suitable transfection lipids are used, e.g. Lipofectamine PiI TM from Invitrogen used according to the manufacturer.
  • Selection of the transfected cells is e.g. by adding 400 ⁇ g of geneticin (Invitrogen company) per ml of medium 24 h after transfection. Transfection and selection are carried out in serum-free medium, e.g. (DMEM: Ham's F12 3: 1).
  • the plasmid pLXSN-16E6E7 which codes for HPV E6 / E7, is disclosed, for example, in Caledira et al., J Virol 2003. Preparation and amplification of the plasmid pLXSN-16E6E7 is carried out there and in Tommasino M, et. al., Hum Mutat. 21 (3) 307-312, described method. Standard protocols of molecular biology are taken from Sambrook et al., 1989. The cleaning is carried out with a filter such as the commercially available recombinant DNA QIAfilter Plasmid Maxi Kit according to the manufacturer (here Qiagen). Transfection generates an immortalized keratinocyte gingival cell line that combines the capacity for unlimited reproduction and differentiation and has all the characteristics of the primary cells.
  • This immortalized human gingival keratinocyte cell line has hitherto been cultured in over 100-500 passages and used in cell culture systems without losing the original characteristics of the primary cell line.
  • the cells preferably grow to confluence, are detached by standard trypsinization protocol (for example with 0.05% trypsin-EDTA from Gibco-BRL) and distributed into several cell culture vessels, where they in turn continue to grow to confluency.
  • trypsinization protocol for example with 0.05% trypsin-EDTA from Gibco-BRL
  • the experiments to detect the effect of potentially protective or modifying substances are performed in parallel with the immortalized, as well as the primary human gingival keratinocyte cell line.
  • the cells After reaching confluency, the cells are transferred to a standard trypsinization protocol (eg with 0.05% trypsin-EDTA from Gibco-BRL) into several eg 25 cm 2 cell culture vessels (eg cell culture bottles, Greiner) and are available in multiple forms Cell culture system for parallel experimental series for testing potentially protective and / or modifying agents available.
  • a standard trypsinization protocol eg with 0.05% trypsin-EDTA from Gibco-BRL
  • cell culture vessels eg cell culture bottles, Greiner
  • various concentrations of potentially protective and / or modifying agents such as anti-infective agents, oral care products, oral antiseptics, topical drugs and other medical devices added and their effect on various analytical Levels examined and compared with appropriate control samples.
  • the analysis is carried out at the level of protein expression, in Western blot, in immunostaining, in immunofluorescence, as a flow cytometric analysis or by measurement of transepithelial resistance.
  • the cells of the cell culture system are for this purpose with at least one of the human-living germs, which the person skilled in the art knows as causing disease, such as gram positive and negative bacteria or viruses, e.g. Actinobacillus acinomycetemcomitans, spirochetes, Porphyromonas gingivalis, Bacteroides forsythus, Prevotella intermedia, Eubacterium nodatum, Treponema denticola, Streptococcus intermedia, Prevotella negrens, Peptostreptococcus micros, Campylobacter rectus, Fusobacterium nucleatum, Eikenella corrodens, Selenomonas spe cies , Gram-negative enterococci, Pseudomonas species, staphylococci, cytomegalovirus, Epstein-Barr virus type 1, which are commercially available in pure culture and those of the cell culture from cells of the immortalized human gi- ging
  • the bacteria known as oral streptococci Streptococcus mutans and Streptococcus salivarius and Fusobacteria and Actinomycetes are used.
  • Porphyromonas gingivalis one of the major pathogens of infectious periodontal disease, is used.
  • the disease-causing germs occurring in the mouth are used alone or in different mixing combinations depending on the selection of the potentially protective and / or modifying agent, the disease to be investigated or the germ or germs.
  • the disease-causing germs occurring in the mouth are cultured in a suitable medium known to the person skilled in the art and provided, for example, by centrifugation and uptake of the cell pellet with medium in such a way that the cells are infected with a defined germ count.
  • the optimal number of germs to be used varies depending on the type of germ and must be determined in the simple infection approach beforehand, this procedure is familiar to the expert.
  • both the influence or the effect of the protective and / or modifying agents on the untreated, ie healthy, cells are measured, as well as the influence of these agents on cells which have been infected with at least one of the disease-causing germs occurring in the mouth.
  • the untreated cells and the infected cells each form their own parallel cell culture system.
  • the untreated cells or the cells of the immortalized human gingival keratinocyte cell lines infected with at least one of the pathogenic disease-causing germs preferably grow up to 70% confluence.
  • dilutions of the protective and / or modifying agents are added. Alternatively, this also takes place within the framework of a kinetics, so that the influence on the growth of the cells is taken into account. All cells are gently washed twice with ice-cold PBS and e.g. harvested by scraping, then centrifuged, e.g. for 5 min at 800g.
  • the cell pellets are preferably resuspended in 1 ml of NETN buffer (20 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5% NP-40, pH 8) and incubated for 10 min at room temperature.
  • the cells are lysed, for example, by successive freezing and thawing.
  • the protective and / or modifying agent is added first, followed by infection with at least one of the pathogenic germs found in the mouth to see if successful infection can be prevented.
  • the detection of the commercially available mouse monoclonal anti-HPV16-E7 antibody and thus the cells from the immortalized human gingival keratinocyte cell line in the cell culture system is carried out with a second commercially available antibody which is coupled with a suitable marker enzyme such as peroxidase (HRP-coupIed anti-mouse, Amersham Biosciences) and detectable by ECL reagent (Amersham Biosciences) according to the manufacturer's instructions.
  • a suitable marker enzyme such as peroxidase (HRP-coupIed anti-mouse, Amersham Biosciences) and detectable by ECL reagent (Amersham Biosciences) according to the manufacturer's instructions.
  • This immunoblot analysis examines the effect of potentially protective and / or modifying agents such as anti-infective agents, oral care products, oral antiseptics, topical drugs and other medical devices added to the cell culture system of immortalized human gingival keratinocyte cell lines.
  • the analysis preferably takes place on cells which have been infected with at least one of the pathogenic germs occurring in the mouth before or during the addition of the potentially protective and / or modifying agents.
  • the effect of potentially protective and / or modifying agents such as anti-infective agents, oral care products, oral antiseptics, topical drugs and other medical devices added to the cell culture system from healthy or infected cells is also monitored by immunostaining and / or immunofluorescence.
  • the cells of the immortalized human gingival keratinocyte cell lines are seeded on slides and incubated for 2 days. During this time, alternatively after or during infection with at least one of the pathogenic germs occurring in the mouth, the agents to be tested are added in different concentration series.
  • the cells of the immortalized human gingival keratinocyte cell lines are seeded on Transwell CoI filter inserts (eg 3.25 ⁇ 10 5 cells / insert) in a 24-well plate (eg from Corning Costar) and after or during infection with added to at least one of the disease-causing germs occurring in the mouth in different concentration series.
  • Transwell CoI filter inserts eg 3.25 ⁇ 10 5 cells / insert
  • the cells are fixed, for example, with methanol for 30 min and embedded with a standard embedding medium according to standard protocol and frozen. The cells are then removed from the wells and cryosections are made according to standard procedures.
  • the influence of potentially protective and / or modifying agents is alternatively or additionally detected by changes in the Zeil-Zeil dressing.
  • tight junction Proteins such as claudins and occludin, for example, immunologically detected.
  • Intact Zeil-Zeil bandages show a grid-like pattern using immunological labeling of Claudins or Occludin. Under the influence of at least one of the disease-causing germs occurring in the mouth, a dissolution of this lattice structure occurs.
  • the beneficial effect of potentially protective and / or modifying agents, such as anti-infective agents, oral care products, oral antiseptics, topical drugs, and other medical devices, presented to the cell culture system from immortalized human keratinocyte gingival cell lines before, during or after infection with at least one of the in the mouth occurring disease-causing germs are shown in the preservation of the lattice structure.
