DE2314076C3 - Verfahren zur Herstellung von karzinoembyonischem Antigen - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von karzinoembyonischem AntigenInfo
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Description
25
30
35
a NaCI 74,0 mg/ml, KCI 2,85 mg/ml, Na2HPO4 -7 H2O
2,90 mg/ml, KH2PO4 0,83 mg/ml.
h MgSO4 · 7 H2O 3,08 mg/ml, CaCI2 · 2 H2O 0,32 mg/ml.
c Penicillin O 630 mg, Streptomycinsulfat 1000 mg, 1% Phenolrot-Lösung S ml, aqua desl. 95 ml.
45
| Glucose (100 mg/ml) | 8 ml |
| Salzlösung A* | 80 ml |
| Salzlösung Bb | 40 ml |
| MEM Vitamine (100 x) | 10 ml |
| MEM essentielle Aminosäuren (5Ox) | 16 ml |
| MEM nichtessentielle Aminosäuren | 10 ml |
| (100 x) | |
| Hypoxanthin (0,5 mg/ml) | 20 ml |
| NCTC 109 | 40 ml |
| antibiotisches Phenoirot-Gemischc | 10 ml |
| Kälberserum | 150 ml |
| NaHCO3 | 1,7 g |
| Glutamin (29,2 mg/ml) | 10 ml |
| Wasser q.s. | ad 1000 ml |
besten geeigneten Laboratoriumstiere sind Hamster.
Die Erfindung wird daher an Hamstern beschrieben.
Es ist sehr schwierig, primäre Tumoren zu vermehren und mittels Nährmedien in Kulturen zu züchten. Im
Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden daher aus primären Tumoren transplantierte Tumore
bevorzugt
Es ist bereits bekannt, daß einige menschliche CEA
produzierende Tumore in die Backentaschen und andere Körperteile von Hamstern transplantiert werden können, wo sie über eine lange Zeit, beispielsweise 7
Monate lang, lebensfähig erhalten werden können. Diese Tumoren wachsen und vermehren sich nicht nur
kontinuierlich, sondern behalten auch ihre Produktion tumorspezifischer Substanzen beispielsweise von CEA,
im Wirtstier bei, während sie nach wie vor andere Charakteristika menschlichen Ursprung-s aufweisen.
Das Verfahren, das verwendet wird, um diese Tumoren in Hamstern zu vermehren und ihre CEA-Produktion zu
zeigen, ist das von Goldenberg und Hansen in Science 175, i i 17 - i ί i8 (iS72) beschriebene.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können die beschriebenen CEA produzierenden Tumoren in einem
Nährmedium kultiviert werden, das genügend Nährstoffe enthält, um die Produktion und Vermehrung von
CEA-Material in den Zellen zu ermöglichen. Ein
geeignetes Nährmedium ist das von Hutchison et aL, in Experimental Cell Research 42, 157-170 (1966)
beschriebene. Dieses Medium enthält Glucose, Salzlösungen, Vitamine, Aminosäuren, NCTC 109-Medium,
Phenolrot, Antibiotika, Kälberserum, Natriumbicarbonat und Wasser in Folgenden Mengen:
50
Karzinoembryonisches Antigen (CEA), ein Antigenmatcrial, das in der Diagnose von Karzinomen und
anderen Neoplasmen nützlich ist, ist aus Tumorzellen schwierig zu isolieren. Ferner ist das Antigen oder seine
antigenisch aktiven Komponenten zur Zeit nur aus Tumorzellen, die diekt vom Menschen stammen,
isolierbar. Es besteht daher ein Bedürfnis nach einer Methode, mittels der Tumorzellen, die CEA produzieren, in vitro vermehrt und kultiviert werden können, um
so eine kontinuierliche, vom Menschen als Quelle unabhängige Versorgung mit CEA zu garantieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verwendung von menschlichen gastrointestinalen Neoplasmen, vorzugsweise von Karzinomen des Kolons, die
in Laboratoriumstiere verpflanzt werden, um serienmäßig Zellkulturen zu etablieren, die karzinoembryonisches Antigen produzieren. Die zu diesem Zweck am
| Glucose (100 mg/ml) | 8 ml |
| Salzlösung Aa | 80 ml |
| Salzlösung Bb | 40 ml |
| MEM Vitamine (100 x)c | 10 ml |
| MEM essentielle Aminosäuren (50x)d | 16 ml |
| MEM nicht-essentielle Aminosäuren | 10 ml |
| (100 x)e | |
| Hypoxanthin (0,5 mg/ml) | 20 ml |
| NCTC 109r | 40 ml |
| antibiotisches Phenolrot-Gemisch8 | 10 ml |
| Kälberserum | 150 ml |
| NaH-CO3 | 1,7 g |
| Glutamin (29,2 mg/ml) | 10 ml |
| Wasser q.s. ad | 1000 ml |
1 NaCL 74,0 mg/ml, KCI 2,85 mg/ml, Na2HPO4-7 H2O
2,90 mg/ml, KH2PO4 0,83 mg/ml.
