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Verfahren zur Herstellung von Vaccinzwischenprodukten
Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von Vaccinzwischenprodukten zur Herstellung eines Vaccins, welches eine Immunität gegen gewöhnlichen Schnupfen (Erkältung) verleiht.
Es wurde in der letzten Zeit über verschiedene Versuche berichtet, den gewöhnlichen Schnupfenvirus in Gewebskulturen zu züchten, aber es wurde gefunden, dass die Reproduzierbarkeit der angegebenen Resultate nur äusserst schwierig zu erreichen und in einigen Fällen überhaupt nicht zu erreichen ist. Weiterhin wurde auch bereits die Kultur von Virus 2060 beschrieben, der nunmehr als Echo 28 bezeichnet wird. Bezüglich dieser Veröffentlichung ist zunächst festzustellen, dass die Bebrütung stationär erfolgt und dass weiterhin kein pH-Wert angegeben wird, welcher bei der Kultur eingehalten werden muss. Es hat sich nun herausgestellt, dass dieser Virus aus der Gruppe der Schnupfenvirusarten fast der einzige ist, welcher bei 370C kultiviert werden kann ; diese Temperatur ist bei der Züchtung von Virusarten üblich.
Es wurde jedoch festgestellt, dass gerade diese Virusart nur für eine sehr geringe Anzahl Erkältungen verantwortlich ist. Bei weitem die grösste Anzahl von Virusarten, die Schnupfen bzw. Erkältungskrankheiten hervorrufen können, ist nur ausserordentlich schwierig zu züchten und auch nur eine geringe Abweichung vom optimalen PH-Wert und den optimalen Temperaturbedingungen, wie sie gemäss der Erfindung beansprucht werden, ergibt im Unterschied zur Züchtung von Echo 28 einen völligen Misserfolg.
Die Erfindung beruht daher auf der überraschenden Tatsache, dass für die Virusarten, die die meisten Erkältungskrankheiten hervorrufen, ein kritischer Bereich an Bedingungen existiert, der eingehalten werden muss, und dass ausserdem das Kulturmedium umgewälzt oder auf andere Weise relativ zu den Zellen bewegt werden soll, um optimale Resultate zu erhalten.
Die Züchtung von Schnupfenviren ist insoferne besonders wichtig, da sie die Grundlage zur Herstellung eines impfbaren Vaccins darstellt, das dann der geimpften Person eine gewisse Immunität gegen den Schnupfen verleiht.
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wöhnlich bei der Virenzüchtung verwendet werden, abweichen.
So wurde gefunden, dass Schnupfenviren, welche direkt von einer Versuchsperson erhalten werden, in Affennierengewebe oder Affennierenzellen bzw. in menschlichem Embryonalnierengewebe oder menschlichen Embryonalnierenzellen bei einer Temperatur bebrütet werden sollen, welche unter der Temperatur liegt, die sonst üblich ist, sowie bei einem engeren PH-Bereich.
Erfindungsgemäss wird somit ein Verfahren zur Herstellung eines Materials vorgesehen, das als Vaccin : zwischenprodukt oder für experimentelle Zwecke verwendet werden kann, wobei ein salzhaltiges Medium, das sich für Gewebekulturen eignet und das lebendes Affennierengewebe oder lebende Affennierenzellen oder lebendes menschliches Embryonalnierengewebe oder lebende menschliche Embryonalnierenzellen enthält, mit einem Material angeimpft wird, das wenigstens einen Stamm von menschlichen Schnupfenviren enthält, worauf das Medium bei einer Temperatur von 30 bis 360C bei einem PH-Wert zwischen 6, 4 und 7, 4 bebrütet wird, bis sich die Viren im Medium kräftig vermehrt haben.
Die Bebrütung soll durchgeführt werden bei relativer Bewegung des Mediums und des Gewebes oder
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der Zellen, vorzugsweise durch Rotation des Kessels, welcher Medium, Gewebe oder Zellen enthält.
Vorzugsweise liegt der pH-Wert zwischen 6, 4 und 7. 2, und am besten zwischen 6. 8 und 7, 2.
Als salzhaltiges Medium wird vorzugsweise ein solches verwendet, das praktisch isoton ist, beispiels- weise Parkers Medium 199 oder Hank's Salzmedium, das beispielsweise mit einem Anteil eines enzyma- tischen Hydrolysats von Milchalbumin verstärkt ist.
Jedenfalls soll ein solches Medium verwendet werden, das das Wachstum der lebenden animalischen
Zellen bzw. des Gewebes in vitro ermöglicht.