  • the evaluation of the representation of the cell structure is preferably carried out with a confocal laser scanning microscope. Among other things, this opens up the possibility of screening a tissue association through all layers. This method gives a good insight into the structure of the cell structure and shows very sensitively changes by the action of at least one of the disease-causing germs occurring in the mouth and potentially protective and / or modifying agents.
  • the histological analysis of the effect of potentially protective and / or modifying agents on the cells of the immortalized human gingival keratinocyte cell lines in the cell culture system under the influence of at least one of the pathogenic germs occurring in the mouth is carried out by detecting the cytokeratin in the immunofluorescence of the cryosections.
  • commercially available antibodies are used eg against cytokeratin 2 and pan-CK (eg from dianova) and as second antibody fluorescence-labeled antibodies eg FITC-conjugated goat anti-rabbit IgG (eg from Dako).
  • the cells of the immortalized human gingival keratinocyte cell lines are fixed and permeabilized with 90% cold methanol for 30 min. The cells are washed and blocked, for example blocked with 5% goat serum (eg from Biotrend). The antibodies are incubated for, for example, 60 minutes at room temperature. After washing twice, the fluorescently labeled antibody is incubated for an additional 60 minutes at room temperature.
  • the cytokeratin pattern of the cells of the immortalized human gingival keratinocyte cell lines before, during or after infection with at least one of the disease-causing germs occurring in the mouth, each in the presence of potential protective agents, is evaluated according to a method known to the person skilled in the art.
  • the cytokerating groups CK2 and CK10 are markers for differentiation of the cells and, for example, the cytokeratin groups CK17, CK18, CK19) can typically be detected in undifferentiated or proliferating cells.
  • Flow cytometric analysis of the cells of the immortalized human gingival keratinocyte cell lines before, during or after infection with at least one of the oropharyngeal germs each in the presence of potentially protective and / or modifying agents is carried out with primary antibodies against Pan-CK, CK 19 and a negative control (eg from the company Dianova), with CK 2 (eg the company abcam), involucrin and filaggrin (eg the company NeoMarkers) and CK 10 (eg the company Cymbus).
  • the cells of the immortalized human gingival keratinocyte cell lines are washed with 10 ml medium, at 1500 rpm for 5 min and fixed preferably with 1, 5% paraformaldehyde in PBS pH 7.2 for 10 min.
  • the cells are fugal centric and permeabilized with cold 90% methanol and frozen for the immune reaction, the cells were washed twice with staining buffer (PBS with 2% FCS and 0.02% Na-azide) are washed in 100 and at -20 0 C. ⁇ l of staining buffer is resuspended. The cells are sonicated for 20 sec to disintegrate cell conglomerates. The primary antibody is incubated for 50 minutes at room temperature. Preferably, the cytokeratin antibody reactions are detected by immunofluorescence. After washing twice, the second antibody is incubated for 50 min at 4 ° C. For this purpose, an antibody coupled with fluorescent dye, for example anti-mouse IgG FITC from Dako, is used.
  • fluorescent dye for example anti-mouse IgG FITC from Dako
  • Flow cytometry shows various stages of differentiation or change of cell surface properties after addition of anti-infective agents, oral care products, oral antiseptics, topical drugs and other medical devices added to the cell culture system of immortalized human gingival keratinocyte cell lines.
  • the analysis is carried out, e.g. by determining the expression of surface markers, such as Toll-Iike receptors. Due to bacterial infection, these surface markers show enhanced or attenuated expression.
  • the effect of potentially protective and / or modifying agents before, during or after infection of the cells with at least one of the pathogenic germs occurring in the mouth is detected by measuring the expression rate of these surface markers. It will be apparent to those skilled in the art that the applications are extremely diverse and the effect of potentially protective and / or modifying agents can be extended to many surface markers and intracellular patterns depending on the particular problem.
  • the cells of the immortalized human gingival keratinocyte cell lines surprisingly exhibit a gingival epithelial barrier function and a transepithelial resistance is formed.
  • the cells of the immortalized human gingival keratinocyte cell lines are seeded on TranswellColl inserts, for example at 3.25 ⁇ 10 5 cells per insert.
  • the induction of differentiation occurs after 24 h by addition of medium eg DMEM (should contain 1, 8mM calcium) plus Ham ' s F12, Hepes buffer and penicillin / streptomycin as basal substances and 10% FCS.
  • the cells remain on the inserts for another 24 hours.
  • Transepithelial electrical resistance is measured using the Millicell ERS system from Millipore. Each insert is measured eg on three different sides and preferably the mean value is calculated. The confluence of the cell layer is alternatively controlled by light microscopy. Transepithelial resistance is affected by the addition of anti-infective agents, oral care products, oral antiseptics, topical drugs and other medical devices, as measured in the cell culture system from immortalized human gingival keratinocyte cell lines.
  • the transepithelial resistance TEER is demonstrably altered in the presence of at least one of the disease-causing germs occurring in the mouth.
  • the addition of Porphyromonas gingivalis one of the major pathogens of infectious periodontal disease, destroys the TEER of immortalized human gingival keratinocyte cells within hours, depending on the number of germs.
  • the addition of chlorhexidine which is widely used in periodontal treatment, preferably during infection, increases the transepithelial resistance in a concentration-dependent manner and thus protects the immortalized human gingival keratinocyte cells as a protective agent. This makes chlorhexidine a suitable reference substance.
  • the cells of the immortalized human gingival keratinocyte cell line are grown, transferred to cell culture flasks and seeded on TranswellColl TM inserts, for example at 3.25 ⁇ 10 5 cells per insert.
  • the induction of differentiation takes place after 24 h by addition of medium, for example, DMEM (1 to, 8 mM calcium included) plus Ham's F12, Hepes buffer, and penicillin / streptomycin as basal substances and 10% FCS.
  • the cells remain on the inserts for another 24 hours.
  • the number of inserts depends on the number or dilution series of the potentially protective and / or modifying agents to be tested; this is known to the person skilled in the art; alternatively, it can also carry out any approach as duplicates.
  • a dilution series of chlorhexidine is used as the potential protective and / or modifying agent to be tested: 0.01%, 0.001%, 0.0001% and 0.00001% in medium.
  • Any further potentially protective and / or modifying agent is appropriately diluted and added to the cell culture system. Water-soluble substances are preferably diluted in the appropriate cell culture medium.
  • Porphyromonas gingivalis is added and the modifications of the TEER are measured.
  • Porphyromonas gingivalis is grown in medium and centrifuged. The pellet is diluted in the cell culture medium so that the germ count of 10 10 / ml is achieved.
  • the TEER value at time zero is recorded before the addition of the potentially protective and / or modifying agent as the starting value.
  • the potentially protective and / or modifying agent in different dilution stages of the TEER is as temporal kinetics, eg 2h, 4h. 6h, 8h, 12h, 24h and 48h after addition of the potentially protective and / or modifying agent.
  • the change in the TEER value is displayed as a statistical analysis.
  • the cell supernatants are removed and methods known to those skilled in the art such as ELISA or Cytometric Bead Array, a method for quantitative flow cytometric detection of soluble antigens on color-coded, antibody-coupled particles, the content of secreted proteins such as pro - or anti-inflammatory cytokines, growth factors, etc. determined and compared with positive or negative reference samples.
  • ELISA ELISA
  • Cytometric Bead Array a method for quantitative flow cytometric detection of soluble antigens on color-coded, antibody-coupled particles, the content of secreted proteins such as pro - or anti-inflammatory cytokines, growth factors, etc.
  • FIG. 1 Development of the transepithelial resistance TEER after induction of differentiation in three clones of immortalized gingival human keratinocytes.
  • the control consists of inserts without cells.
  • FIG. 2 Development of the transepithelial resistance of immortalized keratinocytes after addition of Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 in a concentration of 10 10 germs / ml.
  • the control shows keratinocytes without bacteria.
  • Apical + basolateral germs are applied from both sides.
  • Fig. 3 Development of the TEER after addition of chlorhexidine (CHX) in various concentrations.
  • CHX chlorhexidine
  • the control shows keratinocytes in medium without CHX.
