DE1617940C2

DE1617940C2 - Verfahren zur Gewinnung eines für die Züchtung von Viren geeigneten Zellstammes

Info

Publication number: DE1617940C2
Application number: DE1617940A
Authority: DE
Inventors: Kevin Joseph O'reilly; John London Prydie; Sidney Edwin Smith
Original assignee: Wellcome Foundation Ltd
Current assignee: Wellcome Foundation Ltd
Priority date: 1966-02-18
Filing date: 1967-02-20
Publication date: 1985-05-30
Also published as: DE1617940A1; CY614A; DK119472B; BE694243A; ES336810A1; US3520972A; IT983058B; CH504532A; IL27418A; NL6702396A; JPS5341230B1; FR1570435A; GB1177635A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines für die Züchtung von Infektiösen Katzen-Enteritis-Viren, Katzen-Rhinotracheitis-Viren und Katzen-Picorna-Viren geeigneten Zellstammes.

ι* Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung dieses Zellstammes zur Züchtung der genannten Viren.

Aus der DE-AS 11 98 489 1st ein Verfahren zur Züchtung des Panleucopenie-Vlrus auf einer primären Gewebekultur, die durch Trypsinbehandlung infizierter Katzennierenzellen hergestellt wurde, bekannt. Die Züchtung des Virus war jedoch nur unter Einhaltung mühsamer und umständlicher Maßnahmen möglich. So mußte zuerst eine gesunde Katze infiziert und, wenn die Symptome einer Erkrankung erkennbar waren, getötet

-" werden. Das Gewebe muß für die Kultur beibehalten werden. Außerdem ist zu beachten, daß Nlerenzellenkulturen junger Katzen - auch wenn sie von äußerlich gesund erscheinenden Tieren gewonnen wurden - häufig Infektionen durch wilde Katzen-Panleukopenie-Vieren zeigen, was jedoch erst nach der Beimpfung mit dem Virus erkennbar wird. Die Züchtung des Virus in einem solchen Gewebe durch multiple Passagen ist daher immer durch die Anwesenheit wilder Viren gefährdet. Ein weiterer Nachteil des bekannten Verfahrens liegt

-5 darin, daß Nierenzellen-Kulturen junger Katzen nicht zu jeder Jahreszeit in ausreichender Menge zur Verfügung stehen und so eine technische Impfstoffherstellung wesentlich erschwert wird. Außerdem hat das bekannte Verfahren den Nachteil, daß primäre Zellkulturen von Katzen verwendet werden, die sich sehr schnell verschlechtern und nach wenigen Passagen nicht mehr in ein neues Kulturmedium zur Bildung eines Zellstammes überführt werden können.

w Es bestand daher das Bedürfnis nach einem Verfahren zur Gewinnung eines für die Züchtung von Viren geeigneten Zellstammes, der frei von Virusverunreinigungen ist, eine konstante Empfindlichkeit für Viren aufweist und praktisch jederzeit zur Verfügung steht.

Dieses Bedürfnis wird gelöst durch ein Verfahren der eingangs geschilderten Art, das dadurch gekennzeichnet ist, daß Katzenembryogewebe disaggregiert und dann durch Reihenpassagen In einem Nährmedium kultiviert

JS wird, solange ein im wesentlichen diploider, fibroplastischer Zellstamm erhalten bleibt.

Es wird hinsichtlich der Erfindungshöhe des erfindungsgemäßen Verfahrens darauf verwiesen, daß bis zum Prioritätstag der Erfindung kein wesentlicher Unterschied zwischen den Wachstumseigenschaften von embryonalen und adulten Zellen bestand. Es war daher überraschend, daß aus embryonalem Gewebe nicht infizierter Katzen ein Zellstamm erhalten werden kann. Es war auch überraschend, daß der erhaltene Zellstamm durch Katzen-Enterltls-Vlren, Katzen-Rhlnotracheltls-Vlren und Katzen-Plcorna-Vlren direkt, das heißt ohne Anwendung umständlicher Verfahrensschritte, infiziert werden kann.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren kann ein übliches Kulturmedium, das die notwendigen physikalischen und chemischen Bedingungen und die Nährzusammensetzung von Kultivierung oder Weiterkultivierung der Zellen, den Individuellen Wuchs und das Vervielfachen dieser Zellen, erfüllt, verwendet werden. Besonders geeignet ist Eagle's Basal Medium, das mit etwas Rinderserum bzw. mit Tryptosephosphatnährbrühe und mit dem Zweifachen der üblichen Menge Aminosäure und Vitaminen versetzt 1st. Der pH-Wert des Mediums wird auf 6,8 bis 7,8 eingestellt.