h MgSO4 · 7 H2O 3,08 mg/ml, CaCI2 · 2 H2O 0,32 mg/ml,
c Microbiological Associates, Preisliste I. Jan. 1971, Katalog
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c Microbiological Associates, Preisliste I. Jan. 1971, Katalog
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r Microbiological Associates, Preisliste I. Jan. 1971, Katalog
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8 Penicillin G 630 mg, Slreplomycinsulfal 1000 mg, l%ige
Während das angegebene Nährmedium sich als solches für verschiedene Organismen und Zellen eignet,
haben andere Nährmedien sich als weniger geeignet für
das Wachstum und die Vermehrung von CEA-produzierenden Tumorzellen erwiesen.
Im folgenden umfaßt karzinoembryonisches Antigen (CEA) alle Materialien, die, gemäß immunologischen
Tests, CEA-Antigenaktivität aufweisen.
Die Produktion und Abgabe von CEA durch die Zellen im Nährmedium kann durch Immunofluorescenz
oder Radioimmunoassay gezeigt werden.
Zur Gewinnung von Tumorzellen für das In-vitro-Wachstum, werden sie aus dem Tier herausgeschnitten
und dann auf enzymatischem, mechanischem oder anderem Wege zerkleinert. Vorzugsweise wird der
Tumor zunächst kleingehackt und dann mit einer sterilen Salzlösung, vorzugsweise Hank's äquilibrierter
Salzlösung (pH 7,2) zur Entfernung von Zellbruchstükken und roten Blutzellen gewaschen.
Für die enzymatische Zerstörung der Zellen eignen
sich proteolytische Enzyme. Ein typisches Enzym dieser Art ist z. B. die Protease Typ Vl (Sigma Chemical Co, Sl
Louis, Missouri). In einer besonders bevorzugten Ausruhrungsfonn werden die Zellen jedoch zunächst
mit einem Mucin-abbauenden Enzym (beispielsweise Neuraminidase) inkubiert, um die Aktivität des verwendeten proteolytischen Enzyms zu verstärken. Dies
geschieht dadurch, daß man die Zellen in einer Salzlösung, vorzugsweise in Gey's Salzlösung inkubiert,
die das Mucin-abbauende Enzym enthält, das auf die Mucinschicht der Zellen einwirkt und diese so dem
Angriff des proteolytischen Enzyms zugänglicher macht
Bevor man di? Zellen dem Einfluß des proteolytischen Enzyms unterwirft, wird das Mucin-abbauende
Enzym entfernt. Dies kann durch Waschen mit einer Salzlösung, beispielsweise Gey's Salzlösung und Zentrifugieren geschehen. Die nach ojrn Zentrifugieren
verbleibende Zellmasse wird dann der Wirkung eines proteolytischen Enzyms in einer Salzlösung, beispielsweise in Gey's Salzlösung ausgesetzt.
Nach Abbau der Zellen durch das proteolytische Enzym wurde durch sterile Gaze filtriert, mit der oben
beschriebenen Nährlösung sowie einer Salzlösung, beispielsweise Hank's äquilibrierter Salzlösung gewaschen und zentrifugiert Die so vorbereiteten Zellen
wurden in einem geeigneten Nährmedium, wie oben beschrieben, inkubiert Das Kulturmedium enthält
Serum, vorzugsweise Kälberserum, antibakteriell wirkende Antibiotika, z. B. Penicillin, Streptomycin, usw.,
und/oder Fungizide, z. B. Nystatin usw., zusätzlich zu
den Ingredienzien von Hutchison et al.