  • the concentration of 0.01% CHX leads to a rapid deterioration of the TEER after 2 h.
  • the concentration of 0.001% CHX leads to a stable increase in the TEER. This effect weakens in the higher dilutions of CHX.
  • the cells are located on the membranes in the inserts, which are placed in the wells of the cell culture dish. Apical is the cell supernatant on the cells, basolateral is the cell protrusion that surrounds the cells from below and the side. Between these two compartments develops the transepithelial resistance, which is measured by means of an electrode.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine immortalisierte Keratinozyten-Zelllinie aus der Gingiva und ein Zellkultursystem in dem die Zelllinie eingesetzt wird, um die Wirkung von protektiven und/oder modifizierenden Substanzen (z.B. Antiinfektiva, Mundpflegeprodukte) auf die epitheliale Funktion der Gingiva/des Peridontium in vitro zu testen. Die Zellen werden mit Keimen des Mundraumes infiziert und die Wirkung der potentiell protektiven und/oder modifizierenden Substanzen auf die Zellen z.B. durch Veränderung des transepithelialen Widerstandes (TEER) gemessen. Die Erfindung ersetzt damit Tierexperimente und erlaubt eine Analyse im High through put.

Description

Patentanmeldung
Immortalisierte Keratinozyten-Zelllinie und Verfahren zur Messung von protektiven Mitteln
Die vorliegende Erfindung betrifft eine immortalisierte Keratinozyten-Zelllinie und ein Testverfahren, in dem die Zelllinie genutzt wird, um die Wirkung von protektiven und/oder modifizierenden Substanzen (z.B. Antiinfektiva, Mundpflegeprodukte) auf die epitheliale Funktion der Gingiva/des Peridontium in vitro zu testen.
Beschreibung und Einleitung des allgemeinen Gebietes der Erfindung
Die Erfindung betrifft das allgemeine Gebiet der Parodontologie, dabei im besonderen eine Zelllinie aus dem epithelialen Bestandteil des Zahnhalteapparates, Zahnfleisch oder Gingiva/Peridontium genannt. Histologisch besteht die Gingiva aus einem mehrschichtigen Plattenepithel mit nur wenigen Hornschichten. Da kei- ne Subkutis (Unterhaut) vorhanden ist, ist das Zahnfleisch nicht verschiebbar und kann nicht nachgebildet werden.
Im Bereich der Parodontologie ist die Aufklärung der Mechanismen bakterieller Einflüsse auf den Verlauf parodontaler Erkrankungen von großer Bedeutung. Im Zuge dessen sollen potentiell protektive und/oder modifizierende Mittel (z.B. Antiinfektiva, Mundpflegeprodukte, orale Antiseptika, topisch wirkende Arzneimittel und Medizinprodukte) in einem geeigneten System auf ihre Wirksamkeit hin getestet werden. Ein solches kommerzielles Mittel ist beispielsweise Chlorhexidin. Es besteht dabei allgemein der Wunsch, die Verwendung von lebenden Tieren in solchen Experimenten zu reduzieren bzw. in vivo Experimente ganz zu ersetzen und ein geeignetes in-vitro System zu entwickeln.
Allerdings ist es bislang nicht gelungen geeignete Zelllinien und Zellkulturen von diesen speziellen Zelltypen der Gingiva zu generieren und so aufzubauen, dass bakterielle, toxische oder auch immunologische Stimuli eine Wirkung entfalten können, die mit der in vivo Wirkung vergleichbar ist. Es besteht daher der dringende Bedarf an geeigneten Zelllinien der Gingiva und Zellkultursystemen, um in großen Probendurchsätzen die im Mundbereich vorkommenden Zelltypen auf Ihre Reaktionsfähigkeit gegenüber potentiell protektiven und/oder modifizierenden Mitteln zu untersuchen und die Wirksamkeit auf im Mund vorkommende Keime nachzuweisen.
Aufgabe
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, geeignete Zelllinien aus Zellen der Gingiva bereitzustellen und ein Zellkultursystem, mit dem in großen Probendurch- Sätzen bakterielle, toxische und/oder immunologische Stimuli untersucht sowie protektive und/oder modifizierende Substanzen auf ihre Wirkung hin getestet werden können.
Lösung der Aufgabe
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch eine immortalisierte gingivale Keratinozyten-Zelllinie gemäß Anspruch 1 und ein Zellkultursystem gemäß der nachfolgenden Ansprüche.
Die Erfindung basiert auf eigenen wissenschaftlichen Untersuchungen zur epithelialen Funktion der Gingiva/des Peridontium in vitro. Dabei wurden Primärzellkultu- ren aus gingivalem Gewebe herangezogen, welche allerdings nur eine sehr begrenzte Lebensdauer besitzen. Für einen Durchlauf von Experimenten müssen parallel verschiedene Primärzellkulturen angelegt werden, welche den jeweiligen individuellen Unterschieden unterliegen und eine hohe Fehlerrate in der Analyse verursachen. Ausgehend von diesen Primärzellkulturen gelang es eine immortalisierte gingivale Keratinozyten-Zelllinie zu erzeugen, die überraschenderweise zahlreiche positive Eigenschaften vereint, die mit denen von primären Keratinocyten absolut vergleichbar sind. Vorteilhafterweise weist die immortalisierte gingivale Keratinozyten-Zelllinie eine stabile Expression von Zytokeratinen und die Ausbildung eines trans-epithelialen Widerstandes auf, sie sezemiert Entzündungsmediatoren, weist aber im Gegensatz zu primären Zellen vorteilhafterweise zusätzlich die Fähigkeit zur unbegrenzten Reproduktion auf. Die Kultivierung der Zellen der immortalisierten gingivalen Keratinozyten-Zelllinie erfolgt auch auf TranswellCol Inserts, was zur Ausbildung einer Epithel-ähnlichen Zellschichtung führt. So können weiterhin systematisch funktionelle Charakteristika wie z.B. der transepitheliale Widerstand (TEER) er- fasst werden. Ebenso wird die sekretorische Leistung der Zellen messbar, die aufgrund der Anordnung der Zellen in sogenannten Inserts, auch die Sekretionsrichtung berücksichtigt.
Die Erfindung umfasst ein Verfahren, zur Herstellung der immortalisierten gingiva- len Keratinozyten-Zelllinie aus Gewebematerial und die Kultivierung in Zellkultursystemen, die für zahlreiche wissenschaftlich und wirtschaftlich interessante Un- tersuchungen und Applikationen zur Verfügung stehen.
Somit wird erstmals ein stabiles System von Zellen einer immortalisierten gingiva- len Keratinozyten-Zelllinie mit gleichbleibenden Eigenschaften für eine Vielzahl von parallelen Versuchsreihen und Fragestellungen bereitgestellt, z.B. zur Reakti- on der gingivalen Epithelzellen auf bakterielle, toxische und/oder immunologische Stimuli, auf protektive und/oder modifizierende Substanzen.
Die protektive und/oder modifizierende Wirkung richtet sich vor allem auf die verschiedenen im Mund des Menschen lebenden Keime, die krankheitsverursachend sind, wie gram positive und negative Bakterien oder Viren z.B. Actinobacillus acti- nomycetemcomitans, Spirochäten, Porphyromonas gingivalis, Bacteroides for- sythus, Prevotella intermedia, Eubacterium nodatum, Treponema denticola, Streptococcus intermedia, Prevotella negrens, Peptostreptococcus micros, Campylo- bacter rectus, Fusobacterium nucleatum, Eikenella corrodens, Selenomonas spe- cies, Gram-negative Enterokokken, Pseudomonas species, Staphylokokken, Cy- tomegalievirus, Epstein-Barr-Virus Typ 1. Einige der Bakterien u.a. Oralstreptokokken, wie Streptococcus mutans und Streptococcus salivarius verursachen vor allem Karies, können aber auch über Verletzungen in den Körperkreislauf eindringen und zu Blutvergiftung (Sepsis), Abszessen in Hals, Lunge und Leber führen oder sogar Herzklappenentzündungen auslösen.