Der in das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzte Katzenembryo kann die Größe von ungefähr 1 bis 4,5 cm haben. Der Katzenembryo oder ein unter aseptischen Bedingungen abgetrennter Teil desselben, z. B. das

so Lungengewebe eines 5 bis 7wöchigen Embryos wird mechanisch oder mit einer geeigneten Enzymzubereitung In einer gepufferten Salzlösung disaggregiert. Die sich ergebende Zellsuspension wird dann in die das Nährmedium enthaltenden Behälter gebracht und bei einer Temperatur von 32 bis 39° C, vorzugsweise 35 bis 37,5° C, kultiviert, solange ein Im wesentlichen diploider, fibroplastischer Zellstamm erhalten bleibt. Zur Erleichterung der Weiterkultivierung Ist es üblich, die verwachsenen Schichten der Zellen des Stamms mit Trypsin und einem unschädlichen Chelatbildner zu behandeln, bevor jeder Zellstamm In ein neues Medium übertragen wird.

Die Zellen des Stamms vervielfachen sich mit einer Geschwindigkeit, die einer Verdoppelung ihrer Zahl, jeweils nach 2 bis 3 Tagen, entspricht. Zur Infizierung des Zellstamms mit dem jeweiligen Virus wird der Stamm mit einer Salzsuspenslon des Virus gemischt, die beispielsweise aus dem Exudat eines Infizierten Tieres oder von anderen Quellen erhalten wurde. Im Falle des Infektlösen Katzen-Enterltls-Vlrus wird es vorgezogen,

6" mit Infektiöser Katzen-Enterltls Infizierte Milz oder Dünndarm von Katzen zu verwenden und mit denselben Kulturen des embryonalen Katzenzellstamms zu Impfen. Wenn die Viren In ausreichender Menge vorhanden sind, wird die Kultur hinsichtlich Ihrer Immunogenltät und Toxlzltät geprüft. Wenn notwendig, wird der Virus abgeschwächt oder durch wettere Passagen In den erfindungsgemäß hergestellten Zellstämmen abgeschwächt oder unter Verwendung geeigneter chemischer oder physikalischer Mittel Inaktiviert. Das erhaltene antigene Material wird entweder zur Schaffung von Antikörpern zur passiven Immunisierung oder als Vakzine bei empfänglichen Warmbluttieren verwendet.

Die erfindungsgemäß hergestellten Zellstämme sind für die Virenzüchtung Im Sinne der beiden Patentansprüche geeignet. Die Zellen sind frei von Virenverunreinigung und weisen eine praktisch konstante Viren-

empfängllchkelt auf. Sie sind in praktisch jeder Menge und unabhängig von der jeweiligen Jahreszeit erhältlich. Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

B e I s ρ 1 e 1 1

Von zwei etwa 6 Wochen alten Katzenembryos wurde das Lungengewebe entfernt. Das Gewebe wurde mit einer 0,25%igen Lösung von Trypsin In einer phosphatgepufferten Salzlösung dlsaggreglert. Die erhaltene Suspension wurde mit 5 χ 10⁶ Zellen In einen Kolben mit 80 Vol.-Teile Eagle's Basal Medium (vgl. Eagle H., Science, 1955, 122. 504'), das das Zweifache der üblichen Menge an Aminosäuren und Vitaminen, 10 Vol.-Teile n> Peptonmedlum in Phosphatpuffer (Tryptosephosphat) und 10 Vol.-Teile Rinderserum als sterile Lösung enthielt, gegeben.