Das karzinoembryonische Antigen-Material kann nach dem im US-Patent 36 63 684 beschriebenen
Verfahren isoliert werden.
Die Zellen werden in dem Nährmedium bei einem pH von etwa 6,8-7,4 und bei einer Temperatur von etwa
35-38°C, vorzugsweise 370C, inkubiert Das Medium wird ganz in Ruhe gelassen, um es den Zellen und
Zellansammlungen zu ermöglichen, sich an der Oberfläche des Kulturgefäßes festzusetzen,
Gewöhnlich wächst in 3 oder 4 Tagen eine Schicht von Fibroblasten, die eine Anzahl von Tumorzellgruppen enthält.
Die Tumorzellen und Tumorzellansammlungen lösen sich gewöhnlich von der Fibroblastenschicht, um im
Medium herumzuschwimmen. Diese Zellen und Zellansammlungen können entfernt und in einem frischen
Kulturmedium weitergezüchtet werden. Der Übergang zu einem frischen Medium wird so häufig vorgenommen, wie es das Wachstum und die metabolischen
Bedingungen der Kultur erfordern, im allgemeinen alle 2 Wochen. Im allgemeinen ist die Einhaltung eines
bestimmten Zeitintervalles beim Wechsel von einem zum anderen Medium für das Verfahren nicht kritisch,
solange diese Wechsel nicht so unregelmäßig geschehen, daß das Wachstum der Zellen in nachteiliger Weise
beeinflußt wird. Ein gutes Kriterium für die Bestimmung
des Zeitpunktes eines Mediumwechsels ist ein Wechsel im pH-Wert, der eine metaboüsche Aktivkät der
Kulturen wiederspiegelt Ein solcher Wechsel des pH-Wertes wird durch den Phenolrot-Indikator angezeigt, der im Medium vorhanden ist
Nach einigen Monaten beginnt die Fibroblastenschicht zu verschwinden und man erhält gegebenenfalls
eine reine Population von Kolontumorzellen. Wenn dieses Stadium erreicht ist, können Subkulturen von
reinen Populationen der Tumorzellen in einem frischen Kulturmedium ohne Fibroblastenschicht hergestellt
werden. Solche reinen Tumorzellen-Populationen produzieren weiterhin CEA. Morphologisch haben die
Zellen der Kultur eine sphärische Form und enthalten cytoplasmatische Granula, sowie ausgeprägte oft
exzentrische Kerne. Das von den Zellen produzierte CEA wird an das Kulturmedium abgegeben. Das CEA
im Kulturmedium kann durch Radioimmunoassay nachgewiesen und gemessen werden, beispielsweise in
der im US-Patent 36 63 684 beschriebenen Weise oder nach ähnlichen, in der Literatur beschriebenen Methoden.
Eine andere, direktere Methode zum Nachweis von vorhandenem CEA ist der Nachweis in den in vitro
kultivierten Kolontumorzellen. Dies erfolgt dadurch, daß man die Zellen aus dem Kulturmedium nach
verschiedenen Zeitintervallen entfernt und sie einem Immunofluoreszenztest auf CEA unterwirft Der Immunofluoreszenztest kann entweder direkt unter Verwendung von CEA-Antikörpern, die mit einem Fluorochrom, beispielsweise Fluorescein-isothiocyanat, konjugiert sind, durchgeführt werden, oder mittels indirekter
Methoden unter Verwendung von einem CEA-Antikörper und einem mit einem Fluorochrom, beispielsweise
Fluorescein-isothiocyanat konjugierten Antikörper gegen das Globulin derjenigen Species in der der
CEA-Antikörper gebildet wurde. Fluoreszenz zeigt vorhandenes CEA an.