In den letzten Jahren ist bekannt geworden, daß z.B. die Zahnerkrankung Paro- dontitis möglicherweise ein unabhängiger Herzinfakt- und Aploplexie-Risikofaktor ist. Außerdem besteht bei Schwangeren die Gefahr einer Frühgeburt. In Atheromen von Koronaratherien wurden pathogene Parodontitiskeime gefunden worden. Die Lipopolysaccharide, die von den Keimen freigesetzt werden, regen Makrophagen an, Zytokine und andere Botenstoffe wie etwa IL1-, Prostaglandin E und TNF- alpha zu bilden. Die Beseitigung von krankheitsverursachenden Keimen des Mundraumes durch tatsächlich protektive und/oder modifizierende Mittel ist daher nicht nur für die Zahngesundheit sondern für den Gesamtorganismus von Bedeutung. Das erfindungsgemäße Zellkultursystem trägt dazu bei, dass routinemäßige Tests zur Analyse von potentiell protektiven und/oder modifizierenden Mitteln durchführbar sind und tatsächlich protektive und/oder modifizierende Mittel identifiziert werden, sowie Nebenwirkungen dieser Mittel z.B. durch Messung der Ent- Zündungsmediatoren ermittelt werden.
Das erfindungsgemäße Zellkultursystem wird als Ersatz von Tierexperimenten verwendet, da es Eigenschaften besitzt, die der in situ Situation eines gingivalen epithelialen Verbandes entsprechen. Gleichzeitig kann aufgrund der Immortalisie- rung die Stabilität des Testsystems auch bei einer Anzahl von 100-500 Testläufen gewährleistet werden. Somit werden die Möglichkeiten der Vergleichbarkeit und Reproduzierbarkeit in umfassenden Versuchsreihen zur Analyse von potentiell protektiven und/oder modifizierenden Mitteln entscheidend erweitert.
Unter dem Begriff „Transfektion" wird ein Verfahren verstanden, das dazu geeig- net ist, Nukleinsäure-Moleküle in die Zellen einzubringen. Bekannte Verfahren sind u.a. Elektroporation, Kalzium-Phosphat-Methode, Lipofektion.
Unter dem Begriff „primäre Zellen" werden Zellen verstanden, die direkt aus dem Gewebe eines Organismus entnommen und in Kultur erhalten werden. Die Le- benszeit der primären Zellen ist begrenzt.
Unter dem Begriff „immortalisierte Zellen" werden Zellen verstanden, die genetisch so verändert sind, dass sie sich unter geeigneten Kulturbedingungen dauerhaft in Zellkultur weiterteilen. Ausführungsbeispiele
1. Herstellung einer primären humanen gingivalen Keratinocyten-Zelllinie
Zur Herstellung einer immortalisierten humanen gingivalen Keratinocyten-Zelllinie wird zunächst eine primäre humane gingivale Keratinocyten-Zelllinie angelegt. Ausgangsmaterial dazu sind Biopsien (ca. 5 mm Durchmesser) der buccalen Gin- giva der distalen Region vom unteren Joch eines Menschen. Das Gewebe wird gesammelt und in sterilem Medium (z.B. DMEM, Life-Technologies) gelagert, das vorzugsweise 10% FCS und vorzugsweise 100 Penicillin/Streptomycin pro ml Medium enthält. Das Gewebe wird gründlich gewaschen mit z.B. PBS das vorzugsweise 100 U Penicillin; 0,1 mg Streptomycin und das vorzugsweise 0,25 μg Amphotericin B pro ml Medium enthält. Das Gewebe wird in schmale Stücke geschnitten z.B. 2 - 4 mm2) und in geeignete Gewebekulturgefäße überführt (z.B. 10 cm2 Zellkultur dishes Firma Greiner) und mit Serum-freiem Medium (z.B. DMEM:Ham's F12; Life-Technologies) versetzt.
Nach 8-14 Wachstumstagen bei 37°C, 5% CO2 und 93% Luftfeuchte werden die Zellen nach Standard-Trypsinisierungsprotokoll (z.B. mit 0,05% Trypsin-EDTA der Firma Gibco-BRL) als Einzelzellsuspension für Passage 2 in Zellkulturflaschen überführt (z.B. in 75cm2 Flaschen der Firma Greiner).
Dem Fachmann ist ersichtlich, dass das Ausgangsmaterial auch aus Biopsien von weiteren Organismen, die eine Gingiva aufweisen, wie z.B. Säuger, Hund, Katze und Pferd stammen kann und die immortalisierte gingivale Keratinocyten-Zelllinie auch diese Spezies umfasst.
2. Transfektion der primären humanen gingivalen Keratinocyten
Die primären humanen gingivalen Keratinocyten in Passage 2 aus Schritt 1 werden gezählt und z.B. 0,8 Zellen pro well in eine 96 well Mikrotiterplatte ausgesät. Dies kann alternativ mikroskopisch kontrolliert werden.
Genetisches Material wird allgemein mit Hilfe von Transfektionslipiden, Vesikeln, die sehr leicht mit der Zellmembran fusionieren, in die Zelle eingebracht. Die Transfektion erfolgt vorzugsweise mit humanen Papillomaviren (HPV, engl, human papilloma virus), unbehüllte, doppelsträngige DNA-Viren (dsDNA) der Familie Papillomaviridae, die als natürlichen Wirt Epithelzellen der Haut und Schleimhäute befallen und bei den infizierten Zellen ein unkontrolliertes tumorartiges Wachstum auslösen können.
Besonders bevorzugt erfolgt die Transfektion von humanen gingivalen Keratinozy- ten mit den Onkoproteinen HPV E6 und E7. Die HPV-assoziierten Onkoproteine E6 und E7 des HPV 16 Virus bewirken in differenzierten Zellen eine Virusreplika- tion, besonders E7 ist in der Lage, Vorgänge der Differenzierung und der Proliferation zu entkoppeln.
Zur Transfektion wird erfindungsgemäß das Plasmid pLXSN-16E6E7, das Nuk- leinsäure zu HPV E6/E7 und die entsprechenden Proteine exprimiert, verwendet z.B. 2 μg gereinigtes Plasmid pLXSN-16E6E7. Zur Erhöhung der Transfektionsef- fizienz werden geeignete Transfektionslipide z.B. LipofectaminPIus™ der Firma Invitrogen nach Herstellerangaben verwendet. Die Selektion der transfizierten Zellen erfolgt z.B. durch Zugabe von 400 μg Geneticin (Firma Invitrogen) pro ml Me- dium 24h nach Transfektion. Die Transfektion und Selektion erfolgt in Serumfreiem Medium z.B. (DMEM:Ham's F12 3:1).
Das Plasmid pLXSN-16E6E7, das für HPV E6/E7 kodiert ist beispielsweise in CaI- deira et al., J Virol 2003 offenbart. Präparation und Amplifikation des Plasmid pLXSN-16E6E7 erfolgt nach dem dort und in Tommasino M, et. al., Hum Mutat. 21 (3) 307-312, beschriebenen Verfahrens. Standardprotokolle der Molekularbiologie werden Sambrook et al., 1989 entnommen. Die Reinigung erfolgt mit einem Filter z.B. dem kommerziell erhältlichen rekombinanten DNA QIAfilter Plasmid Maxi Kit nach Herstellerangaben (hier Qiagen). Mit der Transfektion wird eine immortalisierte gingivale Keratinocyten-Zelllinie generiert, die die Fähigkeit zur unbegrenzten Reproduktion und zur Differenzierung vereint und alle entsprechenden Eigenschaften der Primärzellen aufweist.
