DE19505056C1 - In vitro Kultivierung von pleomorphen Trypanosomenstämmen - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur in vitro Kultivierung von pleomorphen Trypanosomenstämmen und ein biologisches in vitro Test­ system zur Ermittlung von Effektorsubstanzen, welche den Übergang einer sich rasch teilenden Trypanosomenform zu einer teilungsunfähigen Trypanosomenform induzieren oder/und hemmen.

Trypanosomen sind begeißelte Einzeller, die als Parasiten in der Blutbahn von Säugetieren leben und im tropischen Afrika und Südamerika durch Insekten, z. B. Tsetse-Fliegen oder Raubwanzen, von einem Wirt zum anderen übertragen werden. Sie sind Erreger der afrikanischen Schlafkrankheit oder der Ohagas-Krankheit beim Menschen und verschiedener Nutztierseu­ chen wie insbesondere der Nagana und haben damit große medi­ zinische, veterinärmedizinische und ökonomische Bedeutung.

In der Säugerblutbahn, auf die sich die folgenden Ausführun­ gen beschränken, kommen die Parasiten in zwei morphologisch und biochemisch unterscheidbaren Formen vor. Die sich rasch teilenden Parasiten werden aufgrund ihrer Morphologie als "long slender" bezeichnet. Die durch Differenzierung aus ihnen entstehenden "short stumpy" Formen haben die Fähigkeit zur Zellteilung irreversibel verloren. Nur wenn die "short stumpy" Trypanosomen durch die Blutmahlzeit einer Tsetse- Fliege in den Fliegenmagen gelangen, können sie sich weiter differenzieren und als prozyklische Formen den Lebenszyklus fortsetzen. In der Säugerblutbahn sterben die "short stumpy" Trypanosomen nach wenigen Tagen ab und können somit die Infektion im Wirt nicht aufrechterhalten. Die Differenzie­ rung der "long slender" Formen in "short stumpy" Formen erfolgt durch ein noch unbekanntes Signal, das mit der Anzahl an Parasiten im Blut korreliert. Es scheint dies ein Mecha­ nismus zu sein, die Parasitämie (Zahl der Parasiten pro ml Blut) in einer Weise zu begrenzen, die das Überleben des Wirts und damit die Weiterverbreitung des Parasiten sicher­ stellt.

Natürlicherweise vorkommende Trypanosomen sind immer pleo­ morph (vielgestaltig), das heißt, sie können die Differenzie­ rung von "long slender" in "short stumpy" Formen durchlaufen. Diese Stämme können bisher in keinem in vitro Zellkultursy­ stem als Blutbahnformen effizient vermehrt werden. Lediglich Varianten, sogenannte monomorphe Formen, die im Labor erzeugt wurden und die die Fähigkeit zur Differenzierung in "short stumpy" Formen verloren haben oder hierin stark defekt sind, konnten bisher in vitro kultiviert und vermehrt werden.

Ein solches Verfahren zur Kultivierung von monomorphen Trypano­ somen ist z. B. bei V.B. Carruthers und G.A.M. Cross, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 (1992) 8818-8821 beschrieben. Dabei erfolgt zunächst eine Adaption der Blutbahnform von Trypanosomen an eine Flüssigkultur für mehrere Tage und anschließend die Kultivierung der monomorphen Trypanosomen auf Agarplatten.

Wir haben eine Zellkulturmethodik entwickelt, die es erstmals erlaubt, auch pleomorphe Trypanosomen in vitro zu kultivie­ ren. Darüber hinaus differenzieren die "long slender" Trypa­ nosomen in diesem Kultursystem bei Überschreiten einer be­ stimmten Zelldichte in "short stumpy" Formen. Hiermit haben wir erstmals gezeigt, daß das wirksame Prinzip, das das Signal zur Differenzierung vermittelt, von Faktoren des Säugerwirts unabhängig ist, da es in vitro abläuft, in glei­ cher Weise wie im intakten Tier mit der Dichte der Zellpopu­ lation korreliert und folglich von den Trypanosomen selbst abgegeben oder modifiziert werden muß. Weiterhin kann Medium, in dem Trypanosomen in höherer Dichte gewachsen sind (kon­ ditioniertes Medium) alleine eine differenzierungsinduzie­ rende und damit proliferationshemmende Wirkung entfalten. Mit diesem in vitro Differenzierungssystem verfügen wir über einen sensitiven Bio-Assay, der eine weitere Eingrenzung und Fraktionierung der genannten Aktivität mit der üblichen biochemischen Methodik erlaubt. Die Aktivität wird als SIF (stumpy induction factor) bezeichnet.