Um zu zeigen, daß die Zellen CEA produzieren und abgeben, werden regelmäßig Radioimmunoassays mit
aliquoten Teilen des Kulturmediums, in dem die Zellen wachsen, durchgeführt Die Ergebnisse zeigen, daß die
Kultur ständig CEA synthetisiert und abgibt Wenn das gesamte Kulturmedium gewechselt wird und eine
frische Menge hinzugesetzt wird, erfolgt ein Absinken des CEA-Spiegels bei der wieder aufgefüllten Kultur,
weil produziertes CEA entfernt wurde. Weil sich die Zellen jedoch vervielfältigen und weiterhin CEA in
Freiheit setzen, kommt es wieder zu einem Anstieg des CEA-Titers im Medium. Die Menge des in das
Kulturmedium abgegebenen CEA ist daher abhängig von der Dichte der Zellpopulationen. Bis zur Zeit
wurden CEA-Mengen von I μg/ml Kulturmedium
erreicht Die Erfindung ist jedoch nicht beschränkt auf die Produktion dieser bestimmten CEA-Menge. Es
wurde kein CEA gefunden in Kulturmedien, die nicht solche Tumorzellen enthielten oder in irgend welchen
anderen Medien, die das Wachstum von anderen tierischen oder transplantierten menschlichen Tumorzellverbänden unterstützten.
Ausführungsbeispiel
A) Wachstum von
CEA-produzierenden Zellen in Hamstern
CEA-produzierenden Zellen in Hamstern
Eine Tumorprobe eines Patienten mit Kolonkarzinom wurde auf Hamster übertragen und zwar in der
Weise, daß eine feine Suspension von Tumorgewebe in einer Salzlösung (beispielsweise einer Lösung enthaltend
0,91Vo Natriumchlorid und 100 Einheiten/ml Penicillin und/oder 0,6 mg/ml Streptomycin) hergestellt
wurde und aliquote Teile davon in die Backentaschen von jungen oder erwachsenen Hamstern eingespritzt
wurden. Behandlung mit Corticosteroiden (beispielsweise subkutane Injektion von 2^ mg Cortisonacetat,
zweimal wöchentlich) oder andere übliche Maßnahmen zur Unterdrückung von Immunreaktionen können
durchgeführt werden, um das Wachstum der Tumoren in den Hamstern zu unterstützen, jedoch haben sich bei
Verwendung einiger menschlicher Tumoren des Kolons solche Maßnahmen als unnötig erwiesen. Tumoren, die
im Laboratorium als »GW-39« und »GW-77« bezeichnet wurden, wuchsen ohne solche Immunreaktionen
unterdrückende Maßnahmen. Nach dem V/achstum der ersten Transplantate wurden aliquote Teile der
Tumoren wieder entfernt und in der oben beschriebenen Weise auf andere Hamster übertragen. Während
bei der ersten Übertragung des Tumormaterials die Backentasche der Hamster als Implantierungssielle
bevorzugt wird, können weitere Übertragungen auch in andere Körperregionen (beispielsweise intramuskulär,
subkutan, intrazerebral) vorgenommen werden, wodurch ebenfalls kräftig und schnell wachsende Tumorgewebe
erhalten werden. Im Falle der Verwendung des Tumorsystems mit der Laboratoriumsbezeichnung
»GW-39« lieferte die Inokulation einer Tumorsuspension mit einem Gehalt von etwa 20—40 mg an
Tumorgewebe, 20—30 Tage nach der Transplantation etwa 2-6 g Tumorgewebe in der Backentasche oder
nach 60-120 Tagen 100-150g Tumorgewebe in der hinteren Beinmuskulatur. Aus diesen Tumoren konnte
CEA nach den in der US-Patentschrift 36 63 684 beschriebenen Methoden extrahiert weiden. Es wurden
Mengen von 100—200 Mikrogramm CEA pro Gramm Tumorgewebe festgestellt.