Diese immortalisierte humane gingivale Keratinocyten-Zelllinie wird bisher in über 100-500 Passagen kultiviert und in Zellkultursystemen verwendet, ohne die ursprünglichen Eigenschaften der primären Zelllinie zu verlieren. Dabei wachsen die Zellen jeweils vorzugsweise bis zur Konfluenz, werden nach Standard-Trypsinisierungsprotokoll (z.B. mit 0,05% Trypsin-EDTA der Firma Gib- co-BRL) losgelöst und in mehrere Zellkulturgefäße verteilt, wo sie wiederum bis zur Konfluenz weiterwachsen. So ist es möglich ausgehend aus einer humanen gingivalen Keratinocyten-Zelllinie eine Vielzahl von identischen Zellkultursystemen anzulegen, die für große Probendurchsätze zur Testung von potentiell protektiven oder modifizierenden Mitteln (z.B. Antiinfektiva, Mundpflegeprodukte, orale Anti- septika, topisch wirkende Arzneimittel und Medizinprodukte) auf ihre Wirksamkeit hin getestet werden.
Alternativ werden die Experimente zum Nachweis der Wirkung von potentiell protektiven oder modifizierenden Substanzen parallel mit der immortalisierten, sowie auch der primären humanen gingivalen Keratinocyten-Zelllinie durchgeführt.
3. Anlegen von Zellkultursystemen mit der immortalisierten humanen gingivalen Keratinocyten-Zelllinie
Nach Erreichen der Konfluenz werden die Zellen nach Standard-Trypsin- isierungsprotokoll (z.B. mit 0,05% Trypsin-EDTA der Firma Gibco-BRL) in mehrere z.B. 25cm2 Zellkulturgefäße (z.B. Zellkulturflaschen, Fa. Greiner) überführt und stehen in multipler Form als Zellkultursystem für parallele Versuchsserien zur Testung von potentiell protektiven und/oder modifizierenden Mitteln zur Verfügung. Dabei wird dem Zellkultursystem aus immortalisierten humanen gingivalen Kerati- nocyten-Zelllinien in einfachen oder multiplen Ansätzen verschiedene Konzentrationen an potentiell protektiven und/oder modifizierenden Mitteln, wie Antiinfektiva, Mundpflegeprodukten, oralen Antiseptika, topisch wirkende Arzneimittel und andere Medizinprodukten zugesetzt und deren Wirkung auf verschiedenen analytischen Ebenen untersucht und mit entsprechenden Kontrollproben verglichen. Beispielsweise erfolgt die Analyse auf Ebene der Proteinexpression, im Westernblot, im Immunostaining, in der Immunfluoreszenz, als durchflußzyto- metrische Analyse oder durch Messung des transepithelialen Widerstandes.
Die Zellen des Zellkultursystem werden dazu mit mindestens einem der im Mund des Menschen lebenden Keime, die der Fachmann als krankheitsverursachend kennt, wie gram positive und negative Bakterien oder Viren z.B. Actinobacillus ac- tinomycetemcomitans, Spirochäten, Porphyromonas gingivalis, Bacteroides for- sythus, Prevotella intermedia, Eubacterium nodatum, Treponema denticola, Strep- tococcus intermedia, Prevotella negrens, Peptostreptococcus micros, Campylo- bacter rectus, Fusobacterium nucleatum, Eikenella corrodens, Selenomonas spe- cies, Gram-negative Enterokokken, Pseudomonas species, Staphylokokken, Cy- tomegalievirus, Epstein-Barr-Virus Typ 1 infiziert, die in Reinkultur kommerziell erhältlich sind und die der Zellkultur aus Zellen der immortalisierten humanen gin- givalen Keratinocyten-Zelllinien z.B. mit dem Medium z.B. in verschiedenen Konzentrationen beigefügt werden. Alternativ werden die als Oralstreptokokken bezeichneten Bakterien Streptococcus mutans und Streptococcus salivarius sowie Fusobakterien und Actinomyceten eingesetzt. In einer bevorzugten Ausführungsform des Zellkultursystems wird Porphyromonas gingivalis, einer der Haupterreger von infektiösen parodontalen Erkrankungen verwendet.
Alternativ werden die im Mund vorkommenden krankheitsverursachenden Keime alleine oder in verschiedenen Mischkombinationen je nach Auswahl des potentiell protektiven und/oder modifizierenden Mittels, der zu untersuchenden Krankheit oder des bzw. der Keime eingesetzt.
Die im Mund vorkommenden krankheitsverursachenden Keime werden in einem dem Fachmann bekannten geeigneten Medium gezüchtet und z.B. durch Zentri- fugation und Aufnahme des Zellpellets mit Medium so bereitgestellt, dass die In- fektion der Zellen mit einer definierte Keimzahl erfolgt. Die zu verwendende optimale Keimzahl variiert je nach Art des Keims und muss im einfachen Infektionsansatz zuvor ermittelt werden, wobei dieses Vorgehen dem Fachmann geläufig ist. Im Zellkultursystem wird sowohl der Einfluss bzw. die Wirkung der protektiven und/oder modifizierenden Mittel auf die unbehandelten also gesunden Zellen gemessen, als auch der Einfluss dieser Mittel auf Zellen, die mit mindestens einem der im Mund vorkommenden krankheitsverursachenden Keime infiziert wurden. Dabei bilden die unbehandelten Zellen und die infizierten Zellen jeweils in eigenes parallel angesetztes Zellkultursystem.
4. Isolierung von Proteinextrakt
In parallelen Ansätzen wachsen die unbehandelten oder die mit mindestens ei- nem der im Mund vorkommenden krankheitsverursachenden Keimen infizierten Zellen der immortalisierten humanen gingivalen Keratinocyten-Zelllinien vorzugsweise bis zu 70% Konfluenz. In verschiedenen Konzentrationsstufen werden Verdünnungen der protektiven und/oder modifizierenden Mitteln zugesetzt. Dies erfolgt alternativ auch im Rahmen einer Kinetik, so dass der Einfluss auf das Wachstum der Zellen berücksichtigt wird. Alle Zellen werden vorsichtig zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen und z.B. durch abkratzen geerntet, danach zentri- fugiert z.B. für 5 min bei 800g. Die Zellpellets werden vorzugsweise in 1 ml NETN Puffer (20 mM Tris, 100 mM NaCI, 1 mM EDTA, 0.5% NP-40, pH 8) resuspendiert und für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen werden beispielsweise durch aufeinanderfolgendes Einfrieren und Auftauen lysiert.
Alternativ wird zuerst das protektive und/oder modifizierende Mittel zugesetzt und anschließend erfolgt die Infektion mit mindestens einem der im Mund vorkommenden krankheitsverursachenden Keime, um zu sehen, ob eine erfolgreiche Infektion verhindert werden kann.
5. Analyse des Zellkultursystem im Westernblot Analyse
Dem Fachmann ist die Durchführung der Westernblot Analyse bekannt. Dazu werden 10 μg der jeweiligen Proteinextrakte beispielsweise aus Ausführungsbeispiel 4 auf SDS-Page aufgetrennt und das Gel auf einer für Westernblot geeigneten Membran z.B. PVDF Membran (Immobilon-P, Millipore) aufgelegt. Die Membran wird z.B. für 2h bei Raumtemperatur in 5% Trockenmilch in PBS-T Puffer (123 mM NaCI, 17 mM , 2.5 mM , 0.1% (v/v) Tween 20, pH 7.5) geblockt und mit einem kommerziell erhältlichen Maus monoklonal anti-HPV16-E7 Antikörper inkubiert (Zymed, San Francisco, USA). Die Detektion des kommerziell erhältlichen Maus monoklonal anti-HPV16-E7 Antikörper und damit der Zellen aus der immortalisier- ten humanen gingivalen Keratinocyten-Zelllinie im Zellkultursystem erfolgt mit einem zweiten kommerziell erhältlichen Antikörper, der mit einem geeigneten Marker-Enzym z.B. Peroxidase gekoppelt ist (HRP-coupIed anti-mouse, Amersham Biosciences) und durch ECL Reagenz (Amersham Biosciences) nach Herstellerangaben nachweisbar ist.