Die so gebildeten Monoschlchtkulturen werden weiterkultiviert, indem der Inhalt eines Kolbens durchschnittlich 2mal wöchentlich serienmäßig In zwei oder drei Kolben übertragen wurde. Die Zellen wurden dazu mit einer 0,05%igen Lösung des Natriumsalzes der Äthylendlamlntetraesslgsäure in einer 0,l%igen Trypsin-Lösung der obigen phosphatgepufferten Salzlösung resuspendiert.

Die Zellen sind typische Flbroplaste, die Im wesentlichen bis zur 40. Passage diplold bleiben. Es erfolgt keine morphologische Transformation bis zur 100. Passage, obgleich Chromosomabnormalltäten In zunehmendem Maße auftreten.

Die Zellbestände bis zur 20. Passage wurden bei -190⁰C in einem Nährmedium, das 10% Dlmethylsulfoxid 2» enthielt, aufbewahrt.

Bei einem weiteren Versuch, bei dem als Nährmedium Eagle's Basal Medium (90 Volumteile) und Rinderserum (10 Volumteile) verwendet wurde, wuchsen die Zellen nicht so schnell wie beim obigen Versuch.

Beispiel 2

Etwa 2,5 cm große Embryos wurden von trächtigen Katzen entfernt und in feine Teilchen zerkleinert. Das Gewebe wurde mit einer 0,25%igen Trypsinlösung In einer phosphatgepufferten Salzlösung disaggreglert. Die erhaltene Suspension wurde mit 5 χ 10⁶ Zellen in 80 Vol.-Teile Eagle's Basal Medium, das das Zweifache der -W üblichen Menge an Aminosäuren und Vitaminen, 10 Vol.-Teile Peptonmedium in Phosphatpuffer und 10 VoI.-TeIIe Rinderserum als sterile Lösung enthielt, gegeben.

Die so gebildeten Monoschichtkulturen wurden welterkultiviert, indem der Inhalt eines Kolbens serienmäßig durchschnittlich zweimal pro Woche und später einmal pro Woche In zwei oder drei Kolben übertragen wurde. Die Zellen wurden dazu mit einer 0,05%lgen Lösung des Natriumsalzes der Äthylendlamlntetraesslgsäure In einer O,l96igen Trypsinlösung der obigen phosphatgepufferten Salzlösung· resuspendiert.

Die Zellen sind typische Flbroblaste, die im wesentlichen bis zur 48. Passage diplold bleiben.

Zellbestände bis zur 20. Passage wurden bei -190⁰C In einem Nährmedium mit 10% Dlmethylsulfoxid aufbewahrt.

Ähnliche Versuche wurden mit anderen, etwa 1 bis 4,5 cm großen Katzenembryos, Embryokadaver und mit den folgenden Katzenembryo-Gewebeteilen durchgeführt: Niere, Herz, Herz/Lungegemlsch, Haut, Muskel, Darm, Placenta, Zunge und Leber. Von allen Gewebearten wurden zufriedenstellende Zellstämme erhalten.

Beispiel 3

Zusammenhängende Schichten des Zellstamms wurden mit dem Natriumsalz der Äthylendlamlntetraesslgsäure, wie in Beispiel 1 oder 2 beschrieben, behandelt und dann in mit Deckeln versehene Reagenzgläser (150x 50 mm) gegeben. In jedes Gläschen wurden ungefähr 2,Ox 10⁵ Zellen In 2 ml Medium gegeben und dann wurde der Inhalt bei 37° C bei einer Neigung des Gläschens von etwa 10° Inkubiert.

An den Abdeckplatten wurde 24 bis 48 Stunden nach dem Impfen eine zusammenhängende Schicht von Zellen gebildet. Das Medium enthielt 77,5% Eagle's Basal Medium, das wie in Beispiel 1 angegeben, modifiziert worden war, 10% Rinderserum, 10% Peptenmedlum in Phosphatpuffer und 2,5% einer 4,4%lgen Natrlumblcarbonatlösung.

Zu den In dem obigen Medium enthaltenen Zellen wurden 0,25 ml des verdünnten Infektlösen Katzen-Enterltls-Virus hinzugefügt.

Die Gefäße, die in einem Winkel von ungefähr 10° aufgestellt waren, wurden bei einer Temperatur von 37⁰C Inkubiert.