Ein Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur in vitro Kultivierung von pleomorphen Trypanosomen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man proliferationsfähige pleomorphe Trypanosomen auf die Oberfläche eines halbfesten Kulturmediums ausstreicht und unter Bedingungen inkubiert, bei denen eine Vermehrung der Trypanosomen erfolgt. Vorzugs­ weise erfolgt die Kultivierung bis zum Auftreten lichtmikro­ skopisch erkennbarer Trypanosomenkolonien. Durch das erfin­ dungsgemäße Verfahren gelingt die Kultivierung der prolifera­ tionsfähigen "long slender" Form bis zur Differenzierung in die proliferationsunfähige "short stumpy" form.

Das erfindungsgemäße Verfahren beruht darauf, daß die Kulti­ vierung von pleomorphen Wildtyp-Trypanosomenstämmen über­ raschenderweise als Kolonien auf der Oberfläche von halb­ festen Kulturmedien möglich ist. Vorzugsweise verwendet man ein Kulturmedium auf Agarbasis, z. B. Agar- oder Agaroseplat­ ten. Ein Beispiel für ein geeignetes Medium ist das HMI-9 Medium, doch auch andere bekannte, zur Kultivierung von Trypanosomen geeignete Medien können grundsätzlich verwendet werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Anwendung des oben beschriebenen Verfahrens als Assay-System zur Bestimmung von Effektorsubstanzen, welche das Wachstum oder/und die Differenzierung pleomorpher Trypanosomenstämme beeinflussen, d. h. induzieren oder/und hemmen. Dabei sind insbesondere solche Effektorsubstanzen von Bedeutung, die eine wachstumshemmende oder/und differenzierungsinduzierende Wirkung besitzen. Eine besonders bevorzugte Anwendung des Assaysystems ist die Bestimmung und Charakterisierung des Signalstoffes SIF, der aus einem konditionierten Kulturmedium erhältlich ist, das schon einmal zur Kultivierung von Trypa­ nosomen verwendet wurde.

SIF oder Analoge dieser Substanz sind hervorragend geeignet durch Induktion der Differenzierung in "short stumpy" Formen, die Vermehrung von Trypanosomen in der Säugerblutbahn zu blockieren. Da "short stumpy" Formen selbst nur eine be­ grenzte Lebensdauer von wenigen Tagen haben, führt die Ver­ abreichung pharmakologischer Dosen von SIF oder Analogen zur Elimination der Parasiten und ist damit therapeutisch von großem Nutzen. Der genannte Bio-Assay kann auch eingesetzt werden, um nach anderen Effektorsubstanzen zu suchen, z. B. nach Substanzen, die in die das SIF Signal vermittelnde Signaltransduktionskaskade stimulierend eingreifen.

Weiterhin soll die vorliegende Erfindung durch das vorlie­ gende Beispiel und die Abb. 1 und 2 näher erläutert werden.

Es zeigen:

Abb. 1 das Wachstum eines pleomorphen Trypanosomenstammes (AnTat 1.1) und eines monomorphen Trypanosomenstam­ mes (MiTat 427-221) bei Kultivierung auf einem halbfesten Agarmedium in vitro und

Abb. 2 die Plattierungseffizienz von pleomorphen Trypano­ somen nach einer in vitro Kultivierung.

Beispiel

In vitro Assay zum Nachweis einer wachstumshemmenden und differenzierungsinduzierenden Aktivität von Trypanosoma Blutstromformen z. B. Trypanosoma b. brucei AnTat 1.1).

A) Herstellung des HMI-9 Mediums in 1.6facher Konzentration (1.6x HMI-9)

1.6x HMI-9 Medium wird nach einer Modifikation der publi­ zierten Methode von Hirumi und Hirumi (1989) Journal of Parasitology 75; 985-989 hergestellt.