Mit dieser Immunoblot-Analyse wird die Wirkung von potentiell protektiven und/oder modifizierenden Mitteln, wie Antiinfektiva, Mundpflegeprodukten, oralen Antiseptika, topisch wirkenden Arzneimittel und anderen Medizinprodukten, die dem Zellkultursystem aus immortalisierten humanen gingivalen Keratinocyten- Zelllinien zugesetzt werden, überprüft. Bevorzugt findet die Analyse an Zellen statt, die vor oder während der Zugabe der potentiell protektiven und/oder modifizierenden Mittel mit mindestens einem der im Mund vorkommenden krankheits- verursachenden Keime infiziert wurden.
So zeigt sich beispielsweise nach Infektion mit Bakterien und Zugabe von Antiinfektiva in der Immunoblot Analyse eine Veränderung der Proteinmusters. Während Proben aus Zellen nach Infektion mit mindestens einem Bakterium ohne Zu- satz von Mitteln ein typisches proteolytisches Muster mit mehreren Proteinbanden aufweisen, wird dieses Muster durch Zugabe von unterschiedlichen Konzentration an Antiinfektiva, Mundpflegeprodukten, oralen Antiseptika, topisch wirkenden Arzneimittel und anderen Medizinprodukten verändert und zeigt im günstigsten Fall keine Proteolyse mehr. Dies ist im Western Blot sehr gut darzustellen.
6. Analyse des Zellkultursystem mit Immunostaining/Immunfluoreszenz
Die Wirkung von potentiell protektiven und/oder modifizierenden Mitteln, wie An- tiinfektiva, Mundpflegeprodukten, oralen Antiseptika, topisch wirkenden Arzneimittel und anderen Medizinprodukten, die dem Zellkultursystem aus gesunden oder infizierten Zellen zugesetzt werden, wird auch durch Immunostaining und/oder Immunfluoreszenz überprüft. Dazu werden die Zellen der immortalisierten humanen gingivalen Keratinocyten- Zelllinien auf Objektträgern ausgesät und für 2 Tage inkubiert. Während dieser Zeit werden alternativ nach oder während Infektion mit mindestens einem der im Mund vorkommenden krankheitsverursachenden Keime die zu testenden Mittel in verschiedenen Konzentrationsreihen zugesetzt.
Alternativ werden die Zellen der immortalisierten humanen gingivalen Keratinocy- ten-Zelllinien auf Transwell CoI Filter inserts (z.B. 3,25x105 cell/insert) in einer 24 well Platte (z.B. der Firma Corning Costar) ausgesät und nach bzw. während In- fektion mit mindestens einem der im Mund vorkommenden krankheitsverursachenden Keime die zu testenden Mittel in verschiedenen Konzentrationsreihen zugesetzt. Nach beispielsweise 48h werden die Zellen fixiert, z.B. mit Methanol für 30 min und mit einem gängigen Einbettungsmedium nach Standardprotokoll eingebettet und eingefroren. Dann werden die Zellen aus den Vertiefungen entnom- men und es werden gemäß üblicher Standardverfahren Kryoschnitte hergestellt.
Die Wirkung von potentiell protektiven und/oder modifizierenden Mitteln, wie An- tiinfektiva, Mundpflegeprodukten, oralen Antiseptika, topisch wirkenden Arzneimittel und anderen Medizinprodukten, die dem Zellkultursystem aus immortalisierten humanen gingivalen Keratinocyten-Zelllinien zugesetzt wurden, wird durch mikroskopische Auswertung der Objektträger/Kryoschnitte gezeigt.
Es zeigen sich durch den Einfluss der potentiell protektiven und/oder modifizierenden Mitteln Änderungen des Differenzierungsverhaltens der Zellen, die über das Zytokeratinmuster immunlogisch bestimmt werden. Eine, auch in Gegenwart von mindestens einem der im Mund vorkommenden krankheitsverursachenden Keime, positive Wirkung der protektiven Mittel zeigt sich im Erhalt der Gitterstruktur des Zytokeratins. Eine negative oder fehlende Wirkung zeigt sich durch Veränderung oder Zerstörung der Zytokeratin-Gitterstruktur.
Der Einfluss der potentiell protektiven und/oder modifizierenden Mittel wird alternativ oder ergänzend auch durch Veränderungen im Zeil-Zeil Verband nachgewiesen. Dazu werden vor, während oder nach der Infektion mit mindestens einem der im Mund vorkommenden krankheitsverursachenden Keime Tight Junction Proteine wie Claudine und Occludin z.B. immunologisch nachgewiesen. Intakte Zeil-Zeil Verbände zeigen unter Verwendung von immunologischer Markierung von Claudinen oder Occludin ein gitternetzartiges Muster. Unter Einfluss von mindestens einem der im Mund vorkommenden krankheitsverursachenden Keime kommt es zu einer Auflösung dieser Gitterstruktur. Die positive Wirkung von potentiell protektiven und/oder modifizierenden Mitteln, wie Antiinfektiva, Mundpflegeprodukten, oralen Antiseptika, topisch wirkenden Arzneimittel und anderen Medizinprodukten, die dem Zellkultursystem aus immortalisierten humanen gingiva- len Keratinocyten-Zelllinien vor, während oder nach der Infektion mit mindestens einem der im Mund vorkommenden krankheitsverursachenden Keime zugesetzt wurden, zeigt sich im Erhalt der Gitterstruktur. Eine negative oder fehlende Wirkung in der Auflösung der Gitterstruktur. Die Auswertung der Darstellung des Zellverbandes erfolgt vorzugsweise mit einem konfokalen Laser Raster Mikroskop. Dies eröffnet unter anderen die Möglichkeit zur Rasterung eines Gewebsverban- des durch alle Schichten. Diese Methode gibt einen guten Einblick in den Aufbau des Zellverbandes und zeigt sehr sensitiv Veränderungen durch Einwirkung mindestens einem der im Mund vorkommenden krankheitsverursachenden Keime und potentiell protektiven und/oder modifizierenden Mitteln.
Die histologische Analyse der Wirkung von potentiell protektiven und/oder modifizierenden Mitteln auf die Zellen der immortalisierten humanen gingivalen Keratinocyten-Zelllinien im Zellkultursystem unter Einfluss mindestens einem der im Mund vorkommenden krankheitsverursachenden Keime erfolgt durch Nachweis des Cytokeratins in der Immunfluoreszenz der Kryoschnitte. Dazu werden kom- merziell erhältliche Antikörper z.B gegen Cytokeratin 2 und pan-CK (z.B. von Firma dianova ) und als zweiter Antikörper fluoreszenzmarkierte Antikörper z.B. FITC- conjugated Goat anti-Rabbit IgG (z.B. von der Firma Dako) verwendet. Zum Färben mit den Cytokeratin-Antikörpern werden die Zellen der immortalisierten humanen gingivalen Keratinocyten-Zelllinien fixiert und mit 90% kaltem Me- thanol für 30 min permeabilisiert. Die Zellen werden gewaschen und geblockt z.B. mit 5% goat serum (z.B.der Firma Biotrend) geblockt. Die Antikörper werden für beispielsweise 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach zweimaligem Waschen wird der fluoreszenzmarkierte Antikörper für weitere 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Das Zytokeratinmuster der Zellen der immortalisierten humanen gingivalen Kerati- nocyten-Zelllinien vor, während oder nach Infektion mit mindestens einem der im Mund vorkommenden krankheitsverursachenden Keime jeweils in Gegenwart von potentiellen protektiven Mitteln wird nach einem dem Fachmann bekannten Ver- fahren ausgewertet. Es ist bekannt, dass z.B. die Zytokeratingruppen CK2 und CK10 Marker für Differenzierung der Zellen sind und z.B. die Zytokeratingruppen CK17, CK18, CK19) typischerweise in undifferenzierten oder proliferierenden Zellen nachzuweisen sind.