B) Gewinnung von
Zellen für das Wachstum in Kulturmedien
Ein relativ kleiner Tumor aus Backentaschen (7-14 Tage alt) oder aus intramuskulärem Gewebe (14 — 30
Tage) wurde entfernt und sehr klein geschnitten. Die zerkleinerte Masse wurde dreimal mit 100 ml Hank's
äquilibrierter Salzlösung (HBSS, pH 7,2) in einem 250 ml
Becherglas gewaschen. Es wurde jeweils abdekantiert und der Rückstand nach Zusatz von 50 ml HBSS
zentrifugiert Die überstehende HBSS-Lösung wurde vollständig entfernt und der Rückstand 60 Minuten bei
370C in 10 ml Gey*s Salzlösung, enthaltend 1,0 mg
Neuraminidase, inkubiert Die Neuraminidase wurde dann durch Zentrifugieren entfernt und der Rückstand
nochmals mit GeV1S Salzlösung durch Zentrifugieren
gewaschen. Nach Entfernung des Überstandes wurde der Bodenkörper 45 Minuten bei Raumtemperatur in
«oiner 0,25%igen Proteaselösung (60 ml Proteaselösung
auf 6,0 mg Bodenkörper) gerührt. Die erhaltenen zerstörten Zellen wurden durch zwei Schichten steiler
Gaze filtriert und einmal mit der oben beschriebenen Nährlösung, sowie viermal durch Zentrifugieren mit
HBSS gewaschen- Nach Entfernung des Überstandes war der Rückstand für die Kultivierung bereit.
C) Wachstum von CEA-produzierenden Zellen in Kultur
Das gemäß Beispiel 2 erhaltene Material wurde in dem oben beschriebenen Nährboden suspendiert und
bei etwa 37° C und einem pH-Wert von etwa 6,8 — 7,4
inkubiert. Es wird nicht gerührt, um den Zellen und
ίο Zellverbänden die Möglichkeit zu geben, sich an der
Oberfläche des Glases festzusetzen. Innerhalb weniger Tage wächst eine Schicht von Fibroblasten, die mehrere
Ansammlungen von Tumorzellen enthält. Die Anzahl der Tumorzellen vergrößert sich ständig, wobei viele
Zellen ein mucinoides Material produzieren. Die Tumorzellverbände lösen sich unter Umständen von der
Fibroblastenschicht und vermehren die Anzahl ihrer Zellen indem sie frei herumschwimmen oder setzen sich
wieder an der Oberfläche des Glases ab. Mit wachsender Zellenanzahl verliert das Nährmedium
seine wachstumsfördernde Fähigkeit, was sich in der Farbänderung des Phenolrot-lndü; ators manifestiert
Zu diesem Zeitpunkt wird zentrifugiert und der Rückstand in frischem Nährmedium unter den gleichen,
oben beschriebenen Bedingungen weitergezüchtet Alle 2 Wochen wird in dieser Weise das Nährmedium
gewechselt Nach einigen Monaten beginnt die Fibroblastenschicht abzusterben und gegebenenfalls erhält
man eine reins Kultur von Tumorzellen des Kolons.
D) Direkter Immunofluoreszenztest für
CEA in kultivierten Zellen
CEA in kultivierten Zellen
Einer Kulturflasche aus Beispiel 3 entnommene Tumorzellen wurden gewaschen und mit Fluoresceinisothiocyanat
konjugierten Geißen-CEA-Antikörpern inkubiert. Die Mehrzahl der mit einem Fluoreszenz-Mikroskop
untersuchten Zellen zeigte eine Fluoreszenz der Zellmembranen, wodurch die Anwesenheit von
CEA an der Oberfläche der Zellen angezeigt wurde.
E) Indirekter Immunofluoreszenztest für
CEA in kultivierten Zellen
CEA in kultivierten Zellen
Einer Kulturflasche aus Beispiel 3 entnommene Tumorzellen wurden gewaschen und mit Kaninchen-CEA-Antikörpern
und mit Fluorescein-isothiocyanat konjugiertem Geißen-anti-Kaninchen-Globulin inkubiert.
Unter einem Fluoreszenz-Mikroskop wurde an der Mehrzahl der Zellen eine periphere Fluoreszenz
festgestellt, womit die Anwesenheit von CEA in den
so kultivierten Tumorzellen nachgewiesen wurde.