Der Virus verursacht erkennbare Veränderungen im Zellkern, die mit Haematoxylin und Eosin sichtbar gemacht wurden. Ungefähr 18 Stunden nach der Infektion nahmen die infizierten Zellkerne (ungefähr 1 bis 2% (Ό der gesamten Zellkerne) mehr Haematoxylin auf als die nicht-lnflzlerten Zellkerne. In den nächsten 6 Stunden kam es zu einer Erweiterung der Nucleoll, wobei sich der andere Kerngehalt homogen dunkel färbte und sich eine klare Zone um den Nucleolus bzw. die Nucleoll und eine andere klare Zone unmittelbar Innerhalb der Kernmembrane bildete. Während der nächsten 24 Stunden schrumpfen die Infizierten Zellen und färbten sich zumeist schwarz, bevor sie sich vom Deckel des Gläschens ablösen. Ungefähr 5 bis 10% von allen Zellkernen zeigten während der ersten zwei Tage nach der Inkubation die oben angegebene Veränderungen.

Ähnliche Versuche wurden mit allen anderen In Beispiel 2 aufgezählten Zellstämmen durchgeführt. Das Viruswachstum war bei allen Zellstämmen zufriedenstellend.

Beispiel 4

Zusammenhängende Schichten von Zellen, die von ganzen Embryos erhalten wurden, wurden In Teströhren, wie in Beispiel 2 beschrieben, hergestellt. Eine Probe von Augen- oder Nasenexudat einer an Katzen-Rhlnotras cheitis erkrankten Katze wurde mit 2,0 ml phosphatgepufferter Salzlösung, die außerdem noch 200 Einheiten Penicillin und 100 mg Streptomycin pro ml enthielt, wie In Beispiel 1 angegeben, gemischt.

Das Nährmedium wurde von der Zellstamm-Monoschlcht in fünf getrennte Gefäße entfernt, durch Exudat-Puffergemlsch ersetzt und bei 37° C 2 Stunden Inkubiert. Das Exudat-Puffergemisch wurde dann entfernt und die Zellen mit frischer, steriler Pufferlösung gewaschen. Die infizierten Gefäße, die jeweils 1,5 ml frisches Nährmedium enthielten, wurden dann bei 37⁰C in 1,5 ml frischem Nährmedium bebrütet.

Es folgte eine tägliche, mikroskopische Prüfung der infizierten Kulturen und der Kontrollkulturen, die mit steriler Salzlösung, anstelle des Exudat-Puffergemischs, hergestellt worden waren.

Während einiger Tage blieb das mikroskopische Erscheinungsbild der Zellkerne in den Kontrollbehältern normal. Bei den infizierten Gefäßen erschienen Flächen abnormaler Zellen innerhalb von 48 Stunden. Diese Flächen, die in getrennter Form über die Zellschicht verteilt waren, bestanden aus runden Zellen, die eine erhöhte Lichtbrechung aufwiesen.

Die Flächen der betroffenen Zellen waren zu Beginn klar gegenüber den umgebenen Zellen mit normalem Erscheinungsbild abgegrenzt. Mit fortschreitender Infektion wurden die abnormalen Zellen größer und zahlreicher, bis ab 4. bis 6. Tag die gesamte Zellschicht betroffen war. In den letzten Infektionsstufen lösten sich einige Zellen vom Glas, wobei sie Lücken in der Zellschicht zurückließen. Die Zellschicht zeigte ein mit dem bloßen Auge sichtbares wolkiges Aussehen. Verschiedene Untersuchungen, die mit der Flüssigkeit und/oder den Zellen der infizierten Gefäße durchgeführt wurden, zeigten, daß diese Zellveränderungen durch den Katzen-Rhinotracheitis-Virus verursacht worden sind. Die Infizierten Kulturen waren frei von anderen Mikroorganismen. Der Virus konnte in Reihe auf frische Kulturen des gleichen Zellstamms übertragen werden, In denen es dann zu ähnlichen Zellveränderungen kam. Geeignete Verdünnungsversuche zeigten weiter, daß die Vermehrung des Virus stattgefunden hatte.