7. Analyse des Zellkultursystem mit Durchflußzytometrie
Die durchflußzytometrische Analyse der Zellen der immortalisierten humanen gingivalen Keratinocyten-Zelllinien vor, während oder nach Infektion mit mindestens einem der im Mund vorkommenden krankheitsverursachenden Keim jeweils in Gegenwart potentiell protektiver und/oder modifizierender Mittel erfolgt mit primären Antikörpern gegen Pan-CK, CK 19 und mit einer Negativkontrolle (z.B. von der Firma Dianova), mit CK 2 (z.B. der Firma abcam), Involukrin und Filaggrin (z.B. der Firma NeoMarkers) und CK 10 (z.B. der Firma Cymbus). Die Zellen der immortalisierten humanen gingivalen Keratinocyten-Zelllinien wer- den mit 10 ml Medium gewaschen, bei 1500 rpm für 5 min und fixiert vorzugsweise mit 1 ,5 % Paraformaldehyd in PBS pH 7,2 für 10 min. Die Zellen werden zentri- fugiert und permeabilisiert mit kaltem 90% Methanol und eingefroren bei -200C. Für die Immunreaktion werden die Zellen zweimal mit Staining Puffer (PBS mit 2 % FCS und 0,02 % Na-azid) gewaschen und in 100 μl Staining Puffer resuspen- diert. Die Zellen werden 20 sec mit Ultraschall behandelt, um Zellkonglumerate zu desintegrieren. Der primäre Antikörper wird 50 min bei Raumtemperatur inkubiert. Vorzugsweise werden die Cytokeratin-Antikörper-Reaktionen mittels Immunfluoreszenz detektiert. Nach zweimaligem waschen wird der zweite Antikörper für 50 min bei 4°C inkubiert. Dazu wird ein mit Fluoreszenzfarbstoff gekoppelter Antikör- per, beispielsweise Anti-Mouse-lgG-FITC der Firma Dako eingesetzt.
Es folgen zwei Waschschritte, dann werden die Zellen in PBS resuspendiert und gefiltert z.B. mit einem 50 μm Filter der Firma DAKO. Die Analyse erfolgt mit einem Cyan ADP Flow Cytometer (Dako). Die Durchflußzytometrie zeigt z.B. verschiedene Differenzierungsstadien oder auch Änderung von Oberflächeneigenschaften der Zellen nach Zugabe von Antiin- fektiva, Mundpflegeprodukten, oralen Antiseptika, topisch wirkenden Arzneimittel und anderen Medizinprodukten, die dem Zellkultursystem aus immortalisierten 5 humanen gingivalen Keratinocyten-Zelllinien zugesetzt wurden.
Dabei erfolgt die Analyse z.B. durch Bestimmung der Expression von Oberflä- chenmarkern, wie beispielsweise Toll-Iike-Rezeptoren. Aufgrund der Infektion mit Bakterien weisen diese Oberflächenmarker eine verstärkte oder abgeschwächte Expression auf. Die Wirkung potentiell protektiver und/oder modifizierender Mittel0 vor, während oder nach der Infektion der Zellen mit mindestens einem der im Mund vorkommenden krankheitsverursachenden Keime wird durch Messung der Expressionsrate dieser Oberflächenmarker nachgewiesen. Dem Fachmann ist ersichtlich, dass die Anwendungsmöglichkeiten hierbei äußerst vielfältig sind und die Wirkung potentiell protektiver und/oder modifizierender Mittel auf zahlreiche5 Oberflächenmarker und intrazelluläre Muster je nach spezieller Fragestellung ausgeweitet werden kann.
8. Analyse des Zellkultursystem durch Messung des Transepithelialen Wi- o derstandes TEER
Die Zellen der immortalisierten humanen gingivalen Keratinocyten-Zelllinien weisen überraschenderweise eine gingivale epitheliale Barrierefunktion auf und es wird ein transepithelialen Widerstand ausbildet. Zur Analyse werden die Zellen der immortalisierten humanen gingivalen Keratino- 5 cyten-Zelllinien auf TranswellColl™ inserts z.B. mit 3,25x105 Zellen pro insert ausgesät. Die Induktion der Differenzierung erfolgt nach 24h durch Zugabe von Medium z.B. DMEM (soll 1 ,8mM Calcium enthalten) plus Ham's F12, Hepespuffer und Penicillin/Streptomycin als basale Substanzen und 10 % FCS. Die Zellen verbleiben für weitere 24h auf den Inserts. 0 Den Zellen werden in verschiedenen Konzentrationsstufen potentiell protektive und/oder modifizierende Mittel zugesetzt, dies erfolgt vor, während oder nach Infektion mit mindestens einem der im Mund vorkommenden krankheitsverursachenden Keime. Die Messung der transepithelialen elektrischen Resistenz (TEER) erfolgt mit dem Millicell ERS System der Firma Millipore. Jedes Insert wird z.B. an drei verschiedenen Seiten gemessen und vorzugsweise der Mittelwert kalkuliert. Die Konfluenz des Zelllayers wird alternativ durch Lichtmikroskopie kontrolliert. Der transepitheliale Widerstand wird durch Zugabe von Antiinfektiva, Mundpflegeprodukten, oralen Antiseptika, topisch wirkenden Arzneimittel und anderen Medizinprodukten beeinflusst, dies wird im Zellkultursystem aus immortalisierten humanen gingivalen Keratinocyten-Zelllinien gemessen. Der transepitheliale Widerstand TEER wird in Gegenwart von mindestens einem der im Mund vorkommenden krankheitsverursachenden Keime nachweisbar verändert. Beispielsweise zerstört die Zugabe von Porphyromonas gingivalis, einem der Haupterreger von infektiösen parodontalen Erkrankungen, den TEER der immortalisierten humanen gingivalen Keratinocyten-Zellen innerhalb von Stunden, abhängig von der Keimzahl. Die Zugabe von Chlorhexidin, welches breite Anwen- düng bei der Parodontitis-Behandlung findet, vorzugsweise während der Infektion erhöht den transepithelialen Widerstand konzentrationsabhängig und schützt so als protektives Mittel die immortalisierten humanen gingivalen Keratinocyten- Zellen. Damit eignet sich Chlorhexidin als positive Referenzsubstanz.
Zur Messung des transepithelialen Widerstandes werden die Zellen der immortalisierten humanen gingivalen Keratinocyten-Zelllinie angezüchtet, in Zellkulturflaschen überführt und auf TranswellColl™ inserts z.B. mit 3,25x105 Zellen pro Insert ausgesät. Die Induktion der Differenzierung erfolgt nach 24h durch Zugabe von Medium z.B. DMEM (soll 1 ,8mM Calcium enthalten) plus Harn 's F12, Hepespuffer und Penicillin/Streptomycin als basale Substanzen und 10 % FCS. Die Zellen verbleiben für weitere 24h auf den Inserts. Die Anzahl der Inserts hängt ab von der Zahl bzw. den Verdünnungsreihen der zu testenden potentiell protektiven und/oder modifizierenden Mittel, dies ist dem Fachmann bekannt, er kann alternativ auch jeden Ansatz als Duplikate durchführen. Beispielsweise wird als zu testendes potentiell protektives und/oder modifizierendes Mittel eine Verdünnungsreihe von Chlorhexidin angesetzt: 0,01%, 0,001%, 0,0001% und 0,00001% in Medium. Jedes weitere potentiell protektive und/oder modifizierende Mittel wird in entsprechender Weise verdünnt und dem Zellkultursystem zugefügt. Wasserlösliche Substanzen werden vorzugsweise im entsprechenden Zellkulturmedium verdünnt.
Beispielsweise wird als ein zu testender im Mund vorkommender krankheitsverursachender Keim Porphyromonas gingivalis zugefügt und die Modifikationen des TEER gemessen. Dazu wird Porphyromonas gingivalis in Medium gezüchtet und zentrifugiert. Das Pellet wird in dem Zellkulturmedium verdünnt, so dass die Keimzahl von 1010/ml erreicht wird. Dann wird z.B. der TEER-Wert zum Zeitpunkt Null vor Zugabe des potentiell protektiven und/oder modifizierenden Mittels als Ausgangswert erfasst. Mit Zugabe des potentiell protektiven und/oder modifizierenden Mittels in verschiedenen Verdünnungsstufen wird der TEER als zeitliche Kinetik, z.B. 2h, 4h. 6h, 8h, 12h, 24h und 48h nach Zugabe des potentiell protektiven und/oder modifizierenden Mittels gemessen. Die Änderung des TEER-Wert wird als statistische Analyse dargestellt.