Virenhaltiges Material kann direkt von der Versuchsperson, beispielsweise durch Nasenwaschungen oder durch Gurgeln, erhalten werden. Die Waschflüssigkeiten bzw. die Gurgelflüssigkeit können natürlich leicht zufällig vorhandene Mikroorganismen enthalten, und vorzugsweise werden daher dem Kulturmedium ein oder mehrere Antibiotika zugesetzt, um diese zu töten. Es wird daher die Verwendung eines Mediums vorgezogen, das entsprechende Mengen an Penicillin und Streptomycin und ein geeignetes antifungales
Mittel wie Mycostatin enthält.
Die lebenden animalischen Zellen bzw. das Gewebematerial in der Kultur liegen vorzugsweise in
Form einer Einzelschicht von Zellen vor, die in der Salzlösung wachsen. Es wurde gefunden, dass mit Be- zug auf wenigstens die Mehrzahl der Schnupfenvirenstämme die besten Resultate erhalten werden, wenn die Zellen von den Nieren von menschlichen Embryos stammen, die durch Hysterotomie von 3 bis 5 Monate graviden Frauen erhalten wurden. Es wurde gefunden, dass bestimmte Stämme der Schnupfenviren unter den oberwähnten Bedingungen, die gleichen Ergebnisse liefern, wenn das Zellenmaterial oder - gewebe aus den Nieren von Affen, beispielsweise der Art Macacus, wie beispielsweise Rhesus- und Cynomolgusaffen, erhalten wurde.
Es ist sehr erwünscht, dass man die erfindungsgemäss hergestellten Virenpräparate studieren kann, um die relative Wirksamkeit von Präparaten, die unter verschiedenen Bedingungen hergestellt wurden, experimentell zu bestimmen.
Es ist weiterhin auch günstig, ein derartiges Bestimmungsverfahren zu besitzen, das als Kontrollerfahren bei der Herstellung eines Vaccins oder eines Vaccinzwischenproduktes verwendet werden kann.
Es wurde gefunden, dass der cytopathische Effekt, der durch aktive Schnupfenvirenteilchen bei Bebrütung mit lebenden animalischen Zellen in einem geeigneten Medium hervorgerufen wird, ein Mittel zur Bestimmung der Wirksamkeit eines bestimmten Präparates liefert. Wenn die Bebrütung unter den erfin- dungsgemässen Bedingungen durchgeführt wird, entstehen durch den cytopathischen Effekt der infektiösen Virenteilchen Focal-Läsionen (auch Plaques genannt), die unter dem Mikroskop gut zu beobachten sind.
Nach einer bestimmten Bebrütungsdauer beginnen die Läsionen in der Zellschicht als Ergebnis der Einwirkung der einzelnen infektiösen Virusteilchen. mit welchen die Kultur ursprünglich angeimpft worden war, zu erscheinen. Diese Läsionen oder Plaques werden für den in der weiteren Beschreibung dargelegten Zweck Primärplaques genannt. Während der Bebrütung produzieren die Zellen weitere Virenmengen, die sich im weiteren Zeitverlauf durch die Zellschicht verteilen und zur Bildung der sogenannten Sekundärplaques Anlass geben. Es sei darauf hingewiesen, dass nur die Anzahl der Primärplaques den Wirkungsgrad des ursprünglich angewendeten Virenpräparates genau wiedergibt.
Selbstverständlich gedeihen nicht alle Stämme der Schnupfenviren in dem eben beschriebenen Medium, es kann jedoch leicht durch die im folgenden angegebene Prüfung festgestellt werden, ob sich ein bestimmter Stamm hiefür eignet oder nicht.
Hiefür werden die Viren wie oben beschrieben bebrütet und das Zellmaterial wird unter einem Mikroskop zu einer Zeit betrachtet, wenn sich einebeträchtliche Anzahl von Primärplaques gebildet hat, jedoch vor der Bildung von Sekundärplaques, und die Anzahl der Primärplaques wird gezählt.
Die geeignete Zeit, bei welcher diese Beobachtung und die Zählung der Primärplaques durchgeführt werden muss, kann nicht genau angegeben werden ; sie hängt in jedem spezifischen Fall vom verwendeten Zellmaterial, vom geprüften Virenstamm und seiner Wirksamkeit und von den Kulturbedingungen ab.