Beispiel 5

Ein weiterer Versuch wurde nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren durchgeführt, wobei jedoch ein Zellstamm verwendet wurde, der aus Katzenembryolungengewebe erhalten wurde. Der Katzen-Enterltls-Vlrus wächst auch auf diesen Zellstämmen gut. Es wurden ähnliche Ergebnisse wie In Beispiel 4 erhalten.

•'s Beispiel 6

Zusammenhängende Schichten von Zellstämmen wurden In Versuchsgefäßen, wie In Beispiel 1 beschrieben, erhalten. Eine Probe von Nasen- oder Augenexudat einer Katze, die an Katzeninfluenza erkrankt war, wodurch man den Katzen-Plcorna-Virus erhielt, wurde mit 2,0 ml phosphatgepufferter Salzlösung, die auch noch 200 Einheiten Penicillin und 100 μg Streptomycin pro ml enthielt, wie In Beispiel 1 angegeben, gemischt.

Das Nährmedium wurde von der Zellstamm-Monoschlcht entfernt und durch Exudat/Puffergemisch ersetzt und bei 37° C 2 Stunden bebrütet. Das Exudat/Puffergemisch wurde dann entfernt und die Zellen mit frischer, steriler Pufferlösung gewaschen. Die Infizierte Zellstamm wurde dann bei 37° C In 1,5 ml frischen Nährmedium bebrütet.

Die infizierte Kultur und eine Kontrollkultur, die mit steriler Salzlösung anstelle des Exudat/Puffergemlschs hergestellt worden war, wurde täglich mikroskopisch überprüft. Die nach 2- bis 7täglger Inkubation feststellbare Zelldegenerlerung war der durch Humanplcorna-Vlren, beispielsweise dem Pollomyelltls-Vlrus, hergestellten nicht unähnlich. Die Viren konnten durch Reihenpassagen in Kulturen der Zellstämme übertragen werden und geeignete-Verdünnungsversuche zeigten, daß die Vermehrung der Viren in dem Zellstamm stattgefunden hatte.

so Weitere Untersuchungen zeigten, daß die so durch Reihenpassagen erhaltenen Kulturen frei von Verunreinigungen durch andere Mikroorganismen waren.

Beispiel 7

Der Virus von infektiöser Katzen-Enterltls wurde sowohl von der Milz als auch vom Dünndarm von infizierten Katzen am Höhepunkt der Erkrankung entnommen und in Kulturen eines Katzenembryolungen-Zellstamms geimpft. Zur Untersuchung von Veränderungen Innerhalb des Zellkerns wurden die Kulturen mit Haematoxylln und Eosin gefärbt. Drei bis fünf Tage nach der Infektion der Kulturen wurden die infizierten Kulturen bei -30° C eingefroren. .

Der eingefrorene, bei -30° C gelagerte Virus wurde später aufgetaut und in nlcht-inflzlerte Kulturen von Katzenembryo-Zellstämme geimpft. Nach angemessener Zelt, die durch das Vorhandensein von Veränderungen innerhalb des Kerns beurteilt wurde, wurden die infizierten Kulturen der Zellstämme erneut bei -30° C eingefroren und bis zur nächsten Passage gelagert.
Bei Passagen mit dem Virus In Katzenembryo-Zellstämmen wurde üblicherweise der Virus gleichzeitig mit den Zellen und dem Nährmedium in das Kultivierungsgefäß gegeben. Die Kultur von Embryo-Zellstämmen, die den Virus Inoculum enthielten, wurden bei 37° C bebrütet.

Der Virusstamm, bei dem eine Abschwächung für Katzen verlangt wird, wurde In Reihenpassagen, wie oben beschrieben, achtmal In Katzenembryolungen-Zellstämmen und dann fünfmal In Stämmen, die aus ganzen

Katzenembryos erhalten wurden, hergestellt. Ein anderer Virusstamm durchlief zwei Passagen mehr In den von den ganzen Katzenembryos erhaltenen Stämmen. Eine weitere Probe durchlief jedoch nur eine Passage In einem Katzen-Gesamtembryo-Zellstamm mit nachfolgenden zwei oder drei Passagen In Katzenembryolungen-Zellstämmen.