9. Analyse des Zellkultursystem durch Messung der Sekretionsleistungen der Zellen Die Wirkung potentiell protektiver und/oder modifizierender Mittel auf Zellen der immortalisierten humanen gingivalen Keratinocyten-Zelllinien vor, während oder nach Infektion mit mindestens einem der im Mund vorkommender krankheitsverursachender Keime wird weiterhin durch Untersuchung von Sekretionsleistungen der Zellen analysiert. Dabei wird die sekretorische Leistung der Zellen bei Zugabe von mindestens einem der im Mund vorkommender krankheitsverursachender Keime und/oder Zugabe von potentiell protektiven und/oder modifizierenden Mitteln erfasst. So werden zu definierten Zeiten nach deren Zugabe die Zeilüberstände entnommen und mit dem Fachmann bekannten Methoden wie z.B. ELISA oder Cytometric Bead Array, ein Verfahren zur quantitativen durchflußzytometrischen Erfassung von löslichen Antigenen über farbmarkierte, Antikörper-gekoppelte Partikel, der Gehalt von sezernierten Proteinen wie z.B. pro- oder antiinflammatorische Zytokine, Wachstumsfaktoren usw. bestimmt und mit positiven bzw. negativen Referenzproben verglichen. Abbildungslegenden und Bezugszeichenliste
Fig. 1 : Entwicklung des transepithelialen Widerstandes TEER nach Induktion der Differenzierung bei drei Klonen von immortalisierten gingivalen humanen Kerati- nocyten. Die Kontrolle besteht aus Inserts ohne Zellen.
Fig. 2 : Entwicklung des transepithelialen Widerstandes immortalisierter Keratino- cyten nach Zugabe von Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 in einer Konzentration von 1010Keimen/ml. Die Kontrolle zeigt Keratinozyten ohne Bakterien. Api- kal: Keime werden nur von oben = apikal zugegeben. Basolateral: Keime werden nur von unten = basolateral zugegeben. Apikal + basolateral: Keime werden von beiden Seiten appliziert. Man sieht eine anfängliche Steigerung des TEER bei der apikalen Applikation, die in eine Zerstörung des TEER nach 12-24h mündet. Bei der basolateralen Applikation kommt es zu einer raschen Zerstörung des Wider- Standes nach 8-12h bzw. nach 4-6h bei der beidseitigen Applikation.
Fig. 3: Entwicklung des TEER nach Zugabe von Chlorhexidin (CHX) in verschiedenen Konzentrationen. Die Kontrolle zeigt Keratinocyten in Medium ohne CHX. Die Konzentration von 0,01 % CHX führt zu einer raschen Beeinträchtigung des TEER nach 2h. Die Konzentration von 0,001 % CHX führt zu einer stabilen Erhöhung des TEER. Dieser Effekt schwächt sich in den höheren Verdünnungen von CHX ab.
Fig. 4: Beispiel zum Aufbau des Zellkultursystems. Die Zellen befinden sich auf den Membranen in den Inserts, welche in die Vertiefungen der Zellkulturschale gelegt werden. Apikal ist der Zellüberstand auf den Zellen, basolateral ist der Zeilüberstand, der die Zellen von unten und der Seite umgibt. Zwischen diesen beiden Kompartimenten entwickelt sich der transepitheliale Widerstand, welcher mittels einer Elektrode gemessen wird.

Claims

Ansprüche
1. Immortalisierte gingivale Keratinocyten-Zelllinie dadurch gekennzeichnet dass die Zellen epitheliale Funktionen der Gingiva aufweisen, eine unbegrenzte Re- produzierbarkeit und Differenzierung zeigen.
2. Immortalisierte gingivale Keratinocyten-Zelllinie gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet dass die Zellen eine stabile Expression von Zytokeratinen, die Ausbildung eines transepithelialen Widerstandes, eine Epithel-ähnliche ZeII- Schichtung und sekretorische Leistungen aufweisen sowie Entzündungsmediatoren sezernieren.
3. Immortalisierte gingivale Keratinocyten-Zelllinie gemäß Anspruch 1 und 2 dadurch gekennzeichnet dass die Zellen humanen Ursprungs sind.
4. Immortalisierte gingivale Keratinocyten-Zelllinie gemäß der vorangegangenen Ansprüche dadurch gekennzeichnet dass die Zellen in einem Zellkultursystem auf TranswellCol kultiviert werden.
5. Immortalisierte gingivale Keratinocyten-Zelllinie gemäß der vorangegangenen Ansprüche dadurch gekennzeichnet dass die Zellen bakteriellen, toxischen und/oder immunologischen Stimuli ausgesetzt werden.
6. Immortalisierte gingivale Keratinocyten-Zelllinie gemäß der vorangegangenen Ansprüche dadurch gekennzeichnet dass die Zellen bakteriellen, toxischen und/oder immunologischen Stimuli in Gegenwart von potentiell protektiven und/oder modifizierenden Mitteln ausgesetzt werden.
7. Immortalisierte gingivale Keratinocyten-Zelllinie gemäß der vorangegangenen Ansprüche dadurch gekennzeichnet dass die Zellen mit mindestens einem, der im Mund vorkommenden krankheitsverursachenden Keime infiziert werden.
8. Immortalisierte gingivale Keratinocyten-Zelllinie gemäß der vorangegangenen Ansprüche dadurch gekennzeichnet dass die Zellen mit Porphyromonas gingi- valis infiziert werden.
9. Immortalisierte gingivale Keratinocyten-Zelllinie gemäß der vorangegangenen Ansprüche dadurch gekennzeichnet dass die Zellen in Gegenwart von potentiell protektiven und/oder modifizierenden Mitteln mit Porphyromonas gingivalis infiziert werden.
10. Immortalisierte gingivale Keratinocyten-Zelllinie gemäß der vorangegangenen Ansprüche dadurch gekennzeichnet dass die Zellen in Gegenwart von Chlorhexidin mit Porphyromonas gingivalis infiziert werden.
11. Verfahren zu Herstellung der Immortalisierte gingivale Keratinocyten- Zelllinie gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet dass isolierte Zellen der Gingiva als primäre Zelllinie mit einem Nukleinsäuremolekül, das die Expression eines Zell-transformierenden Faktors insbesondere der Onkogene E6 und E7 des H PV- Virus erlaubt, transfiziert werden.
12. Verwendung einer immortalisierten gingivale Keratinocyten-Zelllinie gemäß Anspruch 1 in einem Zellkultursystem zur in vitro Messung der epithelialen Funktion der Gingiva dadurch gekennzeichnet dass der transepitheliale Widerstand der Zellen gemessen wird, das Proteinmuster der Zellen im Westemblot, das Zytokeratinmuster in der Immunfluoreszenz dargestellt wird und/oder Diffe- renzierungsstadien der Zellen in der Durchflusszytometrie dargestellt werden.
13. Verwendung gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet dass die Zellen im Zellkultursystem zur in vitro Messung mit mindestens einem, der im Mund vorkommenden krankheitsverursachenden Keime infiziert werden.
14. Verwendung gemäß Anspruch 12 und 13, dadurch gekennzeichnet dass die Zellen im Zellkultursystem zur in vitro Messung mit mindestens einem, der im Mund vorkommenden krankheitsverursachenden Keime in Gegenwart von potentiell protektiven und/oder modifizierenden Mitteln infiziert werden.
15. Verwendung gemäß der Ansprüche 12 bis 14 dadurch gekennzeichnet dass der krankheitsverursachende Keim Porphyromonas gingivalis ist
16. Verwendung gemäß der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet dass das potentiell protektive und/oder modifizierende Mittel Chlorhexidin ist.
17. Verwendung gemäß der Ansprüche 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet dass Änderungen des transepithelialen Widerstandes, des Proteinmusters, des Zytokeratinmusters und/oder des Differenzierungsstadiums der Zellen gemessen werden.
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