Die optimale Zeit zur Beobachtung kann zwischen 2-12 Tagen (z. B. 5 oder 6 Tage) nach Beginn der Bebrütung schwanken ; mit der zunehmenden Erfahrung wird jedoch derjenige, der den Versuch durchführt, leicht die Optimalzeit bestimmen können. Zu jeder Zeit während der Bildung der Primärplaques zeigt die Zahl der gezählten Plättchen im Vergleich mit der Zahl der bei einem Kontrollversuch mit einem Standardvirenpräparat gezählten Plaques den ungefähren Grad der Wirksamkeit des geprüften Präparates gegenüber dem des Standards. Natürlich wird die Bestimmung am empfindlichsten sein, wenn die Maximalzahl der Primärplaques gebildet ist und bevor die Bildung von Sekundärplaques eingesetzt hat.
Die Erfindung unterscheidet sich wesentlich von den bisherigen Vorschlägen zunächst durch die Temperatur, bei welcher die Bebrütung durchgeführt wird (welche Temperatur wesentlich unter der liegt, die
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gewöhnlich bei Gewebskulturen angewendet wird), sowie auch bezüglich des angewendeten pH-Wertes.
Gemäss der Erfindung wird besonders der Fall zu betrachten sein, bei welchem das jeweilige Medium ein Alkalibikarbonat, vorzugsweise Natriumbikarbonat, in einem Anteil zwischen 0. 001 M und 0, 01 M, vorzugsweise in einer Menge von 0,002 bis 0, 005 M, enthält. Es können jedoch auch andere Substanzen zur Einstellung des gewünschten pH-Bereiches im Medium verwendet werden, beispielsweise ein Natriumphosphatpuffer, durch welchen pH-Werte zwischen 7, 14 und 7,69 bei einer Endkonzentration von 0,05 M im Medium erhalten werden. Die vorzugsweise angewendete Temperatur liegt zwischen 31 und 35 C,
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533, 50C, erhalten.
Es wurde gefunden, dass man durch Züchten der jeweiligen Viren, wie oben angegeben, ein wässeriges Medium erhalten kann, welches die Viren oder die jeweiligen Virenarten enthält, und die wässerige Lösung kann vom festen Material beispielsweise durch Zentrifugieren nach 2-14tägiger, vorzugsweise 4-12tägiger und am besten 6-9tägiger Bebrütung abgetrennt werden.
Wenn das erfindungsgemässe Material zur Herstellung eines Vaccins gegen Schnupfen verwendet werden soll. kann es notwendig sein, das Antigen im Medium z. B. durch Ultrazentrifugieren, Dialyse oder Durchlauf durch eine Ionenaustauscherkolonne zu konzentrieren.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern, ohne dass diese jedoch hierauf beschränkt werden soll,
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l :Natriumbikarbonat, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 ug/ml Streptomycin bestand. 0, 5 ml dieser Suspension wurden in Röhrchen gebracht, die zunächst 3 Tage bei Stillstand bebrütet wurden. Nun wurde das Medium entfernt und durch 1, 5 ml eines neuen Medium ersetzt, das aus 2% Kälberserum, 0. 250/0 Milchalbumin und Natriumbikarbonat sowie Antibiotika wie vorher bestand. Zu jeder Kultur wurden 0, 2 ml Nasenwaschfliissigkeitvon einem Patienten oder Freiwilligen, der mit dem H. G. P.-Stamm von Schnupfenviren infiziert worden war, zugesetzt.
Die Kultur wurde in eine Rolltrommel in einen Brutschrank bei 330C gegeben. Nach ungefähr 5 Tagen begann in der Zellschicht die Degeneration. Nach ungefähr 10 Tagen war die Degeneration sehr ausgeprägt und das abgetrennte Medium enthielt grosse Virenmengen.
Beispiel 2 : Beispiel 1 wurde wiederholt, es wurde jedoch ein Natriumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7, 2 bei einer Endkonzentration von 0,05 M verwendet.
Im folgenden wird beispielsweise angegeben, wie die Wirksamkeitsversuche durchgeführt werden können.
Die Wirksamkeit eines Präparates mit einem Gehalt an H. G. P.-Viren wird in Gewebskulturen geprüft, wobei Sekundärkulturen von Rhesusaffennierenzellen verwendet werden. Zwischen 30000 und 40 000 Zellen werden in feststehende Rohre in 0, 5 ml eines Mediums gebracht, das aus 50/0 Kälberserum
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durch 1, 5 ml eines Mediums ersetzt, das 21o Kälberserum und 0, 25% Milchalbuminhydrolysat sowie die andern Bestandteile des ursprünglichen Mediums in den oben angegebenen Mengen enthält. Die Kulturen werden dann mit einem virenhaltigen Material entweder sofort oder etwa innerhalb eines Tages nach Wechsel des Mediums angeimpft, und die angeimpften Kulturen werden bei 330C in einer Rolltrommel unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen bebrütet.