Die 8. Passage des abgeschwächten Stamms von Infektiösen Katzen-Enterltls-Virus wurde auf Unschädlichkeit bei zwei 4 Monate alten Katzen geprüft. Jede Katze wurde subkutan mit 1,0 ml Vlrus-inflzlerter Gewebekulturflüssigkeit und Zellen injiziert, was 200 Gewebekultur-Ansteckungsdosen entsprach. Keine der Katzen zeigte Irgendeine klinische Erkrankung, obgleich die Gesamtmenge der umlaufenden Leucocyten vom 3. bis 9. Tag herabgesetzt wurde. Den Katzen wurden täglich rectale Abstriche vom 2. bis zum 9. Tag nach der Impfung entnommen. Mit diesen Abstrichen geimpfte Gewebekulturen zeigten kein Auftreten von Viren. ' ip

Am 21. Tag wurden diese beiden Katzen, zusammen mit zwei nlcht-gelmpften Kontrollkatzen gleichen Alters oral mit 1,0 ml einer 10%igen Suspension von Leber und Milz In 1096 Pferdeserum-Nährbrühe provoziert. Leber und Milz stammten von einer an Katzen-Enteritis verstorbenen Katze. Die geimpften Katzen blieben während der gesamten Provokationszeit klinisch normal. Die nlcht-gelmpften Kontrollkatzen bekamen jedoch am 5. Tag nach der Provokation Fieber, verloren Körpergewicht, wurden matt, und deutlich leukopenisch.

Geometrisches Mittel der Leucocytenzählungen (X 10³)

ς ή 7 8 ο in

Den Katzen wurde vor der Impfung und vor und nach der Provokation Blut entnommen und das Serum hinsichtlich neutralisierender Antikörper geprüft.

Serum neutralisierender Antikörper

Tage	1	8,8	2	3	9,7	4	5	6	7	6,1	8	9	6,7	10
nach dem Impfen		11,2		6,8	4,5	6,0		5,8		10,1
nach der Provokation	19,3		10,7				12,3		12,1
geimpfte Katzen	10,6	10,1	4,9	9,3	8,2	8,4	4,3	8,4	6,5	-
nicht geimpfte Katzen	11,7	6,6	4,6	3,8	5,3	_

Katzennummer	vor der Impfung	vor der Provokation	nach der Provokation
geimpft
233	<2*)	640	640
234	<2	640	2560 ₄₀
nicht geimpft
. 235	NT	2	640
236	NT	2	640 _4S
*) entsprechend der Serumverdünnung NT= nicht geprüft

Die 15. Passage dieses abgeschwächten Stamms von Infektiösem Katzen-Enterltis-Vlrus wurde bei Katzen hinsichtlich Unschädlichkeit und antlgener Wirkung und Infektionswirkung bei nlcht-gelmpften In-Kontakt-Katzen geprüft. Der Virus wurde In dem Katzenembryozellstamm gezüchtet und die Katzen subkutan mit 1,0 ml Vakzine geimpft. Der Versuch wurde in zwei Teilen (A und B) durchgeführt.

A. Zuerst wurde eine 4 Monate alte Katze mit 1,6 χ 10⁵ Gewebekultur Infektlösen Dosis des Virus vakziniert. Die Katze blieb gesund und es trat keine Erscheinungsform von Leukopenle oder Pyrexle auf, und es wurde In den Faeces während der ersten 15 Tage des Versuchs kein Virus gefunden. Zwei vier Monate alte Katzen und vier drei Monate alte Katzen wurden mit den vakzinierten Katzen In Kontakt gebracht. Keine dieser Katzen zeigte Irgendein Anzeichen von Krankheit, Leukopenle oder Pyrexle.

B. Im zweiten Teil des Versuchs wurden sechs 6 bis 7 Monate alte Katzen mit einer 1,6 χ 10³ Gewebekultur Infektlösen Dosis des Virus vakziniert. Diese Katzen blieben ebenso gesund.