Zu 365 ml des in zweifacher Konzentration hergestellten Grundmediums (Iscove′s modified Dulbecco′s medium von Gibco BRL; Katalog-Nr. 074-02200A) werden folgende sterile wäßrige Lösungen in aufgeführter Reihenfolge beigegeben:

• - 10 ml Hypoxanthin (Sigma, Katalog-Nr. H 9636); 13,6 mg/ml
• - 10 ml Bathocuproin-Bisulfonsäure (Serva, Katalog- Nr. 14470); 2.82 mg/ml
• - 10 ml β-Mercaptoethanol (Merck, Katalog-Nr. 120060050) 20 µm/ml
• - 10 ml Thymidin (Sigma, Katalog-Nr. T 1895); 3.9 mg/ml
• - 10 ml Pyruvat (Gibco BRL, Katalog-Nr. 043-01360H)
• - 10 ml Penicillin/Streptomycin (Gibco BRL, Katalog-Nr. 043-05140H)
• - 10 ml Cystein (innerhalb 10 Minuten nach Ansetzen der Lösung dem Medium zugeben) (Gibco BRL, Katalog-Nr.066-01033E); 18.2 mg/ml
• - 50 ml Serum Plus® (hitzeinaktiviert während 30 min bei 56°C) (JRH Biosciences, Katalog-Nr. 14-001)
• - 150 ml Fetales Kälberserum (hitzeinaktiviert während 30 min bei 56°C) (Gibco BRL, z. B. Charge 40Q2321x, Katalog-Nr. 01105290 M)

B) Herstellung der Agaroseplatten

Die Herstellung der Agaroseplatten erfolgt in Anlehnung an die publizierte Methode von Vern B. Curruthers und George A. M. Cross (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 8818-8821.

Eine 1,78%ige Agaroselösung (1.3 g low melting point SeaPlaque GTG Agarose, Biozym, Katalog-Nr. 50112 in 73 ml bidestilliertem Wasser) wird 20 Minuten bei 120°C autokla­ viert und anschließend auf 37°C abgekühlt. Dieser Lösung werden 127 ml auf 37°C vorgewärmtes 1.6x HMI-9 Medium (siehe oben) zugegeben. 20 ml dieser Mischung werden blasenfrei in 100 × 15 mm Petrischalen überführt. Die Agaroseplatten er­ starren während 60 Minuten bei Raumtemperatur mit geschlosse­ nem Deckel. Darauf folgt eine Trocknung der Oberfläche der Agarplatte für ca. 20 Minuten bei abgenommenem Deckel in einem Laminar Flow des Typs Heraeus Lamin Air HB 2948.

C) Herstellung von Platten mit konditioniertem Medium

Monomorphe Trypanosomenstämme (z. B. MiTat 427-221) können in einfach konzentriertem HMI-9 Medium kultiviert werden (Vern B. Curruthers und George A. M. Cross (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 8818-8821). Das konditionierte Medium solcher Kulturen (das den SIF enthält) wird durch Abzentrifugieren der Zellen und anschließendem Sterilfiltrieren gewonnen. Dieses Medium oder mit den üblichen biochemischen Verfahren daraus gewonnene Fraktionen werden ad 5% mit Serum Plus® und ad 15% mit fetalem Kälberserum (siehe Abschnitt A) angereichert. 9 Volumenanteile dieser Lösung werden mit 1 Volumenanteil einer 6,5%igen Agaroselösung (hergestellt wie unter Abschnitt B beschrieben) gemischt. Diese Lösung wird mit verschiedenen Mengen der unter Abschnitt B beschriebenen Standard-HMI-9-Agarose Lösung vermischt, um unterschiedliche Anteile an konditioniertem Medium zu erhalten. 20 ml dieser Mischung werden anschließend in Petrischalen gegossen.