F) Negative Immunofluoreszenz-Reaktion
in anderen untersuchten kultivierten Zellen
in anderen untersuchten kultivierten Zellen
Wenn die Anti-CEA-Aniiseren aus den Beispielen 4 und 5 in geeigneter Weise mit roten Blutzellen der
menschlichen Blutgruppe 0 kreuz-adserbiert wurden,
wodurch alle Species-spezifischen Antikörper entfernt wurden, dann konnte weder mit der direkten noch mit
der indirekten Immunofluoreszenztestmethode die Anwesenheit von CEA in einer Anzahl von anderen, in
vitro vermehrten Zellen nachgewiesen werden, sogar nicht einmal in dem gleichen Nährmedium, welches
verwendet wurde, um das Wachstum von CEA-produzierenden Tumorzellen, die sich von menschlichen
Tumortransplantaten ableiteten zu fördern. Bei denjenigen, die in der in den Beispielen 4 und 5 beschriebenen
Weise untersucht worden waren und bei denen kein CEA festgestellt werden konnte, handelte es sich um
menschliche Choriokarzinome. die zunächst in Hamsterbackentaschen implantiert und dann in Kulturen
gezüchtet worden waren, um die ursprünglich aus menschlichem Cervixkarzinom stammenden HeLa-S3
Zellen, die amelanotischen Melanome von Former aus Hamstern, A. MeI. No. 3, in Zellkulturcn gewachsen, und
die Murin-lymphatische Leukemie 1.1210, aus kontinuierlichen
Zellkulturen.
G) Radioimmunoassay von durch
Tumorzellen in Nährmcdien freigesetztem CIiA
Tumorzellen in Nährmcdien freigesetztem CIiA
F.ine Standardkurve wurde folgendermaßen aufgenommen:
IO ml Ammoniumacetatpuffer (0.01 M, pH 6,8) wurden zu fünf Paaren von je 20 ml-Reagenzgläsern, die
durchgehend von I bis 10 numeriert wurden, zugegeben. 100 μI von normalem Gcißenserum wurde den Reagenzgläsern
zugesetzt. Ein CF.A-Standard wurde in folgenden Mengen zugesetzt:
Gläser I-2:0
Gläser 3+ 4 : 2,5 ng
Gläser 5+ 6 : 6,25 ng
Gläser 7+ 8 : 12.5 ng
Gläser 9+ 10 : 25 ng
Gläser 3+ 4 : 2,5 ng
Gläser 5+ 6 : 6,25 ng
Gläser 7+ 8 : 12.5 ng
Gläser 9+ 10 : 25 ng
Schließlich wurden jeweils IO ml Ammoniumacetatpuffer(0,01
M. pH 6,8) und 100 μΙ von zu untersuchender
Gcwcbcniihrflüssigkcit zugesetzt und vermischt.
Man setzte 50 μΙ einer 1 : HX)O-Verdünnung von
Geißcn-Antiscrum den Siandardlösungcn und der Probenlösung zu und vermischte. Die Gemische wurden
30 Minuten bei 45°C inkubiert. Dann wurde eine 3 ng äquivalente Menge von '2M-CEA (ca. 450 000 dpm) allen
Gläsern zugesetzt und gemischt. Die Gemische wurden 30 Minuten bei 45°C inkubiert. Nach der Inkubation
wurden 5 ml Zirkonylphosphatgel (pH 6.25) allen Gläsern zugesetzt, die dann verschlossen und vermischt
wurden. Die Gläser wurden dann mit 1000 χ G 5 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde
ausgegossen und die Reagenzglasöffnungen mit einem Papiertuch abgetrocknet. Jedem Glas wurden dann
I \J, I IVl ΛΛ1
11 IUt HUIΠ dLC I dt I nn I LM I1 μ Π O.ZJJ /Ug CSCI /Λ.
Nachdem die Gläser verschlossen worden waren, wurde das Kügelchen wieder suspendiert und die
Suspension 5 Minuten lang mit 1000 χ G zentrifugiert.
Der Überstand wurde ausgegossen und die Öffnungen der Reagenzgläser wurden mit einem Papiertuch
abgetrocknet. Die Außenseiten der Gläser wurden gewaschen und abgewischt und die Gläser wurden in
einem/Szintillationszähler gc/;i hit.