Den In den obigen Versuchen verwendeten Tieren wurde unmittelbar vor der Vakzinierung und drei Wochen später Blut entnommen. Die Seren wurden hinsichtlich neutralisierender Antikörper geprüft. ·

Serum neutralisierender Antikörper Katzennummer

vor dem Vakzinieren

drei Wochen nach dem Vakzinieren

A. geimpft 238

nicht geimpft in Kontakt 237 239 240 241 243 244

B. geimpft 223 224 225 226 228 229 230

<5 <5 <5 <5 <5 <5 <5

1000

<5 <5 <5 <5 <5 <5

100 1000 1000 1000 1000 1000 10 000

Be! einem anderen Versuch wurden drei 3 Monate alte Katzen subcutan vakziniert mit 1,0 ml Virus der 18. Passage bei Züchtung in einem Katzenembryolungen-Zellstamm. Diese Virusmenge entspricht einer l,6xl0⁵ Gewebekultur Infektlösen Dosis. Diese Katzen blieben, zusammen mit zwei nlchtgelmpften In Kontakt befindlichen Katzen des gleichen Alters, gesund und zeigten kein Auftreten von Leukopenle oder Pyrexle.

Serumproben wurden von vakzinierten Katzen unmittelbar vor dem Impfen und 11 und 20 Tage später genommen. Den nlcht-gelmpften In Kontakt befindlichen Katzen wurde zur gleichen Zeit Blut entnommen. Die gesamten Seren wurden hinsichtlich neutralisierender Antikörper geprüft.

vor der Vakzinierung

nach dem Vakzinieren

11 Tage 22 Tage

vakzinierte Katzen

247 250 252

nicht geimpfte in Kontakt-Katzen 251 254

100	>	10 000
10 000	>	10 000
> 10 000	>	10 000
10		<10
10		<10

Daraus 1st zu schließen, daß dieser Stamm von Infektiöser Katzen-Enteritis (Panleucopoenla)-Virus, gezüchtet und nach Passagen In Katzenembryo-Zellstämmen, antigen 1st, In Katzen die Bildung homologer, neutralisierender Antikörper stimuliert und nicht von vakzinierten Katzen auf mit diesen In Kontakt stehenden empfänglichen Katzen übertragen wird.

65 Beispiele

Behälter, die jeweils 12 bis 15 χ 10⁶ Zellen In 100 ml Nährmedien, wie In Beispiel 7 beschrieben, enthielten, wurden bei 37° C 24 Stunden Inkubiert. Die zusammenhängenden Zellschichten wurden einmal mit phosphatge-

pufferten, auf 37° C vorgewärmter Salzlösung gewaschen und mit 10 ml unverdünnter infektiöser Katzen-Enter-Itis-Virus-Suspension geimpft, die von der 15. bis 18. Gewebekultur-Passagenstufe, wie in Beispiel-7 beschrieben, erhalten wurde und eine 1,6 χ 10⁶ Gewebekultur infektlösen Dosis (TCID) des Virus entsprach.

ml des Mediums S. M. 199 (vgl. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1950, 73, Seite 6), das außerdem noch 0,5 ml
einer 4,5%lgen Lösung von Natrlumblcarbonat mit den üblichen Penicillin- und Streptomyclnmengen enthielt, 5 wurde der Kultur zugegeben und das Gemisch bei 37° C 72 Stunden inkubiert.

Die Kultur wurde dann schnell gefroren und dreimal aufgetaut und, wie in Beispiel 7 beschrieben, verwendet
und geprüft. Es wurden zufriedenstellende Ergebnisse erhalten.

Falls nötig kann die Gefrler-Auftau-Zubereitung erneut gefroren und bei -65° C gelagert werden.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung eines für die Züchtung von infektiösen Katzen-Enteritisviren, Katzen-Rhinotracheitisviren und Katzen-Picornavlren geeigneten Zellstammes, dadurch'gekennzeichnet, daß Katzenembryogewebe disaggregiert und dann auf bekannte Weise durch Reihenpassagen in einem Nährmedium kultiviert wird, solange ein Im wesentlichen diploider, fibroplastischer Zellstamm erhalten bleibt.

2. Verwendung des nach Anspruch 1 erhaltenen Zellstammes zur Züchtung von Katzen-Enteritisviren, Katzen-Rhinotracheitisviren und Katzen-Picornaviren.