D) Ausplattieren der Blutstromformen pleomorpher Trypanosomen

Pleomorphe Trypanosomen (z. B. AnTat 1.1) werden entweder direkt aus dem Blut infizierter Mäuse oder Ratten isoliert oder aus einer der hier beschriebenen Kulturen gewonnen (durch Abwaschen der Platten mit einfach konzentriertem HMI-9 Medium) und auf die geeignete Zelldichte verdünnt. 100 µl der Zellsuspension werden mittels eines sterilen Drigalski-Spa­ tels auf der Oberfläche der Platte durch Drehbewegungen derselben verteilt. Anschließend werden die Platten in einen Brutschrank (z. B. des Typs Heraeus 6000) überführt und bei 37°C in 5% CO₂ und 100% Luftfeuchtigkeit inkubiert. Nach 2 bis 3 Stunden (optional) sowie nach Inkubation über Nacht wird die am Rand der Petrischale angesammelte Flüssigkeit mittels einer sterilen Pipette abgesaugt. Nach 2 Tagen bilden sich lichtmikroskopisch (40 × Vergrößerung) gut sichtbare Kolonien.

Abb. 1 zeigt einen Vergleich des Wachstums eines pleo­ morphen Trypanosomenstammes (Kurven 1 und 2) und eines mono­ morphen Trypanosomenstammes (Kurve 3) bei Kultivierung auf einem halbfesten Agarmedium in vitro. Es ist zu erkennen, daß die Zellenzahl pro Platte bei monomorphen Trypanosomen um ca. mindestens den Faktor 102 höher als bei pleomorphen Trypa­ nosomen ist. Dieses Ergebnis ist so zu interpretieren, daß pleomorphe Trypanosomen ab einer bestimmten Zelldichte von einer proliferationsfähigen Form in eine proliferationsun­ fähige Form differenzieren.

Dieser Befund wird auch durch Abb. 2 belegt, worin die Plattierungseffizienz von pleomorphen Trypanosomen nach einer bereits erfolgten in vitro Kultivierung dargestellt ist. Es ist zu erkennen, daß diese Plattierungseffizienz mit zuneh­ mender Zeitdauer der Vorkultur drastisch abnimmt. Dies zeigt, daß mit zunehmender Dauer der Vorkultur eine Differenzierung der pleomorphen Trypanosomen stattfindet.

E) Ablesen und Beurteilung des Assays

Zur Bestimmung der wachstumshemmenden und differenzierungs­ induzierenden Wirkung der Fraktionen des konditionierten Mediums wird folgende Auswertung nach 2 Tagen Inkubation der Trypanosomen vorgenommen.

• 1) wachstumshemmende Wirkung:
  • a) Bestimmung der Kolonienzahl (quantitativ) sowie der Kolo­ niengröße auf Platten, auf die 100 bis 200 Zellen ausplat­ tiert wurden (mit Lichtmikroskop)
  • b) Bestimmung der Gesamtzellzahl pro Platte, auf die 10 000 Zellen ausplattiert wurden (Abwaschen der Platte und an­ schließender Bestimmung der Zellzahl mit einer Neubauer Zellkammer oder eines cell counters; z. Schärfe System, Reut­ lingen).
• 2) differenzierungsinduzierende Wirkung:
  Untersuchung der Morphologie der Trypanosomen (Phasenkon­ trast-Mikroskopie, Anfärben mit Giemsa).

Claims (6)

1. Verfahren zur in vitro Kultivierung von pleomorphen Trypanosomen, dadurch gekennzeichnet, daß man proliferationsfähige pleomorphe Trypanosomen auf die Oberfläche eines halbfesten Kulturmediums ausstreicht und unter Bedingungen inkubiert, bei denen eine Vermehrung der Trypanosomen erfolgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bis zum Auftreten lichtmikro­ skopisch erkennbarer Kolonien erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein halbfestes Kulturmedium auf Agarbasis verwendet.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bis zur Differenzierung in eine proliferationsunfähige Form erfolgt.

5. Anwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 4 als Assay-System zur Bestimmung von Effektor­ substanzen, welche das Wachstum oder/und die Diffe­ renzierung pleomorpher Trypanosomenstämme beein­ flussen.

6. Anwendung nach Anspruch 5 zur Bestimmung und Charak­ terisierung eines die Differenzierung stimulierenden Signalstoffes (SIF), der aus einem konditionierten Kulturmedium erhältlich ist, das zur Kultivierung von Trypanosomen verwendet wurde.