Mittels der .Standardkurve wird der CF.A-Gehalt der Kurve bestimmt. Ist der Titer der Lösung höher als
200 ng/ml. wird ein aliquoter Teil davon untersucht. Beispielsweise werden zu 10 ml Ammoniumacetatpuffer
> 20 μϊ der Lösung mit hohem Titer und 80 μΙ v<
>n normalem Gcißcnplasma zugesetzt. Dann wird Antiscrum
zugesetzt und der Test wird in der oben beschriebenen Weise durchgeführt.
Der Zusatz von normalem Geißen-Serum ist nötig, κι um das Volumen und den Tonus konstant /u halten.
Frische Nährlösung, wie sie verwendet wird, um das
Wachstum von CFA-produziercnden Tumor/eilen zu fördern, oder die Nährflüssigkeit, in der andere
Tumorzellen wachsen, wie z. IJ. Miirin-Iymphatische
η Leukemie 1.1210, die menschlichen Ile-I.a-S3 Zellen.
oder Zellverbände von amelanotischen Melanomcn A. MeI. No. 3 des Hamsters, bilden in dem gemäß Ci
durchgeführlen Radioimmunoassay kein CFA aus. Fs ist also weder in der frischen Nährlösung selbst, noch in
_><> einer Anzahl anderer Zcllverbände, die in dieser oder in
anderen Nährflüssigkeiten wachsen, CFA vorhanden.
H) Nachweis von CEA-Synthesen in vitro
F.s wurden serienmäßig Radioimmunoassays von aliquote» Teilen einer Nährlösung, in der Tumor/eilen
von Kolon-Karzinomen wuchsen (beispielsweise GW-39 Tumorzellen) durchgeführt. Auf diese Weise
m wurde gezeigt, daß eine ständig zunehmende Menge von CFA in die Nährflüssigkeil abgegeben wurde. Der
Wechsel des Nährbodens hat daher einen abrupten Abfall der CFA-Konzentration zur Folge, gefolgt von
einem langsamen Anstieg. In einer Versuchsreihe
r, wurden CF.A-Werte von 65, 410 und 560 ng/ml
Nährlösung festgestellt, 2,14 und 26 Tage nach Wechsel des Nährbodens. Innerhalb von 24 Stunden nach dem
Wechsel des Nährmediums, konnte eine CEA-Konzcntration
von 75 ng/ml des Nährmediums und mehr festgestellt werden, woraus sich ergibt, daß eine
eines Tages, je nach Zelldichte, produzieren kann. In
dichteren Kulturen kann eine lOfache CEA-Produktion
und -Abgabe erreicht werden. Die Zunahme cl-.r
α-, CEA-Konzcntrationen in den Nährflüssigkeiten nach
einem Wechsel des Nährmediums und der Zuwachs an gesamtem CEA-Gehalt mit zunehmender Zellenanzahl
der Kultur zeigen, daß das Antigen durch lebensfähige Tumorzellen produziert und abgegeben wird.
Claims (2)
1. Verfahren zur In-vitro-Vermehrung von Zellen,
die karzinoembryonisches Antigen produzieren, dadurch gekennzeichnet, daß man
menschliche, in einem Hamster transplantierte
karzinoembryonisches Antigen produzierende Tumorzeflen in einem Glucose, Salzlösungen, Vitamine,
Aminosäuren, Phenolrot, Antibiotika, Kälberserum
und Natriumbicarbonat enthaltenden Nährmedium,
das für das Wachstum und die Vermehrung besagter karzinoembryonisches Antigen produzierenden Tumorzellen bei einem pH von etwa 6,8—7,4 und einer
Temperatur von etwa 35-38° C geeignet ist, inkubiert und das karzinoembryonische Antigen
isoliert
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium folgende Zusammensetzung hat:
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| C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
| 8327 | Change in the person/name/address of the patent owner |
Owner name: GOLDENBERG, DAVID MILTON, DR., SHORT HILLS, N.J., |
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| 8328 | Change in the person/name/address of the agent |
Free format text: LEDERER, F., DIPL.-CHEM. DR. MEYER-ROXLAU, R., DIPL.-ING., PAT.-ANW., 8000 MUENCHEN |
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