Die besten Resultate werden mit Medien, deren pH-Wert zwischen 7, 0 und 7, 4 liegt, erhalten. Bei einer Modifikation dieses Verfahrens kann der benötigte pH-Wert des Mediums durch Verwendung eines Natriumphosphatpuffers mit einem pH-Wert von 7, 14 bis 7, 69 bei einer Endkonzentration von 0, 05 M im Medium an Stelle von Natriumbikarbonat erhalten werden. In Intervallen nach der Bebrütung werden Proberohre zur Zählung der Plaques-Zahl in der Zellschicht mikroskopisch geprüft. Bei diesen Versuchen ergibt sich, dass bis ungefähr 3 Tage nach dem Animpfen die Zahl der gebildeten Plaques der Virenkonzentration im geprüften Präparat direkt proportional ist. Beim Zählen der Plaques ist es natürlich notwendig, eine Minimalzahl von Zellen bei einer FocalLäsion zu bestimmen, die als Plaques gezählt werden sollen.
So kann beispielsweise festgelegt werden, dass ein derartiger Focus wenigstens 10 Zellen enthalten muss, um als Plaque bezeichnet zu werden, und es ist natürlich notwendig, das gleiche Zählsystem sowohl für das zu prüfende Präparat als auch für das Standardvirenpräparat, das auf die gleiche Weise geprüft wird, beim Zählen zu verwenden. Proben, die eine ungewöhnlich hohe Plaques-Zahl zeigen, beispielsweise 15 oder 18, können nach Vereinbarung bei der
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Auswertung der beobachteten Resultate unberücksichtigt bleiben. Nach ungefähr 3 Tagen findet man, dass die Anzahl der Plaques zunimmt, und es kann angenommen werden, dass diese letzteren Plättchen Sekun- därplaques sind.
Bei Anwendung der oben beschriebenen Versuchsverfahren mit H. G. P.-Viren in Kulturen von Affennierenzellen hat sich gezeigt, dass für die hierin beschriebenen Bedingungen zur Weiterbringung von Viren der pH-Wert wesentlich wichtiger ist als die jeweilige Ionenart, die zur Erreichung des geeigneten pH-Wertes verwendet wird. Daraus ergibt sich, dass Bikarbonationen kein wesentliches Merkmal der Erfindung oder der hierin beschriebenen Prüfmethode sind, und es können auch geeignete andere Puffer, z. B. die oben erwähnten Phosphatpuffer, verwendet werden.
Es hat sich weiterhin gezeigt, dass die PIaques-Zahl vermindert wird, wenn H. G. P.-Viren vor der Animpfung des Kulturmediums mit einem spezifischen Hyperimmunantiserum, hergestellt an Kaninchen, gemischt wird. Es kann daher das obige Bestimmungsverfahren nicht nur als Kontrollverfahren bei der Herstellung eines Vaccins, sondern auch bei einem bestimmten Immunitätsserum zur Identifizierung und Bestimmung der im Vaccin enthaltenen Virenstämme verwendet werden. Das Verfahren kann ausserdem verwendet werden, um die Empfindlichkeit gegen Antikörper bei experimentellen Vaccinen oder Vaccinen unter Prüfung, die an Tiere oder Menschen verabreicht werden, zu bestimmen.
Als Alternativmöglichkeit zur Verwendung von Affennierenzellen beim erfindungsgemässen Prüfverfahren können auch Kulturen vom menschlichen Amnion und menschlichen Nierenzellen verwendet werden, obwohl in diesen Fällen die Plättchen schwieriger zu zählen sein können. Das Prüfverfahren und das erfindungsgemässe Verfahren können so gut wie am H. G. P.-Stamm auch am P. K.-Stamm und andern Virenstämmen angewendet werden.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Züchtung von menschlichen Schnupfenvirusarten durch Züchtung in einem Gewebekultursystem, welches Säugetierzellen, insbesondere lebendes Affennierengewebe oder menschliches Embryonalnierengewebe und ein für Gewebekulturen geeignetes salzhaltiges Medium enthält, dadurch gekennzeichnet, dass das Kulturmedium bei einer Temperatur von 30 bis 360C und einem pH-Wert von 6. 4 bis 7. 4 gehalten wird.